川枳殼黃酮類成分及其對成骨細(xì)胞增殖作用的研究

向丹，李玉玫，王靖雯，徐偉，何潔月，楊云芝*（.南充市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，四川 南充 67000；2.筋骨病中醫(yī)藥防治南充市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 67000；.南充市食品藥品檢驗(yàn)所，四川 南充 67000；4.南充市中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑中心，四川 南充 67000）

中藥枳殼為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物酸橙（CitrusaurantiumL.）及其栽培變種臭橙、香橙、枳橙的干燥未成熟果實(shí)，產(chǎn)地主要分布于江西、四川、湖南等地，按照產(chǎn)地的不同分別稱為江枳殼、川枳殼和湘枳殼，其中江枳殼為道地藥材，川枳殼為主流品種[1-2]。枳殼中化學(xué)成分類型主要包括黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類、苯丙素類等，其中黃酮類成分是枳殼的主要活性成分，也作為枳殼質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要標(biāo)志物，其總含量可達(dá)15.44%[3-4]。目前已從中藥枳殼中分離得到62個(gè)黃酮類成分，但多篇文獻(xiàn)顯示不同產(chǎn)地枳殼在黃酮類成分種類與含量上差異顯著[5]。

骨損傷或骨折是骨傷科最常見的疾病，損傷初期有明顯的腫痛表現(xiàn)，中醫(yī)認(rèn)為此腫痛病機(jī)為氣滯血瘀，常用枳殼行行氣散瘀止痛之功效。本研究團(tuán)隊(duì)前期對我院筋骨病常用中藥進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)川枳殼乙醇提取物對成骨細(xì)胞具有增殖作用。中藥枳殼藥理作用眾多，包括抗腫瘤、抗炎、抗抑郁、降血脂、胃腸功能調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等[6-7]，但未見關(guān)于抗骨質(zhì)疏松方面的研究。故本研究通過大孔樹脂、聚酰胺樹脂富集川枳殼煎煮液中的黃酮類成分，并采用小孔樹脂、硅膠柱色譜等分離手段對川枳殼黃酮類成分進(jìn)行系統(tǒng)分離，共分離鑒定出12個(gè)黃酮類化合物，分別為柚皮苷（1）、新橙皮苷（2）、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷（3）、narirutin（4）、sarotanoside（5）、圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷（6）、柚皮素（7）、芫花素（8）、圣草酚（9）、angophorol（10）、南酸棗苷（11）、tetrahydroprotogenkwanone（12）（結(jié)構(gòu)見圖1），通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對12個(gè)黃酮類成分進(jìn)行活性篩選，確定各化合物對成骨細(xì)胞增殖的影響。

1 材料

1.1 儀器

Bruker Avance III-400 核磁共振儀、Bruker Daltonics MS質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（無錫沃信儀器有限）；CKX31倒置相差顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]；FA2004分析天平（上海力辰科技儀器有限公司）；TD5A醫(yī)用離心機(jī)（常州市金壇高科儀器廠）；G-100S型超聲波清洗器（深圳市哥能清洗設(shè)備有限公司）；ZF-2型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；RE-1102型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技有限公司）；SYG-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器廠）；LCK2000煎藥機(jī)（天津三延精密機(jī)械有限公司）；LDZX-30KBS 壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

硅膠（100～200目）和硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠）；AB-8大孔樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司）；葡聚糖凝膠LH-20（湖南匯百侍生物科技有限公司）；MCI CHP-20（75～150 μm）（日本三菱公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇等均為分析純；CCK-8細(xì)胞增殖測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

川枳殼（成都吉安康藥業(yè)有限公司，批號：210209-11，采自四川省南充市營山縣清水鄉(xiāng)銀鴿村）經(jīng)南充市中醫(yī)醫(yī)院張德明中藥師鑒定為蕓香科柑橘屬植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥未成熟果實(shí)。

1.3 細(xì)胞

小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14又稱MC3T3-E1（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫）。

2 提取分離

川枳殼中藥飲片5 kg，制成粗粉后用8倍量水煎煮2次，每次2 h，減壓濃縮至浸膏（1782.6 g），浸膏用適量水分散，加至含AB-8大孔樹脂的水溶液中，吸附過夜，裝柱，分別用4倍柱體積的20%、75%、95%乙醇水洗脫；75%乙醇水洗脫部位濃縮成浸膏，水分散，加入適量聚酰胺樹脂吸附2 h，裝柱，分別用4倍柱體積的35%、70%、95%乙醇水洗脫，收集70%乙醇水洗脫液，減壓濃縮至浸膏（801.4 g）。

