高效液相色譜法測(cè)定醋酸氟卡尼片的含量

徐碩，鄺詠梅，徐文峰，金鵬飛（北京醫(yī)院藥學(xué)部，國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京市藥物臨床風(fēng)險(xiǎn)與個(gè)體化應(yīng)用評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京醫(yī)院），北京 100730）

氟卡尼是鈉通道阻滯藥，屬于Ⅰc類抗心律失常藥。醋酸氟卡尼片主要用于治療室性心律失常，包括室性期前收縮及室性心動(dòng)過(guò)速、室上性期前收縮、室上性心動(dòng)過(guò)速、心房撲動(dòng)、心房顫動(dòng)、預(yù)激綜合征合并室上性心動(dòng)過(guò)速等[1-4]。醋酸氟卡尼片收載于《美國(guó)藥典》[5]和《日本藥典》[6]。目前，該藥還沒(méi)有在我國(guó)上市，也未在《中國(guó)藥典》中收載。關(guān)于醋酸氟卡尼片的研究主要集中在藥理作用，其含量測(cè)定方面的研究報(bào)道非常有限，僅有一篇早期的報(bào)道[7]，采用HPLC法和紫外分光光度法進(jìn)行定量。利用HPLC法是通過(guò)內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，溶液配制操作復(fù)雜。文獻(xiàn)報(bào)道以及《日本藥典》收載的以紫外分光光度法測(cè)定醋酸氟卡尼含量，其專屬性相對(duì)較差，《美國(guó)藥典》中是采用HPLC法，流動(dòng)相為高濃度緩沖鹽溶液，梯度洗脫，該方法于2019年進(jìn)行修訂并沿用至今。而在此之前《美國(guó)藥典》[8]中收錄的方法為采用C8分析柱，并且用四相混合溶液的復(fù)雜流動(dòng)相體系，不利于色譜柱和液相系統(tǒng)的長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行。因此，有必要建立一種普適性強(qiáng)并且快速簡(jiǎn)便的方法，用于醋酸氟卡尼片中醋酸氟卡尼的定量分析。本研究通過(guò)HPLC技術(shù)，建立了醋酸氟卡尼片的含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可為該藥品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀 [Agilent 1260型，包括四元梯度泵（G1311C），自動(dòng)進(jìn)樣器（G1329B），柱溫箱（G1316A），二極管陣列檢測(cè)器（DAD）（G4212B），色譜工作站（LC OpenLAB），美國(guó)Agilent Technologies有限公司]；電子分析天平（XP-205型，精度：十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler Toledo集團(tuán)）；SPX-250 IC微電腦人工氣候箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300DB型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈、磷酸（Thermo Fisher Scientific有限公司產(chǎn)品，色譜純，批號(hào)分別為192855、158625）；磷酸二氫銨、冰醋酸、鹽酸、30%過(guò)氧化氫（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純），氫氧化鈉（北京化工廠，分析純）；水為二級(jí)實(shí)驗(yàn)用水。醋酸氟卡尼對(duì)照品 [批號(hào)：G0K124，純度：99.7%，USP]；醋酸氟卡尼片（規(guī)格：含醋酸氟卡尼100 mg/片，批號(hào)：GUL050A、GUD052B、GTB072E，英國(guó)Inova Pharmaceuticals公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱采用Alltima C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調(diào)至pH 3.0）（35∶65）；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取醋酸氟卡尼對(duì)照品適量，置于500 mL量瓶中，加入2%冰醋酸溶液40 mL，超聲使其溶解，再加入流動(dòng)相稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度約為2 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5、4、5、6、7.5 mL，置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得5個(gè)不同濃度的線性系列溶液（質(zhì)量濃度分別為196.0、313.6、392、470.4、588.0 μg·mL-1）。將中間濃度的溶液（392 μg·mL-1）作為標(biāo)準(zhǔn)工作液，用作方法的系統(tǒng)適用性考察。

2.3 供試品溶液的配制

取醋酸氟卡尼片20片，精密稱定，將其置于乳缽中研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于醋酸氟卡尼100 mg的樣品（約為0.26 g），置于250 mL量瓶中，加入2%冰醋酸溶液20 mL，超聲提取（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，再加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的配制

依據(jù)醋酸氟卡尼片藥品說(shuō)明書(shū)提供的配方制得的不含醋酸氟卡尼的粉末作為陰性樣品。精密稱定該粉末適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，即得陰性樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性、線性關(guān)系考察、檢測(cè)限和定量限

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)工作液連續(xù)進(jìn)樣6次，醋酸氟卡尼色譜峰的平均理論塔板數(shù)為（4839.3±10.3）（n＝6）。精密吸取“2.2”項(xiàng)下5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄醋酸氟卡尼峰面積，以該成分的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為：Y＝3.549X＋3.566，r＝1.000，醋酸氟卡尼在196.0～588.0 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

取質(zhì)量濃度為196.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，加入流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，以低濃度對(duì)照品信噪比約為3.0和10.0時(shí)的濃度分別作為檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果醋酸氟卡尼的LOD為0.061 μg·mL-1，LOQ為0.196 μg·mL-1。

