白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備與體外釋放研究

崔欣冉，張程皓，唐景玲（哈爾濱醫(yī)科大學藥學院，哈爾濱 150086）

白藜蘆醇（Res）是一種天然多酚化合物[1]，主要分布在藥用植物和食物中，包括虎杖、決明、花生以及葡萄等。它是植物體在逆境或遇到病原侵襲時分泌的一種天然植保素，具有毒副作用小的特點，同時又具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肺纖維化[2]以及心血管保護等多種藥理效應，潛在的應用前景備受關(guān)注。然而，Res難溶于水、穩(wěn)定性較差且代謝迅速，亟須尋找適宜的載體對其進行改善。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLCs）目前已經(jīng)作為通用載體出現(xiàn)，它是由固體脂質(zhì)納米粒（SLNs）發(fā)展而來的一種新型藥物遞送平臺[3-4]，通過在固體脂質(zhì)中引入一定比例的液體脂質(zhì)并將兩者混合制備而成。液體脂質(zhì)的加入能夠破壞SLNs有序的晶體結(jié)構(gòu)，使NLCs增加更多空間，并可有效防止藥物的泄漏，從而增強載藥能力[5]。相較于其他載體（膠束、納米乳、脂質(zhì)體），NLCs不僅具備高生物相容性、高穩(wěn)定性以及高生物利用度等優(yōu)勢，還能通過調(diào)控不同比例的固液脂質(zhì)比形成穩(wěn)定的固體骨架結(jié)構(gòu)從而實現(xiàn)更好的藥物控釋[6-8]。因此本研究將Res制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，旨在提高Res溶解度，增加其穩(wěn)定性，提高生物利用度，并對白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（Res-NLCs）的體外釋放進行評價，以期為Res的新劑型研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S-CW 電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；1260 Infinity 高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司）；NanoZS90 光散射粒徑分析儀（英國 Malven 公司）；SZCL-4 數(shù)顯智能恒溫磁力攪拌器（上海卓康生物科技有限公司）；Nano微射流均質(zhì)機（上海諾澤流體科技有限公司）；5430R 低溫超速離心機（德國 Eppendorf 公司）；HZQ-C 空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 試藥

白藜蘆醇（含量＞99%，批號：B1807119，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大豆磷脂（LEC）（批號：SY-SO-200801，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；吐溫80（Tween-80）（批號：SYSO-200801，天津市富宇精細化工有限公司）；雙硬脂酸甘油酯（GD）（批號：H14M10Z82904，嘉法獅上海貿(mào)易有限公司）；辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Lab）（批號：F2102301，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇（天津市天力化學試劑有限公司）；甲醇（山東禹王實業(yè)有限公司）；乙腈（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 Res-NLCs的制備

本實驗選擇毒性低，具有良好乳化能力的GD和LEC作為固體脂質(zhì)；并對Res在不同液體脂質(zhì)中的飽和溶解度進行測定，選擇溶解度最高的Lab作為液體脂質(zhì)，同時以Tween-80作為乳化劑，通過乳化蒸發(fā)-高壓均質(zhì)法制備Res-NLCs。稱取處方量的Res、LEC置于EP管中加入3 mL無水乙醇超聲溶解后待用，將GD、Lab加熱至75℃溶解，然后將脂質(zhì)與藥物乙醇溶液混合均一使成油相；稱取適量Tween-80置于燒杯中，加入20 mL純化水攪拌均勻使成水相；將油、水兩相同時加熱到75℃后，使油相緩緩滴進保持攪拌的水相中后繼續(xù)攪拌，直至有機試劑揮干得初乳；使用均質(zhì)機，對初乳均質(zhì)3次循環(huán)（6000 psi），完成后冷凍固化得Res-NLCs。

2.2 超濾離心法測定Res-NLCs的包封率和載藥量

2.2.1 超濾離心法藥物回收率 取 400 μL Res 溶液于超濾離心管內(nèi)管中，13 500 r·min-1低溫離心 30 min，將外管中溶液采用流動相分別稀釋至16、20、24 μg·mL-1，進樣分析，計算Res的回收率。3種不同濃度的Res回收率均在98.48%～101.68%，RSD值均在0.13%～0.29%，符合方法學要求。

