基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS的胃康靈膠囊化學(xué)成分分析

劉潤花，譚征，楊暢，楊子燁，關(guān)晶，張建民 （首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院制劑室，北京 100020）

胃康靈膠囊是由張仲景的中醫(yī)名著《傷寒論》中所載的“芍藥甘草湯”演變而來，由白芍、甘草、白及、茯苓、三七、延胡索、海螵蛸、顛茄浸膏8味藥組成的中藥復(fù)方制劑，輔料為碳酸氫鈉。處方按君、臣、佐的中醫(yī)傳統(tǒng)理論進(jìn)行的組方，白芍和甘草為君藥，白及、茯苓和三七為臣藥，延胡索、海螵蛸和顛茄浸膏為佐藥，8味藥合用可用于肝胃不和、瘀血阻絡(luò)所致的胃脘疼痛、連及兩脅、噯氣、泛酸；急、慢性胃炎，胃、十二指腸潰瘍，胃出血見上述證候者。胃康靈膠囊治療慢性胃腸道疾病已有近40年歷史。研究表明胃康靈膠囊具有抗應(yīng)激性潰瘍的作用，可用于修復(fù)胃潰瘍[1-2]。胃康靈膠囊聯(lián)合雷貝拉唑可降低機(jī)體促炎因子水平，調(diào)節(jié)胃腸激素改善潰瘍患者的臨床癥狀[3-4]。此外，胃康靈膠囊、法莫替丁聯(lián)合多潘立酮可用于治療慢性胃炎，臨床治療效果顯著，安全性較高，有助于改善患者的生活質(zhì)量[5]。

胃康靈膠囊現(xiàn)收載于《中國藥典》2020年版第一部中，是治療慢性胃炎的代表性中藥復(fù)方制劑，臨床使用廣泛。其研究主要集中在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如特征性化學(xué)成分含量測定[6-7]、微量元素含量測定[8]、指紋圖譜建立[9]、薄層色譜研究[10]、單味藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高等，此外還包括藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)、臨床療效觀察和工藝研究[11-12]。胃康靈膠囊含有多味中藥，化學(xué)成分多且復(fù)雜，但有關(guān)其化學(xué)成分的綜合分析鮮有報(bào)道，在一定程度上限制了其質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究。LC-MS聯(lián)用技術(shù)具備UPLC的高分離效能和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度特點(diǎn)，可以快速分析中藥及中藥復(fù)方中的化學(xué)成分。目前鮮有學(xué)者采用LC-MS技術(shù)對(duì)胃康靈膠囊的化學(xué)成分進(jìn)行分析?；诖?，本研究采用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)胃康靈膠囊中的成分進(jìn)行快速鑒定分析，以期為進(jìn)一步明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，提高其質(zhì)量控制水平提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CPA225D電子天平（德國 SARTORIUS公司）；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋（中國北京科偉永興儀器有限公司）；超純水儀（型號(hào)：Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)）；UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS質(zhì)譜儀[美國 Thermo Scientific公司，配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur 3.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]；Waters HSS T3 UPLC C18 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×150 mm）（Milford，MA，USA）。

1.2 試藥

胃康靈膠囊（黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：202206041，每粒裝0.4 g）；水為超純水；甲醇、乙腈和甲酸（質(zhì)譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

傾出胃康靈膠囊內(nèi)容物，精密稱取2.50 g于100 mL具塞錐形瓶中，按照1∶10的料液比精密加入水50.0 mL，搖勻，水浴加熱回流2 h，取出靜置放冷，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters UPLC C18（1.7μm，2.1 mm×150 mm）。流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，5%B；2～17 min，5%～98%B；17～20 min，98%B）；20～23 min，98%～5%B；23～25 min，5%B）。流速0.3 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，掃描方式為Full scan/ddMS2，掃描范圍為m/z100～1500 Da；毛細(xì)管溫度為350℃；負(fù)離子模式下的噴霧電壓為3800 V，正離子模式下的噴霧電壓為3200 V；鞘氣為35 arb；輔助氣為15 arb；MS2采用低、中、高三種碰撞能，正離子模式為30 eV、40 eV、50 eV，負(fù)離子模式為30 eV、50 eV、70 eV。一級(jí)質(zhì)譜分辨率Full scan 70 000 FWHM，二級(jí)質(zhì)譜分辨率：MS/MS 17 500 FWHM。

