壯藥火索藤湯劑指紋圖譜的建立及含量測(cè)定研究

羅鑫，陳彥潔，蔣學(xué)青，蘇芳林，王志萍*，謝譚芳*，陳豪（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200；2.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530200）

火索藤（BauhiniaaureaLevl.）亦稱為牛蹄藤[1-3]、金毛羊蹄甲[4]、金葉羊蹄甲[5]、紅絨毛羊蹄甲[6]、合掌風(fēng)、黃麻藤、紅毛藤，為豆科植物金毛羊蹄甲的根或莖，分布于廣西、四川、貴州、云南等地。作為壯族民間用藥的一種，其葉、藤和根均可供藥用，化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要有黃酮類、甾體類、芳香酸類等化合物，具有補(bǔ)腎澀精、祛風(fēng)濕、活血止痛等作用[7-9]。由于火索藤藥材基原地分布不均、藥效成分和量效關(guān)系相關(guān)研究較少、《中國(guó)藥典》歷版無(wú)其收錄等原因，目前學(xué)界尚未對(duì)火索藤進(jìn)行系統(tǒng)研究。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外圍繞中藥湯劑進(jìn)行了大量研究，為火索藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑及后續(xù)中藥配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)制訂提供了可借鑒的研究思路[10-24]，其中通過HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量分析是目前較為成熟且可行的研究路徑。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上建立壯藥火索藤湯劑樣品的HPLC指紋圖譜，結(jié)合聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小乘法-判別分析（OPLS-DA）等對(duì)各批次湯劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)金絲桃苷、槲皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，明確不同批次湯劑之間的含量差異，為其制劑的開發(fā)和研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C高效液相色譜儀（島津公司）；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；QUINTIX125D-1CN型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯）；YTLG-10冷凍干燥機(jī)（上海葉拓科技有限公司）；PL-FS40T康士潔超聲波清洗機(jī)（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

1.2 試藥

磷酸[色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司]；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó) Fisher 公司）；甲醇、乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

金絲桃苷對(duì)照品（純度：98.4%，批號(hào)：MUST-22071210）、槲皮苷對(duì)照品（純度：98.6%，批號(hào)：MUST-22112917）（成都曼思特生物科技有限公司）。10批火索藤藥材分別從廣西壯族自治區(qū)北流市、梧州市、南寧市等地采購(gòu)所得，藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為豆科植物火索藤BauhiniaaureaLevl.的藤莖和葉，藥材產(chǎn)地信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～40 min，2%～6%A；40～60 min，6%～9%A；60～65 min，9%～10%A；65～80 min，10%～12%A；80～85 min，12%～12.5%A；85～95 min，12.5%～13%A；95～118 min，13%～16%A；118～130 min，16%～14%A；130～133 min，14%～8%A；133～136 min，8%～2%A；136～140 min，2%A）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制

取金絲桃苷、槲皮苷對(duì)照品各適量，精密稱定，70%甲醇定容，再分別精密吸取各對(duì)照品溶液2 mL置于10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇稀釋定容制成質(zhì)量濃度分別為87.7、84.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

依照中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝參數(shù)方法[24]，取火索藤藥材約100 g（莖∶葉＝9∶1），精密稱定，加8倍量水浸泡30 min，第一次煎煮30 min，趁熱200目篩網(wǎng)濾過，殘?jiān)?倍量水，第二次煎20 min，趁熱200目篩網(wǎng)濾過，合并兩次濾液，濃縮至500 mL，冷凍干燥成粉末。取粉末約0.2 g（過二號(hào)篩），精密稱定，置于25 mL具塞錐形瓶，加70%甲醇10 mL，超聲提取50 min（功率250 W，頻率40 kHz），補(bǔ)足重量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 火索藤湯劑HPLC指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液（S2），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別進(jìn)行測(cè)定。以12號(hào)峰槲皮苷作為參照峰（S）計(jì)算各共有峰得相對(duì)保留時(shí)間RSD值＜0.30%，相對(duì)峰面積RSD值＜2.7%（n＝6），結(jié)果RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批湯劑凍干粉（S2）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分析，以12號(hào)峰槲皮苷作為參照峰（S）計(jì)算得各共有得峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值＜0.60%，相對(duì)峰面積RSD值＜2.9%（n＝6），結(jié)果均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S2），室溫分別放置0、3、6、9、12、24 h，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分析，以12號(hào)峰槲皮苷作為參照峰（S）計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值＜0.90%，相對(duì)峰面積RSD值＜2.9%（n＝6），結(jié)果RSD均小于3.0%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.4.4 火索藤湯劑指紋圖譜的建立和共有峰標(biāo)識(shí) 取10批火索藤藥材，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”中，S1為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正，生成疊加共有峰圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜R（見圖1），確定了12個(gè)共有峰，通過與混合對(duì)照品色譜圖進(jìn)行比對(duì)（見圖2），識(shí)別出2個(gè)成分，其中9號(hào)峰為金絲桃苷、12號(hào)峰為槲皮苷。

