番茄HMA 基因家族的鑒定及SlHMA1 鎘轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究

趙曜 文朗 駱少丹 栗子杏 劉超超

（江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212100）

番茄（Solanum lycopersicum L.）是我國(guó)重要的設(shè)施蔬菜作物，但在設(shè)施生產(chǎn)過(guò)程中，人們大量施用含重金屬的農(nóng)藥、化肥以及污水灌溉，使得設(shè)施土壤和蔬菜的鎘等重金屬污染問(wèn)題十分突出［1-3］。因此，研究并鑒定番茄中重金屬吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的關(guān)鍵基因?qū)τ诶矛F(xiàn)代分子育種技術(shù)培育低鎘積累番茄品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

植物主要通過(guò)多種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境中的各種金屬元素［4-6］。已經(jīng)報(bào)道的與重金屬運(yùn)輸有關(guān)的蛋白主要有ZIP 家族（Zn-regulated transporter and iron-regulated transporter-like）［7］、ABC 家族（ATP-binding cassette transporters）［8］、NRAMP家 族（natural resistance-associated macrophage protein）［9-10］、YSL 家族（yellow stripe-like transporter）［11］、MTP 家族（metal tolerance protein）［12］和P 型ATP 酶家族（P-type ATPases）等［13-14］。重金屬ATP酶（heavy metal ATPase,HMAs）也被稱(chēng)為P1B型ATP酶，屬于P 型ATP 酶家族中的一個(gè)亞類(lèi)，通過(guò)水解ATP 提供能量進(jìn)行金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)［15］。HMA 家族成員不僅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的金屬元素，如銅（Cu2+）、鋅（Zn2+）和鈷（Co2+）等，也吸收轉(zhuǎn)運(yùn)非必需的金屬元素，如鎘（Cd2+）和鉛（Pb2+）等［16］。不同的HMAs 對(duì)其底物金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)具有選擇性，基于此，HMAs 被分為2 個(gè)主要的亞類(lèi)，即Zn/Co/Cd/Pb P1B-ATPase 亞類(lèi)和Cu/Ag P1B-ATPase 亞類(lèi)［17］。目前，擬南芥（Arabidopsis thaliana）［15］、水稻（Oryza sativa）［18］、苜 蓿（Medicago truncatula）［19］、大 麥（Hordeum vulgar）［20］、芥菜（Brassica juncea）［21］等多個(gè)物種的HMA 家族成員已完成了基因組水平的系統(tǒng)鑒定，并且，擬南芥和水稻中分別鑒定到8 個(gè)和9 個(gè)HMA 家族成員，其中，AtHMA1-AtHMA4 和OsHMA1-OsHMA3 屬 于Zn/Co/Cd/Pb P1B-ATPase 亞類(lèi)，而AtHMA5-AtHMA8 和OsHMA4-OsHMA9 屬 于Cu/Ag P1B-ATPase 亞類(lèi)。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsHMA3 定位于液泡膜，能將Cd 隔離到根細(xì)胞液泡中，從而限制Cd 從水稻根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低Cd 在籽粒中的積累，同時(shí)也顯著增強(qiáng)了水稻的Cd 抗性，表明HMA 家族基因在低鎘積累作物品種選育方面具有重要的應(yīng)用潛力［22］。

目前，關(guān)于番茄SlHMAs 成員的系統(tǒng)鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道，SlHMAs 成員的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)活性，尤其是鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性及其在鎘脅迫響應(yīng)過(guò)程中的功能也尚未得到有效鑒定。