70%乙醇水洗脫部位用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-乙醇為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫（1∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、0∶1），以薄層色譜為檢測方式，紫外254 nm顯色或10%硫酸乙醇烤板顯色，對相似流份進(jìn)行合并，得8個(gè)組分Fr.A～Fr.H。組分Fr.F溶液析出淡黃色顆粒物，經(jīng)丙酮反復(fù)洗滌得化合物1（646.8 mg），經(jīng)MCI柱色譜30%甲醇水洗脫得化合物2（358.5 mg）；Fr.E經(jīng)MCI柱色譜32%甲醇水洗脫、硅膠柱色譜得化合物3（185.6 mg）、化合物4（62.1 mg）、化合物5（35.8 mg）；Fr.D經(jīng)MCI柱色譜39%甲醇水洗脫、硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇30∶1洗脫、葡聚糖凝膠LH-20甲醇-水（1∶1）過篩得化合物6（91.8 mg）、化合物11（29.5 mg）；Fr.C經(jīng)硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（30∶1）得Fr.C1～Fr.C5，F(xiàn)r.C1經(jīng)硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（60∶1）洗脫得化合物7（185.2 mg）、化合物10（68.3 mg），F(xiàn)r.C3經(jīng)葡聚糖凝膠LH-20色譜柱，二氯甲烷-甲醇（1∶1）過篩得化合物8（64.3 mg），F(xiàn)r.C4在石油醚-乙酸乙酯（3∶1）中重結(jié)晶得化合物9（59.6 mg），經(jīng)反復(fù)葡聚糖凝膠LH-20二氯甲烷-甲醇（1∶1）過篩得化合物12（16.2 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色粉末（甲醇）；C27H32O14；ESI-MSm/z：581.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.06（1H，s，5-OH），7.21（2H，d，J＝8.7 Hz，H-2'，6'），6.72（2H，d，J＝8.7 Hz，H-3'，5'），6.15（2H，m，H-6，8），5.62（1H，dd，J＝13.2，2.8 Hz，H-2），4.82（1H，d，J＝4.9 Hz，H-1''），4.67（1H，d，J＝5.3 Hz，H-1'''），3.15～3.70（10 H，m，H-2''～6''，H-2'''～5'''），3.28（1H，m，H-3β），2.76（1H，dd，J＝16.2，2.8 Hz，H-3α），1.14（3H，d，J＝6.2 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.4（C-2），42.5（C-3），198.7（C-4），163.5（C-5），97.6（C-6），165.8（C-7），96.4（C-8），161.1（C-9），104.2（C-10），129.1（C-1'），128.1（C-2'，6'），118.1（C-3'，5'），158.3（C-4'），101.4（C-1''），73.2（C-2''），77.8（C-3''），70.5（C-4''），76.6（C-5''），65.7（C-6''），100.4（C-1'''），70.2（C-2'''），71.8（C-3'''），72.5（C-4'''），67.6（C-5'''），18.3（C-6'''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]的柚皮苷數(shù)據(jù)一致，故確定化合物1為柚皮苷。

化合物2：白色粉末（甲醇）；C28H34O15；ESI-MSm/z：611.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δH：12.02（1H，s，5-OH），9.53（1H，s，3'-OH），7.06（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5'），6.98（1H，d，J＝2.8 Hz，H-2'），6.88（1H，dd，J＝8.4，2.8 Hz，H-6'），6.13（1H，d，J＝1.2 Hz，H-8），6.11（1H，d，J＝1.2 Hz，H-6），5.62（1H，dd，J＝12.4，1.8 Hz，H-2），5.25（1H，d，J＝5.3 Hz，H-1''），4.76（1H，d，J＝5.4 Hz，H-1'''），3.85（3H，s，4'-OCH3），3.22（1H，m，H-3β），2.62（1H，dd，J＝17.1，1.8 Hz，H-3α），1.15（3H，d，J＝6.5 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δC：78.4（C-2），41.9（C-3），197.8（C-4），163.2（C-5），97.1（C-6），164.9（C-7），96.1（C-8），162.3（C-9），103.6（C-10），131.1（C-1'），115.1（C-2'），147.1（C-3'），148.2（C-4'），113.0（C-5'），117.6（C-6'），100.8（C-1''），73.3（C-2''），76.9（C-3''），70.2（C-4''），75.7（C-5''），66.2（C-6''），100.1（C-1'''），70.8（C-2'''），71.3（C-3'''），72.6（C-4'''），68.1（C-5'''），18.5（C-6'''），56.8（4'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的新橙皮苷[9]數(shù)據(jù)一致，故確定化合物2為新橙皮苷。