2.6 專屬性試驗(yàn)

2.6.1 基質(zhì)干擾試驗(yàn) 精密吸取上述陰性樣品溶液、醋酸氟卡尼對(duì)照品溶液以及供試品溶液各10μL，進(jìn)樣分析，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品中的輔料不干擾醋酸氟卡尼的測(cè)定（見(jiàn)圖1）。

圖1 陰性樣品溶液（A）、對(duì)照品溶液（B）和供試品溶液（C）的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of negative sample solution（A），reference substance solution（B）and sample solution（C）

2.6.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察方法的專屬性，對(duì)供試品進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)，參照國(guó)際通行的人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）方法學(xué)驗(yàn)證原則進(jìn)行[9-10]?？疾斓臈l件包括酸化、堿化、光照、氧化和高溫。取醋酸氟卡尼片（批號(hào)：GUL050A）樣品粉末，精密稱定5份，每份約為0.26 g（約相當(dāng)于醋酸氟卡尼100 mg），置于250 mL量瓶中，進(jìn)行處理如下：

① 酸降解：分別配制濃度為1 mol·L-1的鹽酸溶液和1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，量取1 mol·L-1的鹽酸溶液2 mL加入樣品中，置于室溫條件下放置6 h后，加入1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，使其中和至中性，依照“2.3”項(xiàng)下方法操作，制得供試品溶液。② 堿降解：量取2 mL 1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液加入樣品中，置于室溫條件下放置6 h后，加入1 mol·L-1的鹽酸溶液，使其中和至中性，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，制得供試品溶液。③ 光降解：將樣品放入微電腦人工氣候箱中，光照強(qiáng)度設(shè)置為10 000 lx，在該條件下照射6 h，依照“2.3”項(xiàng)下方法操作，制得供試品溶液。④ 氧化降解：在樣品中加30%過(guò)氧化氫溶液2 mL，室溫下放置6 h，依照“2.3”項(xiàng)下方法操作，制得供試品溶液。⑤ 高溫降解：將樣品放入烘箱中，80℃加熱6 h，取出，待其冷卻到室溫后，依照“2.3”項(xiàng)下方法操作，制得供試品溶液。

將上述溶液各進(jìn)樣10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：與未經(jīng)過(guò)強(qiáng)制降解試驗(yàn)的樣品比較，醋酸氟卡尼在高溫條件較為穩(wěn)定，未發(fā)生降解；在光照、堿化、酸化及氧化條件下有所降解，色譜峰峰面積略有降低，氧化條件下降解較為明顯，可見(jiàn)降解產(chǎn)物色譜峰，但對(duì)醋酸氟卡尼的定量分析不會(huì)造成干擾（見(jiàn)圖2）。

圖2 醋酸氟卡尼片樣品強(qiáng)制降解試驗(yàn)HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of forced degradation test for flecainide acetate tablets samples

2.7 精密度試驗(yàn)

取批號(hào)為GUL050A的醋酸氟卡尼片制得的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，結(jié)果醋酸氟卡尼色譜峰峰面積的RSD值為0.14%（n＝6），表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取批號(hào)為GUL050A的醋酸氟卡尼片樣品6份，每份約為0.26 g，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，制得供試品溶液，進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果醋酸氟卡尼的平均含量為98.15%，RSD值為0.53%（n＝6），表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為GUL050A的供試品溶液，置于室溫條件下，分別在配制后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積值，計(jì)算醋酸氟卡尼色譜峰峰面積的RSD值為0.49%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

取批號(hào)為GUL050A的樣品，研細(xì)，精密稱取粉末9份，每份約為0.13 g，分別精密加入“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液20、25、30 mL，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備，每個(gè)濃度制備3份樣品，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果如表1所示。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Recovery test

2.11 耐用性考察

分別采用Alltima C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Shimadzu C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）、Waters C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示不同品牌色譜柱對(duì)醋酸氟卡尼的保留時(shí)間、峰形無(wú)影響。改變色譜條件中的柱溫（30±2）℃，結(jié)果顯示醋酸氟卡尼保留時(shí)間基本不變，RSD為0.63%。改變色譜條件中的流速[（1.0±0.2）mL·min-1]，醋酸氟卡尼的保留時(shí)間分別為4.0、4.9、6.1 min。結(jié)果表明本方法的HPLC條件耐用性良好，色譜參數(shù)的微調(diào)不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

2.12 樣品含量測(cè)定

采用已建立的方法測(cè)定了3批醋酸氟卡尼片，每批樣品精密稱取2份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算醋酸氟卡尼含量，取平均值作為含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 樣品中醋酸氟卡尼的含量Tab 2 Content of flecainide acetate in samples

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

設(shè)定醋酸氟卡尼的檢測(cè)波長(zhǎng)是根據(jù)其在流動(dòng)相中的紫外吸收譜圖，譜圖顯示該成分的最大吸收為204 nm和300 nm，將300 nm選定為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