本研究將從全基因組水平鑒定番茄SlHMAs 基因家族成員，并對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件等特征進(jìn)行分析。此外，研究其在鎘脅迫下的基因表達(dá)響應(yīng)，并結(jié)合酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)，研究SlHMA1 在番茄鎘吸收過(guò)程中的重要功能，為解析番茄重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及番茄低鎘積累種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以番茄栽培品種‘Ailsa Craig’作為試驗(yàn)材料。番茄種子依次經(jīng)75%酒精消毒2 min、10%次氯酸鈉消毒15 min 后，用滅菌水清洗4 遍，之后播種于1/2 MS 培養(yǎng)基中垂直放置（培養(yǎng)皿長(zhǎng)×寬=15 cm×15 cm），待種子萌發(fā)7 d 后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、根長(zhǎng)在8 cm 左右的幼苗，移栽于水培箱中，以白色泡沫板和水培棉固定，以1/2 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每5 d 換一次營(yíng)養(yǎng)液。待番茄苗長(zhǎng)至4 葉一心期，以50 μmol/L CdCl2進(jìn)行處理，設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)，分別在處理0、1、3、5 和7 d 時(shí)取根系和葉片樣品，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 SlHMAs 家族成員鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析 從擬南芥TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)（www.arabidopsis.org/）和水稻數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.uga.edu/）分別下載擬南芥和水稻的全部HMA 成員的蛋白序列，從番茄數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http://solgenomics.net/）下載番茄的全基因組蛋白序列，利用TBtools 軟件的BLAST 功能，在番茄全基因組蛋白序列中同源比對(duì)獲得擬南芥和水稻全部HMA 成員的同源蛋白序列，進(jìn)一步在HMMER網(wǎng)站（http://hmmer.org/）和NCBI Batch CD-Search 工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)上一步得到的番茄HMA 候選蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，以至少包含E1-E2 ATPase domain（PF00122）、hydrolase domain（PF00702）及HMA domain（PF00403）中2 個(gè)以上結(jié)構(gòu)域的蛋白確定為HMA 家族基因。使用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）在 線(xiàn)工具分析SlHMAs 蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目、分子量和等電點(diǎn)。在WoLF PSORT 網(wǎng)站（https://wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.2.2 SlHMAs 家族基因染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及共線(xiàn)性分析 使用TBtools 軟件GFF3 gene position 工具繪制SlHMAs 家族基因在染色體上的位置；利用MEGA11 軟件Align by Clustal W 工具進(jìn)行蛋白多重序列比對(duì)，采用Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap 值設(shè)定為1 000；使用TBtools 軟件One step MCScanX 工具對(duì)SlHMAs 家族基因進(jìn)行共線(xiàn)性分析。

1.2.3 SlHMAs 基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序及啟動(dòng)子順式作用元件的分析 利用TBtools 軟件，分別從番茄基因組序列文件和基因注釋文件中篩選SlHMAs基因家族的DNA 和CDS 序列，利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http://gsds.gao-lab.org/）對(duì)SlHMAs 家族基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。利用MEME Suite 5.5.4（https://meme-suite.org/meme/）對(duì)SlHMAs蛋白進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè)，并利用TBtools 軟件對(duì)保守基序進(jìn)行可視化分析。

利 用TBtools 軟件提 取SlHMAs 基 因CDS 上游的2 000 bp 序列，通過(guò)PlantCare 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)順式作用元件。

1.2.4 RT-qPCR 檢測(cè)鎘脅迫下SlHMAs 的基因表達(dá)模式 采用總RNA 提取試劑盒（南京諾唯贊，貨號(hào)R401）提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊，貨號(hào)R312）反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，使用染料法定量PCR 檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊，貨號(hào)Q441）以番茄SlActin（Solyc04g011500.3.1）作為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ABI Step One Plus,USA），利用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR

1.2.5 酵母異源表達(dá)及鎘含量檢測(cè) 以正向引物序 列SlHMA1-F：5'-cgacgatgacgataaggtacctATGtct-GAAGCTCTGCGTCTTTCAAC-3'（下劃線(xiàn) 為Kpn I限制性酶切位點(diǎn)），和反向引物序列SlHMA1-R：5'-tgctggatatctgcagaattcTTACAAATGGGCTGCCTGAATGG-3'（下劃線(xiàn)為EcoR I 限制性酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增SlHMA1 的CDS 目的片段，將其與酵母表達(dá)載體pYES2/CT（Invitrogen，USA）同源重組（南京諾唯贊，貨號(hào)C112），獲得重組質(zhì)粒pYES2-SlHMA1，送上海生工測(cè)序驗(yàn)證。以測(cè)序正確的pYES2-SlHMA1質(zhì)粒為模板，以引物SlHMA1-451D-F：5'-CATAGTATTGCATTTGctAAAACTGGTACATTGACA-3' 和SlHMA1-451D-R：5'-TGTCAATGTACCAGTTTTag-CAAATGCAATACTATG-3' 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)Dpn I 酶消化去除模板質(zhì)粒，純化后進(jìn)行同源重組反應(yīng)，最后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序鑒定得到pYES2-SlHMA1D451A（D：Asp，天冬氨酸；A：Ala，丙氨酸）點(diǎn)突變質(zhì)粒。