2.2.2 Res-NLCs的包封率及載藥量的測定 采用超濾法[9]，取定量Res-NLCs溶液，置于截留分子量為100 kD的超濾離心管內(nèi)管，并將內(nèi)外管進行組裝，放入低溫超速離心機離心30 min（13 500 r·min-1、4℃），取外管中分離下來的游離藥物溶液進行稀釋，采用HPLC分析，測得游離Res含量（W1）；同時取Res-NLCs溶液，加入乙腈稀釋同等倍數(shù)，超聲15 min進行破乳，通過HPLC分析，即得Res總含量（W2）。

按照下式計算Res-NLCs包封率（EE）及載藥量（DL）：包封率（%）＝[（W2-W1）/W2]×100%；載藥量（%）＝（W3/W4）×100%。其中，W1代表NLCs未包封的藥物含量，W2代表Res的總含量，W3代表NLCs中包封Res的總含量，W4代表Res-NLCs的總重量。

2.3 正交試驗優(yōu)化Res-NLCs的處方

基于前期單因素篩查所得結(jié)果，選擇固液脂質(zhì)比（A）、Tween-80質(zhì)量濃度（B）、均質(zhì)壓力（C）、均質(zhì)次數(shù)（D）4個因素，每個因素設(shè)置3個水平，以包封率作為優(yōu)化指標，設(shè)計正交試驗，優(yōu)化Res-NLCs的處方。設(shè)計表見表1。

表1 正交設(shè)計因素水平Tab 1 Factor and level of orthogonal experiment

每個因素對指標（EE）的影響程度見表2，由極差（Rj）可知因素影響大小次序為：C＞A＞B＞D，由均值大小可判斷最佳處方為A3B3C2D2。方差分析結(jié)果（見表 3）顯示，在以D（均質(zhì)次數(shù)）為誤差項的前提下，因素A（固液脂質(zhì)比）、B（Tween-80質(zhì)量濃度）、C（均質(zhì)壓力）對包封率具有顯著性影響（P＜0.05）。優(yōu)化后得到的最優(yōu)處方為：GD用量為0.0356 g，LEC用量為0.3918 g，Tween-80的質(zhì)量濃度為4.25%，Lab用量為0.0475 g；最佳制備工藝為：均質(zhì)壓力6000 psi，均質(zhì)次數(shù)30次。按照最優(yōu)處方平行制備3批Res-NLCs，測得包封率和載藥量的平均值分別為（98.43±0.07）% 和（11.04±0.14）%。

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Orthogonal experiment

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

2.4 Res-NLCs的外觀形態(tài)

將適量新鮮制備的Res-NLCs用純化水稀釋至適當濃度后，取一滴置于覆有支撐膜的銅網(wǎng)上，靜置待其自然干燥，然后用透射電子顯微鏡觀察樣品形貌。Res-NLCs的外觀圖如圖1所示，制劑澄清透明，具有淡藍色乳光。Res-NLCs的透射電鏡結(jié)果如圖 2 所示，Res-NLCs呈規(guī)則圓球狀，大小均一，無粘連，粒徑較小且分散性良好。

圖1 Res-NLCs的外觀圖Fig 1 Appearance of Res-NLCs

圖2 Res-NLCs的透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron microscopy of Res-NLCs

2.5 Res-NLCs粒徑及Zeta電位的測定

采用光散射粒徑分析儀測定Res-NLCs的粒徑及Zeta電位，精密吸取10 μL新制備的最優(yōu)處方的Res-NLCs，用純化水稀釋至1 mL，混合均勻后，放入儀器測定粒徑及多分散系數(shù)（PDI）。結(jié)果如圖3 A所示，Res-NLCs的粒徑為（81.87±0.14）nm，PDI為（0.099±0.02）。另取適量Res-NLCs放入樣品池，測定其Zeta電位。結(jié)果如圖3B所示，Res-NLCs的Zeta電位為（-8.09±0.75）mV。