考察不同流動(dòng)相體系[乙腈-0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)至pH 3.0）、乙腈-0.05 mol·L-1醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)至pH 3.0）、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.1%辛烷磺酸鈉）（用磷酸調(diào)至pH 3.0）、乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)至pH 3.0）、乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調(diào)至pH 3.0）]對(duì)醋酸氟卡尼色譜峰的影響，結(jié)果表明將乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調(diào)至pH 3.0）作為流動(dòng)相時(shí)待測(cè)成分峰形較好，理論塔板數(shù)大于4500，將其選定為流動(dòng)相。考察了以乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調(diào)至pH 3.0）作為流動(dòng)相，調(diào)整有機(jī)相和水相不同比例，以及設(shè)定不同流速（0.5、0.8、1.0 mL·min-1）對(duì)待測(cè)成分保留時(shí)間的影響，結(jié)果顯示當(dāng)乙腈和水相的比例為35∶65，流速采用1.0 mL·min-1時(shí)，醋酸氟卡尼的保留時(shí)間約為5 min，較為合適。

3.3 提取溶劑的選擇

在含量測(cè)定分析中選擇常用的超聲提取法作為樣品的提取方法，比較了以乙腈、甲醇、2%冰醋酸溶液、0.2%冰醋酸溶液作為提取溶劑的影響，結(jié)果表明用2%冰醋酸溶液20 mL作為提取溶劑能夠提取完全，之后再加流動(dòng)相稀釋至刻度能使色譜峰峰形良好。

3.4 樣品取樣量的選擇

制備供試品溶液時(shí)，對(duì)稱取不同樣品粉末量（約相當(dāng)于醋酸氟卡尼25、100、250 mg）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示當(dāng)稱取量約為相當(dāng)于醋酸氟卡尼100 mg，加2%冰醋酸溶液20 mL，再用流動(dòng)相稀釋至250 mL時(shí)目標(biāo)測(cè)定成分具有合適的響應(yīng)值。

3.5 測(cè)定方法的改進(jìn)

現(xiàn)行版《日本藥典》[6]以及文獻(xiàn)報(bào)道[7]的醋酸氟卡尼片含量測(cè)定方法為采用紫外分光光度法，儀器設(shè)備和操作比較簡(jiǎn)單，但其專屬性不如HPLC法。文獻(xiàn)中是通過(guò)吸光系數(shù)法進(jìn)行定量，未配制對(duì)照品溶液，吸光系數(shù)法有可能造成測(cè)定結(jié)果的不準(zhǔn)確，如果雜質(zhì)或輔料在選定的測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，則會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高。HPLC法具有定量準(zhǔn)確、分離性能高、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在藥品定量分析中具有一定優(yōu)勢(shì)[11]?！睹绹?guó)藥典》[5]中收載的醋酸氟卡尼片，是通過(guò)HPLC法測(cè)定其含量，流動(dòng)相為乙腈-100 mmol·L-1乙酸銨溶液（用乙酸調(diào)pH至5.4），梯度洗脫，該方法于2019年修訂并沿用至今，緩沖鹽的濃度較高，長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行有可能引起鹽析出，堵塞色譜柱或管路；梯度洗脫需要平衡色譜柱，用時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)。而在修訂之前《美國(guó)藥典》[8]的方法是以乙腈-冰醋酸-四丁基氫氧化銨-甲醇的混合溶液為流動(dòng)相，溶液配制復(fù)雜，四丁基氫氧化銨為離子對(duì)試劑，長(zhǎng)期運(yùn)行對(duì)色譜柱和液相系統(tǒng)的損傷較大，且使用后會(huì)使柱平衡時(shí)間延長(zhǎng)，平衡時(shí)間不夠可能對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性造成影響；并且采用C8分析柱，相比于HPLC法最常用的C18柱，不利于方法的推廣應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)道[7]的HPLC法是采用內(nèi)標(biāo)法，需配制胺碘酮內(nèi)標(biāo)溶液，樣品前處理溶液配制操作和結(jié)果計(jì)算相對(duì)較為耗時(shí)，流動(dòng)相采用67 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液，濃度較高，對(duì)色譜系統(tǒng)的長(zhǎng)期運(yùn)行有一定損害。本研究采用乙腈-20 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液為流動(dòng)相，緩沖鹽濃度較低，有利于液相系統(tǒng)的長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行和樣品的連續(xù)測(cè)定，與用更高濃度的緩沖鹽進(jìn)行比較，結(jié)果顯示20 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液即可獲得較好的峰形。采用等度洗脫的方式能夠節(jié)省時(shí)間，可在10 min之內(nèi)完成測(cè)定，經(jīng)專屬性試驗(yàn)，樣品中的輔料和強(qiáng)制降解產(chǎn)物不干擾目標(biāo)成分的定量分析。采用外標(biāo)法定量，相比于內(nèi)標(biāo)法，樣品前處理溶液配制過(guò)程以及測(cè)定結(jié)果計(jì)算簡(jiǎn)便快捷。