采 用PEG/LiAC 轉(zhuǎn)化法 將pYES2、pYES2-Sl-HMA1 和pYES2-SlHMA1D451A分別轉(zhuǎn)化至酵母突變菌 株Δycf1 中（MATa、ura3Δ0、leu2Δ0、his3Δ1、met15Δ0、YDR135c∷kanMX4 購(gòu)買(mǎi)自南京瑞源生物技術(shù)有限公司），并涂布于SD/-Ura（Glu）固體培養(yǎng)基。經(jīng)PCR 鑒定陽(yáng)性克隆后，于SD/-Ura（Glu）液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600=1.0，離心收集細(xì)胞，用1×TE 梯度稀釋成10-1、10-2、10-3和10-4等4 個(gè)不同濃度，分別取5 μL 菌液點(diǎn)樣于SD/-Ura（Gal）和SD/-Ura（Gal）+20 μmol/L CdCl2固體培養(yǎng)基上，30℃黑暗培養(yǎng)48-72 h，觀(guān)察并拍照菌落生長(zhǎng)情況。另外，將上述3 組酵母菌加入40 mL SD/-Ura（Gal）+5 μmol/L CdCl2液體培養(yǎng)基中，調(diào)整初始OD600=0.05，置于30℃，200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48、60 和72 h 時(shí)測(cè)定菌液的OD600值，繪制其生長(zhǎng)曲線(xiàn)。另設(shè)一組，同上述處理，在48 h 時(shí)，收集菌體。菌體經(jīng)過(guò)4 次無(wú)菌去離子水洗后，在70℃烘干至恒重。然后，將干燥后的菌體稱(chēng)重，加入5 mL 的HNO3，再進(jìn)行180℃的消解。最后，使用NexlON?5000 ICP-MS（PerkinElmer,USA）測(cè)定樣品中的Cd 含量。

1.2.6 HMA1 在代表性物種中的進(jìn)化分析 以SlHMA1 的氨基酸序列為種子序列，在Phytozome 網(wǎng)站（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search）通 過(guò)BLAST 比對(duì)獲得各代表性物種中的同源基因序列，蛋白多重序列比對(duì)及保守氨基酸序列分析同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1 SlHMAs基因家族成員鑒定和理化性質(zhì)分析

利用擬南芥和水稻HMA 蛋白序列進(jìn)行BLAST和篩選，在番茄基因組中鑒定到8 個(gè)SlHMAs，這與擬南芥和水稻中的HMA 基因數(shù)量相近。為了確定其與擬南芥和水稻HMA 基因的進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)3 個(gè)物種HMAs 的蛋白序列全長(zhǎng)，利用MEGA11 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)它們的同源關(guān)系，8 個(gè)SlHMAs 依次命名為SlHMA1-SlHMA8，其中，沒(méi)有SlHMA2 的命名，而SlHMA5分為SlHMA5.1和SlHMA5.2兩個(gè)同源基因。與前人報(bào)道的擬南芥和水稻HMA 基因一致，8 個(gè)SlHMAs 也被劃分為2 個(gè)亞組，即分別為Zn/Cd/Co/Pb P1B-ATPase 亞組（SlHMA1 和SlHMA3）和Cu/Ag P1BATPase 亞組（SlHMA4-SlHMA8）（圖1）。

圖1 番茄、擬南芥和水稻HMA 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HMAs in tomato（Solanum lycopersicum L.）,Arabidopsis and rice（Oryza sativa）