圖3 Res-NLCs的粒徑（A）和Zeta電位（B）Fig 3 Particle size（A）and Zeta potential（B）of Res-NLCs

2.6 Res-NLCs的穩(wěn)定性考察

按照最優(yōu)處方平行制備3份Res-NLCs，放置于 4℃ 冷藏柜，避光儲存，并分別于 0、1、7、21、30 d測定其包封率和粒徑以考察Res-NLCs的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖4所示，在4℃條件下，Res-NLCs的包封率在第21日有所下降，30 d內(nèi)降至88.52%，粒徑略有上升，表明 Res-NLCs 在此條件下避光儲存21 d基本穩(wěn)定。

圖4 不同儲存時間對Res-NLCs 包封率和粒徑的影響Fig 4 Effect of different storage time on the EE and DL of Res-NLCs

圖5 白藜蘆醇色譜圖Fig 5 Chromatogram of resveratrol

2.7 Res-NLCs的體外釋藥行為研究

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（含0.05%磷酸）（68∶32）；柱溫：30℃；檢測波長：305 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1。

2.7.2 溶液的配制

① 空白溶液：配制pH為7.4的含0.3%（w/V）Tween-80的PBS溶液，作為釋放介質(zhì)。

② 對照品溶液：精密稱取Res對照品10 mg，用釋放介質(zhì)溶解并定容至50 mL，即得200 μg·mL-1Res的藥物母液。

③ 供試品溶液：移取1 mL Res-NLCs，用釋放介質(zhì)定容至10 mL，即得。

2.7.3 專屬性試驗 取“2.7.2”項下的空白溶液、對照品溶液、供試品溶液，稀釋至一定濃度后，過濾，進樣，考察NLCs成分以及釋放介質(zhì)是否干擾藥物含量測定。結(jié)果如圖 5所示，Res峰形良好且未見雜峰，表明釋放介質(zhì)對Res的含量測定無干擾，該方法專屬性符合要求。

2.7.4 線性關(guān)系考察 取“2.7.2”項下的對照品溶液，用釋放介質(zhì)稀釋成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 μg·mL-1系列對照溶液，進樣測定并記錄峰面積（A）。繪制標準曲線，得回歸方程為：A＝57.778C-3.7319，r＝0.9998。結(jié)果表明Res在0.1～20.0 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7.5 精密度考察 分別配制低（0.5 μg·mL-1）、中（5.0 μg·mL-1）和高（15.0 μg·mL-1）質(zhì)量濃度的Res溶液，于1 d內(nèi)連續(xù)5次進樣分析，得日內(nèi)精密度；5 d內(nèi)同法進樣，得日間精密度。結(jié)果RSD值均在0.30%～1.7%，表明方法的精密度符合要求。

2.7.6 回收試驗考察 取適量Res對照品溶液加入釋放介質(zhì)中，分別配制成質(zhì)量濃度為低（7.5 μg·mL-1）、中（12.0 μg·mL-1）和高（15.0 μg·mL-1）的Res溶液，進樣測定，計算回收率。3種不同濃度的Res回收率在98.88%～101.82%，RSD值均在0.26%～0.72%，表明該方法準確度良好。

2.7.7 穩(wěn)定性考察 將供試品溶液放置于室溫，于24 h內(nèi)每隔2 h進樣一次，計算出各時間點藥物濃度的RSD。結(jié)果得出RSD為0.46%，表明Res供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 Res-NLCs中Res的體外釋藥行為研究