3 結(jié)果與分析

3.1 胃康靈膠囊化學(xué)成分分析

基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)，采集得到胃康靈膠囊化學(xué)成分的質(zhì)荷比及保留時(shí)間等質(zhì)譜信息。使用Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析正負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子以及二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及化合物裂解規(guī)律，結(jié)果共鑒定出142個(gè)化學(xué)成分，包括三萜類58個(gè)、生物堿類32個(gè)、單萜類17個(gè)、黃酮類12個(gè)、多酚類10個(gè)、有機(jī)酸類6個(gè)，菲類3個(gè)、香豆素類1個(gè)、木脂素類1個(gè)、苯并吡喃類1個(gè)和氮苷類1個(gè)（質(zhì)譜偏差范圍δ≤5×10-6）。ESI-和ESI＋模式下胃康靈膠囊水提液的基峰離子流圖見圖1和圖2，鑒定結(jié)果見表1。

表1 胃康靈膠囊化學(xué)成分信息Tab 1 Information of chemical compounds of Weikangling capsule

續(xù)表1

圖1 ESI-模式下胃康靈膠囊的基峰離子流圖Fig 1 Base peak ion flow diagram of Weikangling capsules under negative ion by UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS

圖2 ESI＋模式下胃康靈膠囊的基峰離子流圖Fig 2 Base peak ion flow diagram of Weikangling capsules under positive ion by UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS

3.2 胃康靈膠囊中各類化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律

3.2.1 三萜類化合物 三萜類成分是一類基本母核由30個(gè)碳原子所組成的萜類化合物，以游離苷元形式或以與糖結(jié)合成苷或酯的形式存在于植物體內(nèi)，其質(zhì)譜裂解主要為糖苷鍵的斷裂和苷元的開裂。從胃康靈膠囊水提液正負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖中共鑒定得到58個(gè)三萜類化合物，主要來源于甘草、三七和茯苓。以化合物94為例，其保留時(shí)間為10.48 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z823.4106 [M＋H]＋，推斷其分子式為C42H62O16。二級(jí)質(zhì)譜圖中母離子依次脫去兩個(gè)葡糖醛酸分子得到m/z647.3755 [M-C6H9O6＋H]＋和m/z471.3465 [M-2C6H9O6＋H]＋兩個(gè)特征碎片離子。m/z471.3465為甘草酸苷元，丟失一分子H2O得到m/z453.3361的碎片離子，再失去兩個(gè)CH2自由基得到m/z425.3415的離子。同時(shí)，苷元分子內(nèi)CO鍵含有γH可通過麥?zhǔn)现嘏诺玫絤/z303.1953的碎片離子，苷元也可經(jīng)過RDA裂解生成m/z262.1569的碎片離子。結(jié)合負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子以及特征碎片離子信息，比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]可確定該化合物為三萜類化合物甘草酸，圖3為其可能的裂解規(guī)律。

圖3 甘草酸可能的裂解規(guī)律Fig 3 Proposed fragmentation pathways of glycyrrhizic acid

3.2.2 生物堿類化合物 生物堿多具有較復(fù)雜的氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，根據(jù)結(jié)構(gòu)分為有機(jī)胺類、異喹啉衍生物、莨菪烷（顛茄烷類）衍生物等。從胃康靈膠囊水提液正負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖中共鑒定出32個(gè)生物堿類化合物，主要來源于延胡索和顛茄浸膏。以化合物62為例，其保留時(shí)間為8.48 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z340.1540 [M＋H]＋，推斷其分子式為C20H21NO4；二級(jí)質(zhì)譜圖中母離子丟失中性分子CO得到m/z310.0998的離子碎片。母離子的B環(huán)斷裂得到m/z165.0545和m/z176.0703的離子碎片。B環(huán)和C環(huán)發(fā)生RDA裂解得到m/z192.0615和m/z149.0596的離子碎片。m/z192.0615碎片A環(huán)的兩個(gè)甲氧基發(fā)生斷裂失去兩個(gè)中性分子CH2得到m/z164.0667的離子碎片。此外，母離子的A環(huán)失去一個(gè)OCH2和一個(gè)CH2，D環(huán)側(cè)鏈?zhǔn)ブ行苑肿覱-CH2得到m/z263.1071的離子碎片，D環(huán)進(jìn)一步裂解失去C10H5NO2的側(cè)鏈分子得到m/z107.0494的二級(jí)碎片。結(jié)合負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子以及特征碎片離子信息，比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]可確定該化合物為異喹啉型生物堿氫化小檗堿，圖4為其可能的裂解規(guī)律。