蛋白理化性質(zhì)分析表明，番茄HMA 基因的氨基酸數(shù)目介于698-1 302，對(duì)應(yīng)的分子量介于76.04-140.44 kD，大多數(shù)SlHMAs 的等電點(diǎn)為5-6，為酸性蛋白，而SlHMA3 的等電點(diǎn)為6.94，SlHMA6和SlHMA1 則分別高達(dá)8.30 和8.44，為堿性蛋白。SlHMA3 的不穩(wěn)定指數(shù)較高，達(dá)45.63，因此，其蛋白穩(wěn)定性較差，而其他SlHMAs 的不穩(wěn)定指數(shù)均低于40，為穩(wěn)定蛋白。類(lèi)似地，大部分SlHMAs 都為弱疏水性蛋白（0.092-0.324），僅有SlHMA3 表現(xiàn)為弱親水性（-0.231）。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，SlHMA8、SlHMA6 和SlHMA1 定位于葉綠體，其他SlHMAs 含有6-10 個(gè)不等的跨膜結(jié)構(gòu)域，均定位于細(xì)胞質(zhì)膜上（表2）。

表2 SlHMAs 蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties of SlHMAs protein

2.2 SlHMAs染色體定位分析及物種間共線(xiàn)性分析

染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，8 個(gè)SlHMAs 不均勻分布于5 條染色體，其中第8 染色體最多，有3 個(gè)HMA基因，分別為SlHMA8、SlHMA5.1 和SlHMA5.2，其次第2 染色體有2 個(gè)HMA 基因，分別為SlHMA7和SlHMA1，其余3 個(gè)基因分別位于第1 染色體（SlHMA6）、第7 染色體（SlHMA3）和第11 染色體（SlHMA4）。從染色體定位圖也可看出，SlHMAs 大多位于染色體3'端，只有SlHMA3 位于5'端。另外，SlHMA5.1 和SlHMA5.2 以基因簇的形式存在于第8 染色體3'端，表明二者可能存在串聯(lián)重復(fù)事件（圖2）。

圖2 SlHMAs 家族成員的染色體定位Fig.2 Chromosomal localization of SlHMAs family memebrs

番茄與擬南芥、水稻基因組共線(xiàn)性分析表明（圖3），番茄各有3 個(gè)SlHMAs 與擬南芥和水稻存在共線(xiàn)性，其中，SlHMA5.1 和SlHMA7 在擬南芥和水稻中均存在直系同源基因，表明這兩個(gè)基因在雙子葉和單子葉植物進(jìn)化過(guò)程中較為保守。此外，SlHMA1 在擬南芥中、SlHMA6 在水稻中也各存在一個(gè)直系同源基因。

圖3 HMA 家族成員在番茄、擬南芥和水稻基因組中的共線(xiàn)性分析Fig.3 Collinearity analysis of HMAs among tomato,Arabidopsis,and rice

2.3 SlHMAs基因家族成員基因結(jié)構(gòu)和序列保守性分析

為了解SlHMAs 家族成員的基因結(jié)構(gòu)特征，對(duì)番茄、擬南芥和水稻HMA 基因的內(nèi)含子和外顯子進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，SlHMAs 序列長(zhǎng)度為3 458-21 556 bp，其中最長(zhǎng)的為SlHMA8，SlHMA6和SlHMA3 次之，最短的為SlHMA5.2。所有SlHMAs的CDS 均被數(shù)量不等的內(nèi)含子分隔成多個(gè)外顯子，外顯子數(shù)量為5-17 個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，除了SlHMA5.1、SlHMA5.2 和SlHMA4 的基因 長(zhǎng)度與其擬南芥和水稻中的同源基因類(lèi)似或更短外，其他SlHMAs 長(zhǎng)度均比其各自同源的AtHMAs 和OsHMAs更長(zhǎng)，尤其是SlHMA8 和SlHMA3，二者的基因長(zhǎng)度甚至超過(guò)其同源基因的2 倍?？傊?，SlHMAs 在外顯子長(zhǎng)度和內(nèi)含子數(shù)量等方面，與其同源的AtHMAs 和OsHMAs 無(wú)顯著差異，而內(nèi)含子長(zhǎng)度則是造成物種間同源基因的長(zhǎng)度產(chǎn)生顯著差異的主要原因（圖4-A）。

圖4 番茄、擬南芥和水稻HMA 家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析Fig.4 Gene structure and conserved motif analysis of HMAs in tomato,Arabidopsis,and rice