采用正向動態(tài)膜透析法[10]考察Res-NLCs的體外釋藥行為，使用0.3%（w/V）Tween-80的PBS（pH 7.4）作為釋放介質(zhì)。將1 mL Res-NLCs和1 mL Res溶液（溶劑為PEG 400）分別放入透析袋（截留分子量：8～14 kD），將透析袋兩端固定好后放入燒杯中，加入200 mL釋放介質(zhì)，并保證將透析袋浸沒于液面下，使燒杯保持在恒溫振蕩器內(nèi)（37℃、100 r·min-1），分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、24、36和48 h 吸取1 mL釋放液，并補加同體積的等溫釋放介質(zhì)，以保證釋放介質(zhì)體積一致。樣品經(jīng)微孔濾膜過濾后，按“2.7.1”項下色譜條件進行含量測定（n＝3），代入以下公式，得Res釋放含量，繪制釋放曲線（見圖6）。

圖6 Res-NLCs及Res溶液中Res的釋放曲線（±s，n＝3）Fig 6 In vitro release curve of Res in Res-NLCs and resveratrol solution（±s，n＝3）

其中Cn為Res在t時刻測得的濃度，Ci為Res在t時刻之前測定的濃度，V0為接收池中加入的溶液體積，V為取樣體積，Q0為起始時Res總量。Res-NLCs和Res溶液在48 h內(nèi)的釋放曲線如圖6所示，Res溶液釋放相對快速，8 h 內(nèi)累計釋放97.31%；Res-NLCs在48 h內(nèi)持續(xù)釋放，累計釋放80.69%；Res-NLCs與Res溶液相比明顯釋放緩慢，延長了釋放時間。

同時，還引入 4 種釋放模型對 Res-NLCs的釋放曲線進行模型擬合。結(jié)果如表4所示，釋放數(shù)據(jù)擬合到Makoid-Banakar 模型時R2＝0.9924，表明 Res從 NLCs中的釋放最適合Makoid-Banakar釋放模型，并且相關(guān)系數(shù)r為0.87，在0.45～0.89，說明 Res 的釋放機制屬于溶蝕與擴散相結(jié)合。

表4 Res-NLCs釋放曲線的數(shù)學模型擬合Tab 4 Model fitting of release curves of Res-NLCs

3 討論

本試驗采用乳化蒸發(fā)-高壓均質(zhì)法制備Res-NLCs[11]，粒徑較小且分布均勻，同時液體脂質(zhì)的加入使其具有較高的包封率及載藥量。在Res-NLCs的制備過程中發(fā)現(xiàn)，隨著固體脂質(zhì)比例的增加，包封率逐漸增大，這可能和固體脂質(zhì)與藥物具有較好的相容性有關(guān)；較小劑量液體脂質(zhì)的加入可以破壞其內(nèi)部的晶格結(jié)構(gòu)，增加其包封率，但過多液體脂質(zhì)的加入，可能會降低藥物與脂質(zhì)之間的相容度，反而導致包封率下降。

在體外釋放試驗中，由于Res水溶性較差，因此需要加入適宜的表面活性劑來改善溶解性。預試驗分別考察了Res在含0.1%～1.0%（w/V）Tween-80的PBS溶液中的飽和溶解度，最終選擇符合漏槽條件的含0.3%（w/V）Tween-80的PBS（pH 7.4）溶液作為釋放介質(zhì)，當然，這種介質(zhì)并不能完全代替體內(nèi)的釋放條件，體內(nèi)會存在各種代謝酶且具備更復雜的機體機能，可能最終會導致Res-NLCs中藥物的完全釋放。釋放曲線的研究結(jié)果表明，Res-NLCs前期釋放相對快速可能歸因于有部分Res吸附在NLCs表面，導致快速滲透；而NLCs中包裹的Res可能以無定形狀態(tài)存在于有缺陷的晶格空間或固、液脂質(zhì)層中，導致釋放相對困難，擴散緩慢[12]，因此Res-NLCs可以顯著延長釋放的時間，展現(xiàn)出良好的緩釋效果，有望改善Res在體內(nèi)代謝快，吸收差的缺點。本試驗制備的Res-NLCs達到預期提高Res生物利用度的目的，后期將繼續(xù)對Res-NLCs體內(nèi)藥代動力學、體內(nèi)外藥效學繼續(xù)進行研究，以從多方面深入探討Res-NLCs的劑型優(yōu)勢。