圖1 火索藤湯劑疊加共有峰圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜RFig 1 Huosuoteng decoction superposition common peak and control R

圖2 混合對(duì)照品的HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference

2.5 相似度評(píng)價(jià)

在“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”中對(duì)10批火索藤湯劑指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果S1～S10批湯劑樣品的相似度結(jié)果均大于0.91，表明不同批次的火索藤藥材質(zhì)量較為穩(wěn)定，詳見表2。

表2 10批火索藤湯劑樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation of 10 batches of Huosuoteng decoction

以12號(hào)峰槲皮苷作為參照峰（S）計(jì)算各共有得峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值和相對(duì)峰面積RSD值，結(jié)果12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.10%～0.50%，相對(duì)峰面積RSD值為34%～119%（n＝10），這表明不同批次的火索藤湯劑化學(xué)成分種類均一，但含量差異較大，可能是由于不同產(chǎn)地不同生長(zhǎng)環(huán)境所致。

2.6 聚類分析

以12個(gè)共有特征峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 25.0軟件中，采用組間聯(lián)接-平方歐氏距離法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖3所示，10批壯藥火索藤湯劑可聚為3類，S1、S2、S3、S6、S9聚為一類，S4、S5為第二類，S7、S8、S10為第三類，說明不同批次的火索藤湯劑化學(xué)成分質(zhì)量存在一定差異。

圖3 不同批次壯藥火索藤湯劑聚類分析Fig 3 Cluster analysis of different batches of Huosuoteng decoction

2.7 主成分分析

以12個(gè)共有特征峰的峰面積為變量，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果見表3，共提取出4個(gè)主成分，特征值分別為4.26、3.34、1.45、1.18，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.27%，表明這4個(gè)主成分含有湯劑樣品指紋圖譜的主要信息，可反映不同產(chǎn)地不同批次火索藤湯劑樣品的整體質(zhì)量。

表3 主成分總方差解釋Tab 3 Principal component total variance interpretation

再將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的12個(gè)共有特征峰的峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMAC 14.1軟件中，進(jìn)行主成分分析，生成主成分得分圖見圖4，可知，樣品共聚為3類，S1、S2、S3、S6、S9聚為一類，S4、S5為第二類，S7、S8、S10為第三類，其結(jié)果同聚類分析一致。

圖4 10批火索藤湯劑樣品主成分分析得分圖Fig 4 PCA score of 10 batches of Huosuoteng decoction

2.8 OPLS-DA

以12個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SIMAC 14.1軟件，進(jìn)行OPLS-DA分析，得到分散點(diǎn)圖（見圖5）。并對(duì)模型進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)。結(jié)果，R2X、R2Y及Q2分別為0.62、0.80、0.67，均大于0.6，這表明建立的模型預(yù)測(cè)能力較好。置換檢驗(yàn)顯示模型無(wú)過擬合現(xiàn)象，說明模型結(jié)果真實(shí)可靠。此外，由圖5可知，10批樣品被分為3類，與聚類分析、主成分分析結(jié)果一致。

圖5 火索藤湯劑樣品OPLS-DA得分圖Fig 5 OPLS-DA score of Huosuoteng decoction

其次，為明確火索藤湯劑樣品質(zhì)量具有顯著影響的成分，進(jìn)一步通過SIMAC 14.1軟件，在OPLS-DA分析基礎(chǔ)上進(jìn)行變量投影重要度（VIP）分析，以VIP＞0.95為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共篩選出8個(gè)成分，分別為峰6、峰2、峰11、峰8、峰10、峰4、峰12（槲皮苷）、峰9（金絲桃苷），見圖6。表明這8個(gè)成分可能是不同批次火索藤湯劑樣品質(zhì)量差異的主要因素。