通過(guò)對(duì)蛋白保守基序的比較分析發(fā)現(xiàn)，所有的SlHMAs 中共存在5 個(gè)保守基序，其中，Cu/Ag P1B-ATPase 亞組的所有SlHMAs（除 了SlHMA4）和Zn/Cd/Co/Pb P1B-ATPase 亞組的SlHMA1/AtHMA1/OsHMA1 均含有全部5 個(gè)保守基序，而其中的SlHMA4 缺失基序4 和基序5；Zn/Cd/Co/Pb P1B-ATPase 亞組的其他HMA 都含有4 個(gè)保守基序（基序1-4），但其中SlHMA3 的同源蛋白AtHMA3 缺失基序4（圖4-B-C）。SlHMA4 與其同源基因在保守基序上的差異表明其在功能進(jìn)化上可能與其同源基因產(chǎn)生了分歧。

2.4 SlHMAs啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

如圖5 所示，番茄各個(gè)HMA 基因啟動(dòng)子均含有多個(gè)不同類(lèi)型的順式作用元件，其中光響應(yīng)順式作用元件數(shù)量最多，分布最為廣泛，在所有SlHMAs 啟動(dòng)子區(qū)均有分布，表明SlHMAs 均受光信號(hào)調(diào)控。此外，逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如厭氧誘導(dǎo)元件、干旱誘導(dǎo)元件、脫落酸（ABA）響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件也有廣泛分布，至少存在于5 個(gè)以上的SlHMAs 啟動(dòng)子中。而發(fā)育過(guò)程相關(guān)的元件，如生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、分生組織表達(dá)元件及細(xì)胞周期調(diào)控元件等數(shù)量較少，僅存在于少數(shù)幾個(gè)SlHMAs 啟動(dòng)子區(qū)。結(jié)果表明，SlHMAs 更多地參與抗逆反應(yīng)過(guò)程。

圖5 SlHMAs 家族成員的啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements in the promoter of SlHMAs

2.5 鎘處理下SlHMAs的表達(dá)量分析

為了探討SlHMAs 成員對(duì)Cd 脅迫的響應(yīng)特征，通過(guò)RT-qPCR 技術(shù)對(duì)其開(kāi)展研究。結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，在番茄根系或葉片中，幾乎所有SlHMAs 的表達(dá)水平都受鎘脅迫調(diào)控。具體而言，鎘脅迫下，SlHMA5.2和SlHMA7 在根系和葉片中均表達(dá)上調(diào)，而SlHMA5.1 在根系和葉片中表達(dá)均受到抑制。SlHMA1 和SlHMA8 在根和葉中的表達(dá)趨勢(shì)則相反，亦即在根中上調(diào)表達(dá)而在葉中下調(diào)表達(dá)。SlHMA4 和SlHMA6 則分別僅在葉片或根系中上調(diào)表達(dá)，而SlHMA3 在鎘脅迫初期上調(diào)表達(dá)，而在鎘脅迫后期其表達(dá)受到顯著的抑制。揭示SlHMAs 家族基因可能在番茄應(yīng)對(duì)鎘脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。

圖6 鎘脅迫下SlHMAs 家族成員在番茄根系和葉片中的表達(dá)模式Fig.6 Gene expression pattern of SlHMAs in the root and leaf of tomato under cadmium stress

2.6 SlHMA1鎘轉(zhuǎn)運(yùn)功能驗(yàn)證

基于以上RT-qPCR 結(jié)果，SlHMA1 的表達(dá)顯著受鎘脅迫調(diào)控，且SlHMA1 屬于Zn/Co/Cd/Pb P1B-ATPase 亞類(lèi)成員，推測(cè)其可能具有鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性，并在鎘脅迫中發(fā)揮重要作用。因此，克隆了SlHMA1 全長(zhǎng)CDS 序列，并轉(zhuǎn)化至酵母鎘敏感型突變體Δycf1 中。結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下，過(guò)表達(dá)SlHMA1 與轉(zhuǎn)入空載體（EV）的酵母菌株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)顯著差異。而在20 μmol/L CdCl2處理下，過(guò)表達(dá)SlHMA1 的酵母生長(zhǎng)明顯受到抑制，而轉(zhuǎn)入空載體的酵母菌則尚能正常生長(zhǎng)，表明SlHMA1 增強(qiáng)了酵母對(duì)鎘的敏感性（圖7-A）。在5 μmol/L CdCl2的液體培養(yǎng)基中，相比于轉(zhuǎn)入空載體的酵母菌，過(guò)表達(dá)SlHMA1 的酵母生長(zhǎng)也同樣受到顯著抑制（圖7-B）。收集酵母菌體，檢測(cè)鎘含量發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SlHMA1 顯著提高了酵母菌體內(nèi)的鎘含量，進(jìn)一步表明SlHMA1 具有鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性（圖7-C）。