化合物3：淡黃色針晶（甲醇）；C21H22O10；ESI-MSm/z：435.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.09（1H，s，5-OH），7.32（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.94（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.23（2H，m，H-6，8），5.54（1H，dd，J＝12.7，2.8 Hz，H-2），4.84（1H，d，J＝7.5 Hz，H-1''），3.25（1H，m，H-3β），2.78（1H，m，H-3α）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.1（C-2），42.1（C-3），197.2（C-4），163.6（C-5），96.8（C-6），166.5（C-7），95.5（C-8），162.3（C-9），103.6（C-10），131.6（C-1'），128.1（C-2'，6'），117.4（C-3'，5'），157.9（C-4'），102.8（C-1''），73.4（C-2''），77.6（C-3''），69.8（C-4''），76.4（C-5''），61.6（C-6''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]的柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷數(shù)據(jù)一致，故確定化合物3為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4：淡黃色粉末；C27H32O14；ESIMSm/z：581.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.03（1H，s，5-OH），7.25（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.68（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.12（2H，m，H-6，8），5.59（1H，dd，J＝12.9，2.6 Hz，H-2），4.76（1H，d，J＝4.8 Hz，H-1''），4.58（1H，d，J＝5.6 Hz，H-1'''），3.26（1H，m，H-3β），2.68（1H，dd，J＝16.8，2.6 Hz，H-3α），1.16（3H，d，J＝6.5 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：78.3（C-2），42.1（C-3），196.7（C-4），162.9（C-5），96.4（C-6），164.5（C-7），95.1（C-8），162.3（C-9），103.5（C-10），129.1（C-1'），128.4（C-2'，6'），116.6（C-3'，5'），156.9（C-4'），99.8（C-1''），76.4（C-2''），77.3（C-3''），69.8（C-4''），77.2（C-5''），60.5（C-6''），98.4（C-1'''），70.3（C-2'''），70.6（C-3'''），71.9（C-4'''），68.6（C-5'''），17.8（C-6'''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8，12]的narirutin數(shù)據(jù)一致，故確定化合物4為narirutin。

化合物5：淡黃色粉末；C27H32O13；ESI-MSm/z：565.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.25（1H，s，5-OH），7.5～7.8（5H，m，H-2'～H5'），6.62（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.45（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），5.74（1H，dd，J＝12.3，2.9 Hz，H-2），5.26（1H，d，J＝5.2 Hz，H-1''），5.18（1H，d，J＝5.4 Hz，H-1'''），3.54（1H，m，H-3β），2.75（1H，m，H-3α），1.28（3H，d，J＝6.8 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：77.3（C-2），42.9（C-3），196.8（C-4），162.6（C-5），96.8（C-6），164.8（C-7），95.7（C-8），162.8（C-9），103.9（C-10），139.4（C-1'），126.1（C-2'，6'），128.1（C-3'，5'），126.7（C-4'），98.4（C-1''），78.4（C-2''），76.1（C-3''），69.6（C-4''），76.8（C-5''），61.7（C-6''），100.5（C-1'''），70.6（C-2'''），70.8（C-3'''），71.3（C-4'''），68.1（C-5'''），18.0（C-6'''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]的sarotanoside數(shù)據(jù)一致，故確定化合物5為sarotanoside。

化合物6：黃色粉末（甲醇），C21H22O11；ESI-MSm/z：451.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.21（1H，s，5-OH），7.06（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6'），6.98（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2'），6.81（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5'），5.92（1H，s，H-6），5.95（1H，s，H-8），5.24（1H，dd，J＝12.7，2.5 Hz，H-2），4.76（1H，d，J＝6.8 Hz，H-1''），3.15（1H，m，H-3β），2.64（1H，m，H-3α）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.1（C-2），42.6（C-3），196.7（C-4），162.5（C-5），95.8（C-6），166.7（C-7），96.7（C-8），165.5（C-9），103.2（C-10），129.7（C-1'），115.4（C-2'），145.8（C-3'），145.6（C-4'），114.8（C-5'），120.4（C-6'），102.8（C-1''），73.6（C-2''），77.4（C-3''），70.1（C-4''），76.4（C-5''），61.4（C-6''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]的圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷數(shù)據(jù)一致，故確定化合物6為圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7：淡黃色粉末（甲醇），C15H12O5；ESI-MSm/z：273.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.12（1H，s，5-OH），10.35（1H，s，7-OH），9.16（1H，s，4'-OH），7.35（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.74（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），5.92（2H，m，H-6，8），5.53（1H，dd，J＝12.6，2.7 Hz，H-2），3.25（1H，dd，J＝12.6，16.8 Hz，H-3α），2.73（1H，dd，J＝16.8，2.7 Hz，H-3β）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：78.9（C-2），42.1（C-3），196.9（C-4），163.4（C-5），95.4（C-6），167.2（C-7），95.8（C-8），164.1（C-9），102.3（C-10），131.6（C-1'），128.4（C-2'，6'），115.7（C-3'，5'），158.4（C-4'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]的柚皮素?cái)?shù)據(jù)一致，故確定化合物7為柚皮素。