圖4 氫化小檗堿可能的裂解規(guī)律Fig 4 Proposed fragmentation pathways of canadine

莨菪烷類生物堿是由莨菪烷衍生的氨基醇與不同有機(jī)酸縮合成酯類生物堿，其質(zhì)譜裂解主要分為三個(gè)部分：莨菪醇、莨菪酸及含氮雜環(huán)的開裂。以化合物16為例，其保留時(shí)間為5.69 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z306.1703 [M＋H]＋，推斷其分子式為C17H23NO4。二級(jí)質(zhì)譜圖中母離子酯鍵開裂失去莨菪酸得到m/z156.9908 [M-C9H9O]＋及m/z156.9908 [M-C9H9O]＋的多環(huán)碎片離子。含氮雜環(huán)脫去-CH2CHOH的自由基得到m/z262.1443的離子碎片，再脫去一分子H2O和一分子CH2自由基得到m/z230.9465的離子碎片。m/z262.1443的離子丟失含氮雜環(huán)得到m/z165.0517 [M-CH2CHOHC6H11N]＋的碎片離子。此外，從二級(jí)質(zhì)譜圖上還能觀察到m/z121.1015 [M-C19H26O11]＋和m/z103.1434[M-C19H26O11-H2O]＋的碎片離子。結(jié)合正離子模式下的準(zhǔn)分子離子以及特征碎片離子信息，比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[18，20]可確定該化合物為莨菪烷類生物堿山莨菪堿，圖5為其可能的裂解規(guī)律。

圖5 山莨菪堿可能的裂解規(guī)律Fig 5 Proposed fragmentation pathways of anisodamine

3.2.3 黃酮類化合物 黃酮類化合物泛指兩個(gè)苯環(huán)通過中央三個(gè)碳原子互相連接而成的C6-C3-C6基本骨架的化合物，在其A環(huán)和B環(huán)上常有甲基或者甲氧基等官能團(tuán)，并且常與糖結(jié)合成苷。黃酮類化合物的主要裂解方式以糖苷鍵斷裂、RDA裂解、CO2、CO等中性離子丟失為主。鑒定出12個(gè)黃酮類化合物，主要來源于甘草和白芍。以化合物36為例，其保留時(shí)間為7.09 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z417.1188 [M-H]-，推斷其分子式為C21H22O9；二級(jí)質(zhì)譜圖中母離子從胃康靈膠囊水提液正負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖中共糖苷鍵斷裂得到m/z225.0658苷元離子碎片，苷元發(fā)生RDA裂解生成m/z135.8935和m/z119.0484的離子碎片。苷元丟失B環(huán)得到m/z161.0445的離子碎片。C環(huán)開環(huán)失去中性碎片C6H4O2得到m/z161.0445的離子碎片。結(jié)合正離子模式下的準(zhǔn)分子離子以及特征碎片離子信息，比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[14，21]可確定該化合物為黃酮類化合物甘草苷，圖6為其可能的裂解規(guī)律。