圖6 火索藤湯劑樣品OPLS-DA-VIP圖Fig 6 OPLS-DA-VIP diagram of Huosuoteng decoction

2.9 壯藥火索藤湯劑中2個(gè)差異成分的含量測(cè)定

2.9.1 混合對(duì)照品溶液的配制 分別取金絲桃苷、槲皮苷對(duì)照品適量，70%甲醇定容，制成對(duì)照品溶液，精密吸取上述溶液各2 mL置于10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇定容制成為43.89、43.11 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.9.2 線性關(guān)系考察 取金絲桃苷、槲皮苷對(duì)照品適量，70%甲醇定容，制成每1 mL含金絲桃苷175.36 μg、槲皮苷169.13 μg的混合對(duì)照品母液，再逐級(jí)稀釋，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果金絲桃苷和槲皮苷線性回歸方程分別為Y＝1.48×104X-1.00×104，R2＝0.9999及Y＝1.44×104X-8.23×103，R2＝0.9999，說明金絲桃苷質(zhì)量濃度在0.7015～175.366 μg·mL-1，槲皮苷質(zhì)量濃度在0.6766～169.1380 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.9.3 精密度考察 取“2.9.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)檢測(cè)6次，記錄各成分峰面積。結(jié)果金絲桃苷和槲皮苷峰面積的RSD值均為0.1%，這表明儀器的精密度良好。

2.9.4 穩(wěn)定性考察 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液（S2），室溫放置0、3、6、9、12、24 h，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄各成分峰面積。結(jié)果金絲桃苷和槲皮苷峰面積的RSD值分別為2.7%、2.2%，均小于＜3%，這表明24 h內(nèi)火索藤湯劑樣品穩(wěn)定性良好。

2.9.5 重復(fù)性考察 精密稱定火索藤湯劑樣品6份（S2），按照“2.3”項(xiàng)下制備方法，平行制備6份，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄各成分峰面積，依照回歸方程計(jì)算各成分含量，結(jié)果金絲桃苷和槲皮苷的平均含量分別為0.50、1.79 mg·g-1，RSD值分別為2.9%、2.6%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.9.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量火索藤湯劑凍干粉約0.2 g，按照1∶1加入金絲桃苷和槲皮苷峰對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下制備方法，平行制備供試品溶液6份，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄各成分峰面積，計(jì)算各成分加樣回收率，結(jié)果顯示金絲桃苷的加樣回收率均值為91.91%，RSD值為2.4%；槲皮苷加樣回收率均值為96.72%，RSD值為1.8%，兩者結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》2020年版四部通則9101的具體規(guī)定，證明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.9.7 不同批次火索藤湯劑中金絲桃苷與槲皮苷的含量測(cè)定 取10批不同產(chǎn)地批次的火索藤藥材，按照“2.3”項(xiàng)下方法，制備成各供試品溶液（n＝2），依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，采用外標(biāo)法計(jì)算壯藥火索藤湯劑中金絲桃苷和槲皮苷的含量，取平均值，結(jié)果見表4。10批火索藤湯劑中金絲桃苷含量范圍為0.1520～0.6669 mg·g-1，槲皮苷含量范圍為1.7108～6.5276 mg·g-1。

表4 10批火索藤湯劑中含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1)Tab 4 Content determination of 10 batches of Huosuoteng decoction (mg·g-1)

3 討論

3.1 供試品制備方式的考察

通過比對(duì)純湯劑樣品和粉末進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)，湯劑樣品在經(jīng)過處理后所得圖譜信息更為完整、穩(wěn)定。故本試驗(yàn)考察了不同提取方式（超聲、回流）確定以超聲為提取方式，同時(shí)對(duì)不同提取溶劑（水、甲醇、乙醇）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）進(jìn)行考察，確定了以70%甲醇10 mL超聲提取50 min（功率250 W，頻率40 kHz）的樣品制備方式。

3.2 指紋圖譜的建立及成分分析

通過對(duì)不同批次火索藤湯劑進(jìn)行分析，確定了12個(gè)共有峰，與對(duì)照?qǐng)D譜比對(duì)其相似度均大于0.91，表明各批次火索藤藥材所制湯劑質(zhì)量一致性較好，其后的聚類分析、主成分分析等結(jié)果顯示這10個(gè)批次可分為3類，最后基于OPLSDA分析的VIP指認(rèn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了對(duì)這10批次藥材制的樣品間差異影響最大的8個(gè)成分，并根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，選取活性成分金絲桃苷與槲皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，以成分含量判斷S4、S5批次兩地區(qū)火索藤藥材所制湯劑中金絲桃苷與槲皮苷含量均優(yōu)于其他地區(qū)。

綜上，本研究成功建立了壯藥火索藤湯劑的HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析篩選出8個(gè)主要差異性成分，并對(duì)其中2個(gè)成分的含量進(jìn)行研究，用以評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量，可為該藥材湯劑質(zhì)量控制和研究提供一定的參考。