化合物8：黃色粉末（甲醇），C16H12O5；ESIMSm/z：285.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.26（1H，s，5-OH），10.16（1H，s，4'-OH），7.85（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2'，6'），6.94（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3'，5'），6.71（1H，d，J＝1.5 Hz，H-8），6.68（1H，d，J＝1.5 Hz，H-6），6.41（1H，s，H-3），3.83（3H，s，7-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：163.9（C-2），103.1（C-3），186.4（C-4），157.6（C-5），98.7（C-6），166.3（C-7），92.7（C-8），161.3（C-9），105.8（C-10），123.1（C-1'），128.6（C-2'，6'），116.4（C-3'，5'），159.8（C-4'），56.8（7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]的芫花素?cái)?shù)據(jù)一致，故確定化合物8為芫花素。

化合物9：黃色粉末（甲醇），C15H12O6；ESIMSm/z：289.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：7.16（1H，s，H-2'），6.91（1H，d，J＝8.1 Hz，H-6'），6.72（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5'），5.79（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），5.77（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.15（1H，dd，J＝12.6，3.2 Hz，H-2），3.12（1H，dd，J＝12.6，16.9 Hz，H-3α），2.71（1H，dd，J＝16.9，3.2 Hz，H-3β）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.2（C-2），43.0（C-3），196.3（C-4），163.5（C-5），95.8（C-6），166.9（C-7），95.4（C-8），162.7（C-9），102.3（C-10），129.6（C-1'），113.9（C-2'），145.6（C-3'），145.9（C-4'），115.8（C-5'），118.2（C-6'），。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的圣草酚[15]數(shù)據(jù)一致，故確定化合物9為圣草酚。

化合物10：淡黃色粉末（甲醇），C16H14O5；ESI-MSm/z：287.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.38（1H，s，5-OH），11.23（1H，s，7-OH），7.35（2H，dd，J＝8.4，2.3 Hz，H-2'，6'），6.91（2H，dd，J＝8.6，2.3 Hz，H-3'，5'），6.12（1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），6.14（1H，d，J＝2.2 Hz，H-6），5.24（1H，dd，J＝13.1，2.8 Hz，H-2），3.04（1H，dd，J＝17.0，13.1 Hz，H-3β），2.62（1H，dd，J＝17.0，2.8 Hz，H-3α），3.81（3H，s，4'-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.6（C-2），43.3（C-3），196.8（C-4），164.2（C-5），96.4（C-6），166.6（C-7），95.9（C-8），163.4（C-9），103.1（C-10），131.2（C-1'），128.4（C-2'，6'），114.8（C-3'，5'），159.6（C-4'），55.9（4'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]的angophorol數(shù)據(jù)一致，故確定化合物10為angophorol。

化合物11：無色針晶（甲醇），C21H22O10；ESI-MSm/z：435.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：7.48（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2'，6'），7.12（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3'，5'），6.05（2H，s，H-6，8），5.42（1H，dd，J＝13.9，2.9 Hz，H-2），4.92（1H，d，J＝5.6 Hz，H-1''），4.67（1H，d，J＝5.3 Hz，H-1'''），3.15（1H，dd，J＝16.5，13.9 Hz，H-3β），2.78（1H，dd，J＝16.5，2.9 Hz，H-3α）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：78.2（C-2），43.5（C-3），187.4（C-4），163.8（C-5），92.9（C-6），164.6（C-7），94.3（C-8），162.1（C-9），105.3（C-10），129.8（C-1'），128.2（C-2'，6'），117.2（C-3'，5'），156.9（C-4'），101.1（C-1''），73.1（C-2''），77.2（C-3''），70.3（C-4''），76.9（C-5''），60.8（C-6''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[17]的南酸棗苷數(shù)據(jù)一致，故確定化合物11為南酸棗苷。