圖6 甘草苷可能的裂解規(guī)律Fig 6 Proposed fragmentation pathways of liquiritin

3.2.4 多酚及酯類化合物 從胃康靈膠囊水提液正負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖中共鑒定出10個(gè)多酚類化合物，主要為白芍和白及中所含化學(xué)成分。以化合物61為例，其保留時(shí)間為8.42 min，一級(jí)質(zhì)譜圖上可觀察到m/z771.2714 [M＋HCOO]-的準(zhǔn)分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜圖上觀察到m/z725.2658 [M-H]-1的離子碎片，推斷其分子式為C34H45O17；二級(jí)質(zhì)譜圖中母離子脫酯鍵依次得到m/z457.1712[M-C13H16O6-H]-、m/z439.1606 [MC13H16O6-H2O-H]-、m/z285.0968 [M-C13H16O6-H2O-C8H10O3-H]-、m/z189.0757 [M-2C13H16O6-H]-、m/z171.0649 [M-2C13H16O6-H2O-H]-的離子碎片。母離子糖苷鍵斷裂、有機(jī)酸酯鍵斷裂得到m/z295.1176 [M-C19H26O116-H]-的離子碎片，再脫去一分子H2O和兩分子的H得到m/z259.0970，緊接著失去中性分子C7H6O得到m/z153.0543的碎片離子。結(jié)合正離子模式下的準(zhǔn)分子離子以及特征碎片離子信息，比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[22-23]可確定該化合物為多酚及酯類化合物militarine，圖7為其可能的裂解規(guī)律。

圖7 Militarine可能的裂解規(guī)律Fig 7 Proposed fragmentation pathways of militarine

4 討論

參照胃康靈膠囊的制備工藝確定供試品溶液的提取方法[24]。胃康靈膠囊中白及、三七和海螵蛸為原粉入藥，甘草、白芍、茯苓和延胡索為水煎液濃縮干燥后入藥，顛茄以浸膏的形式入藥。其次，中藥制劑大多數(shù)以口服的形式給藥，故本試驗(yàn)以水為溶劑通過加熱回流對(duì)胃康靈膠囊中的化學(xué)成分進(jìn)行提取。通過分析裂解碎片信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，共鑒定出胃康靈膠囊中142個(gè)化學(xué)成分，同時(shí)對(duì)各類化學(xué)成分進(jìn)行歸屬，其中有24個(gè)來源于白芍，33個(gè)來源于甘草，13個(gè)來源于白及，20個(gè)來源于茯苓，19個(gè)來源于三七，14個(gè)來源于延胡索，21個(gè)來源于顛茄。

白芍含有揮發(fā)油類、單萜類及黃酮類等化合物，其中，白芍單萜類化合物芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷均具有較好的鎮(zhèn)痛作用，芍藥苷可通過抑制炎癥因子釋放緩解疼痛[25]。甘草含有三萜皂苷類、黃酮類、甘草多糖類等[16]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，芍藥甘草湯具有解除腸道平滑肌痙攣、調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)節(jié)律、保護(hù)胃黏膜等多種藥理作用[26]。

白及含有大量淀粉、葡萄糖和蒽醌類等化合物，此外還含有聯(lián)芐類、二氫菲類和聯(lián)菲類化合物，其中，1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（militarine）含量較高，為白及的主要活性成分，具有抗炎、舒張血管的作用[27]。茯苓含有三萜類、多糖類、甾體類等化合物，具促進(jìn)水液代謝、調(diào)節(jié)胃腸功能等藥理作用[28]。三七主要含有三萜皂苷、黃酮類等活性成分[29]，其中三萜皂苷類如人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1為其主要活性成分。

延胡索主要化學(xué)成分為生物堿，如小檗堿、延胡索乙素、延胡索甲素等，具有活血、行氣、止痛的功效[30]。海螵蛸含有碳酸鈣和殼角質(zhì)，具有中和胃酸、止痛的作用。顛茄浸膏含有山莨菪堿、氫化小檗堿等生物堿，具有消解平滑肌痙攣與止痛的作用[31]。

本文采用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)建立了一種高效、快速的定性分析方法，對(duì)胃康靈膠囊中的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒別分析。在鑒定得到的化合物中militarin、芍藥苷、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Re、甘草苷、甘草次酸、甘草酸和阿托品已被研究者選作指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定研究，用于控制胃康靈膠囊的質(zhì)量[6-7]。本文鑒定得到的化學(xué)成分可為進(jìn)一步明確胃康靈膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及選擇合理的質(zhì)控指標(biāo)提供參考依據(jù)。