圖7 SlHMA1 在酵母中的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析Fig.7 Cadmium-transporting activity of SlHMA1 in yeast

2.7 HMA1基因的進(jìn)化分析

鑒于SlHMA1 在酵母鎘轉(zhuǎn)運(yùn)和鎘抗性中的重要功能，在Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)氨基酸序列同源比對(duì)鑒定了22 個(gè)代表性植物物種中的SlHMA1 同源基因。結(jié)果表明，從低等的苔蘚植物（Marchantia polymorpha、Physcomitrella patens）、蕨類(lèi)植 物（Selaginella moellendorffii）到高等的被子植物（如大豆、苜蓿等）中，均廣泛存在SlHMA1 的同源基因，表明SlHMA1 在植物界中具有廣泛的保守性（圖8-A）。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，DKTGT 基序在所有代表性物種中高度保守（圖8-B）。把SlHMA1 中DKTGT 基序的磷酸化位點(diǎn)D（Asp,天冬氨酸）突變?yōu)锳（Ala，丙氨酸），并轉(zhuǎn)化酵母后發(fā)現(xiàn)，不同于野生型的SlHMA1，過(guò)表達(dá)SlHMA1D451A的酵母與轉(zhuǎn)化空載體的酵母相比，生長(zhǎng)狀況和體內(nèi)鎘含量均無(wú)顯著差異，說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)于SlHMA1 的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性也至關(guān)重要（圖7）。同時(shí)，結(jié)果也表明，保守基序DKTGT 中的天冬氨酸位點(diǎn)可能對(duì)植物界中所有HMA1 蛋白的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性都具有廣泛保守的功能。

圖8 HMA1 在23 個(gè)代表性植物物種中的進(jìn)化分析Fig.8 Evolutionary analysis of HMA1 in 23 representative plant species

3 討論

HMA 家族基因直接參與體內(nèi)多種重金屬離子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，是植物維持體內(nèi)重金屬離子平衡的一個(gè)重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。本研究以番茄這一果實(shí)模式植物為材料，從全基因組水平鑒定到8 個(gè)SlHMAs，這與前人在擬南芥（8 個(gè)）［15］、水稻（9 個(gè)）［18］、苜蓿（9個(gè)）［19］等二倍體植物中報(bào)道的數(shù)量相接近。有趣的是，它們基因組大小差異懸殊，分別為785 Mb［23］、135 Mb（www.arabidopsis.org/）、500 Mb（http://plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index）和410 Mb（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Mtruncatula_Mt4_0v1），表明HMA 家族基因數(shù)量與基因組大小無(wú)顯著正相關(guān)性。然而，在多倍體植物中，大豆（Glycine max，四倍體，20 個(gè)）［24］、油菜（Brassica napus，四倍體，31 個(gè)）［25］和芥菜（四倍體，27 個(gè)）［21］等的HMA 家族基因數(shù)量都遠(yuǎn)高于二倍體植物，表明染色體多倍化事件在HMA 家族基因數(shù)量擴(kuò)張過(guò)程中發(fā)揮更加重要的作用。

已有大量研究表明，外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)對(duì)于基因家族的進(jìn)化及內(nèi)部各成員之間的功能分化發(fā)揮重要的作用，而內(nèi)含子數(shù)量及長(zhǎng)度等對(duì)真核生物的基因表達(dá)也有至關(guān)重要的調(diào)控功能［26-28］。研究發(fā)現(xiàn)，在Cu/Ag P1B-ATPase 亞組內(nèi)各成員的內(nèi)含子數(shù)量為4-16 個(gè)不等，而內(nèi)含子長(zhǎng)度差異也較大，暗示該亞組內(nèi)的成員之間基因功能差異比較大。此外，大部分SlHMAs 的外顯子數(shù)量和長(zhǎng)度都與其擬南芥和水稻中同源基因較為接近，然而，SlHMAs 的內(nèi)含子長(zhǎng)度卻普遍長(zhǎng)于其同源基因，表明在物種進(jìn)化過(guò)程中，為適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境，番茄HMA 基因家族進(jìn)化出了更加復(fù)雜的功能和調(diào)控機(jī)制。