化合物12：淡黃色粉末（甲醇），C16H16O6；ESI-MSm/z：305.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δH：7.16（1H，s，H-3），6.75（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.58（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），3.81（3H，s，7-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：178.2（C-2），103.8（C-3），186.7（C-4），162.8（C-5），99.8（C-6），167.8（C-7），92.1（C-8），159.2（C-9），102.6（C-10），71.8（C-1'），37.8（C-2'，6'），35.9（C-3'，5'），209.6（C-4'），56.0（7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]的tetrahydroprotogenkwanone數(shù)據(jù)一致，故確定化合物12為tetrahydroprotogenkwanone。

4 抗骨質(zhì)疏松活性篩選

小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1經(jīng)復(fù)蘇后加至α-MEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中，在37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)直至細(xì)胞鋪滿80%的培養(yǎng)瓶底，中途更換培養(yǎng)基1～2次。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、陽性對照組、各化合物組，每組平行6份。收集處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板內(nèi)，每孔200 μL，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜至細(xì)胞貼壁?？瞻讓φ战M加入等量培養(yǎng)基，陽性對照組加入雌二醇使?jié)舛葹?0 μmol·L-1，各化合物組加入對應(yīng)化合物使?jié)舛葹?0 μmol·L-1，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后加入10 μL CCK-8試劑，在室溫下孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞增殖率。增殖率（%）＝待測組OD值/空白對照組OD值×100%。采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與空白對照組相比，雌二醇及化合物1～4、6～9、12對小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1具有明顯的促進(jìn)增殖的作用（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 川枳殼中各黃酮類化合物對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響(n ＝6，±s)Tab 1 Effect of flavonoids in Citrus Aurantium from Sichuan on the proliferation of MC3T3-E1 cells (n＝6，±s)

表1 川枳殼中各黃酮類化合物對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響(n ＝6，±s)Tab 1 Effect of flavonoids in Citrus Aurantium from Sichuan on the proliferation of MC3T3-E1 cells (n＝6，±s)

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與雌二醇組比較，#P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，*P＜0.01；compared with the estradiol group，#P＜0.01.

組別增殖率/%組別增殖率/%空白對照組100.0±3.3雌二醇178.5±5.0*化合物1147.0±7.5*化合物2136.5±9.2*化合物3126.2±9.7*化合物4154.3±3.1*化合物5 99.3±7.1化合物6125.5±9.2*化合物7134.7±5.6*化合物8126.2±4.2*化合物9137.5±4.5*化合物10103.9±5.3化合物11 95.4±4.5化合物12196.3±6.2*#

5 討論

骨質(zhì)疏松是一種全身性骨代謝疾病，以骨量降低，骨組織微管結(jié)構(gòu)破壞為特征，造成骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加，易引起骨折。我國骨質(zhì)疏松發(fā)病率約為7%，其中絕經(jīng)后的女性患病率高達(dá)50%，人們普遍認(rèn)為更年期雌激素丟失是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的首要原因[20-21]，臨床上廣泛使用雌激素治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，但雌激素會(huì)增加絕經(jīng)后婦女中風(fēng)、血栓、腿部痙攣和血管運(yùn)動(dòng)癥狀的發(fā)生率[22]。近年來，國內(nèi)外研究者們發(fā)現(xiàn)植物來源黃酮類成分具有抗骨質(zhì)疏松活性，且不良反應(yīng)少，價(jià)格低廉，作用機(jī)制廣泛，是理想的天然抗骨質(zhì)疏松藥物，研究較多的有骨碎補(bǔ)總黃酮、淫羊藿總黃酮、大豆異黃酮等[23]。

本研究以中藥川枳殼為原料，共分離鑒定出12個(gè)黃酮類成分，包括10個(gè)二氫黃酮及其苷類、1個(gè)黃酮類和1個(gè)類黃酮類成分。其中化合物5、8、10、11、12為首次從該種植物中分離得到，化合物5、10、12為首次從該屬植物中分離得到?？疾炝朔蛛x所得化合物對小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖作用，結(jié)果顯示從川枳殼中分離所得的10個(gè)二氫黃酮及其苷類成分中有7個(gè)成分（化合物1～4、6、7、9）對MC3T3-E1細(xì)胞具有明顯增殖作用，證實(shí)川枳殼確有潛在的抗骨質(zhì)疏松作用，且物質(zhì)基礎(chǔ)與其主要成分二氫黃酮及其苷類密不可分。此研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的柚皮苷（1）[24]、新橙皮苷（2）[25]、柚皮素（7）[26]具有抗骨質(zhì)疏松作用的研究結(jié)果相一致。另外，化合物12為類黃酮成分表現(xiàn)出較強(qiáng)的MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用，優(yōu)于陽性藥雌二醇，可作為抗骨質(zhì)疏松的潛在藥物進(jìn)行深入研究。