HMA 家族基因是一類(lèi)P1B型ATPase，在植物中通過(guò)水解ATP 提供能量，從而跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子［16］。進(jìn)化分析表明，擬南芥有4 個(gè)HMA 基因（AtHMA1-AtHMA4）屬于Zn/Co/Cd/Pb P1B-ATPase 亞類(lèi)，具有潛在的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性，然而，番茄僅有2 個(gè)HMA 基因（SlHMA1 和SlHMA3）屬于此亞組。已有大量研究表明，擬南芥、水稻、玉米和高粱等多個(gè)不同物種的HMA3 蛋白都定位于液泡膜，參與將根細(xì)胞中的Cd 區(qū)隔化到液泡中，從而緩解Cd 毒性，并限制Cd 從根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終提高植物的鎘耐受性［22,29-32］。基于此，推測(cè)SlHMA3 可能也發(fā)揮類(lèi)似的功能，然而該推測(cè)需要今后開(kāi)展更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。鎘脅迫下，SlHMA3 的基因表達(dá)在根系和葉片中都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明其可能存在復(fù)雜的反饋調(diào)控機(jī)制。相比而言，目前，關(guān)于HMA1 在鎘脅迫響應(yīng)過(guò)程中功能的研究則較為匱乏。酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)表明，SlHMA1 在酵母中過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了酵母對(duì)鎘的敏感性，同時(shí)酵母體內(nèi)鎘含量顯著增加，表明SlHMA1 具有鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性。擬南芥和伴礦景天（Sedum plumbizincicola）中的研究表明，HMA1 蛋白的保守基序DKTGT 中，磷酸化的天冬氨酸（Asp,D）位點(diǎn)對(duì)HMA1 的ATPase 酶催化活性和金屬轉(zhuǎn)運(yùn)活性至關(guān)重要［33-34］。將保守基序DKTGT 中的氨基酸D 突變成A 之后，SlHMA1 則喪失了其鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性。這與前人在伴礦景天中的研究結(jié)果一致［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，HMA1 在從低等的苔蘚植物到高等的被子植物中都廣泛存在，說(shuō)明其可能在早期的植物演化中就已經(jīng)存在，并且通過(guò)繁殖和遺傳機(jī)制得以保留，在幫助植物更好地適應(yīng)環(huán)境并存活過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。蛋白比對(duì)結(jié)果表明，SlHMA1 氨基酸序列中的保守基序DKTGT 在所有代表性物種中都高度保守，同時(shí)，番茄、擬南芥和水稻所有HMA 家族成員的保守基序motif 1 中也都存在DKTGT 基序。這一結(jié)果表明，ATP 水解酶活性相關(guān)的DKTGT 基序不僅對(duì)所有代表性物種中HMA1的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)活性至關(guān)重要，同時(shí)對(duì)HMA 家族其他成員的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)活性也至關(guān)重要。此外，鎘脅迫誘導(dǎo)SlHMA1 在根系中表達(dá)，抑制其在葉片中表達(dá)，而根系則是植物接觸并吸收鎘的主要部位，表明在遭受鎘脅迫時(shí)，SlHMA1 可能將更多的鎘固存于根系，同時(shí)減少葉片對(duì)鎘的吸收，從而減少鎘對(duì)葉片的毒害作用，保護(hù)葉片的正常生理功能和植株的存活，未來(lái)利用SlHMA1 過(guò)表達(dá)株系或功能缺失突變體等遺傳材料開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)將為該推測(cè)提供更加明確的證據(jù)?？傊狙芯繉樘剿鱄MA 基因家族在植物響應(yīng)重金屬脅迫過(guò)程中的分子機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)支撐，也將為利用基因編輯技術(shù)選育低鎘積累作物品種提供重要的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

番茄SlHMAs 具有HMA 家族基因的典型特征，同時(shí)也存在功能多樣性。SlHMAs 及其氨基酸保守基序DKTGT 與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)及鎘脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。