‘紅滿堂’蘋果MbbZIP43 基因的克隆與功能研究

楊艷 胡洋 劉霓如 殷璐 楊銳 王鵬飛 穆霄鵬 張帥 程春振 張建成

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801）

堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper,bZIP）家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［1］。其典型特征是包含高度保守且富含堿性氨基酸殘基的DNA 結(jié)合域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域［2］。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子通常以同源或異源二聚體形式結(jié)合到下游基因啟動(dòng)子的G-box、C-box 和ABRE 等元件上［3］，廣泛參與植物器官和組織的分化［4］、種子成熟［5］、光反應(yīng)［6］以及光信號(hào)調(diào)節(jié)［7］、抗逆防御［8］、ABA 信號(hào)傳導(dǎo)［9］和生物脅迫［10］等多種生物學(xué)過程。

花青素屬于類黃酮類化合物，通過苯丙烷代謝途徑合成。參與該途徑中的關(guān)鍵酶由早期生物合成基因（CHS、CHI、F3H 和F3'H）和晚期生物合成基因（F3',5'H、DFR、ANS 和UFGT 等）編碼［11-12］。研究表明，bZIP 在植物花青素等類黃酮類物質(zhì)的生物合成過程中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。其中，與植物光形態(tài)建成密切相關(guān)的bZIP 基因HY5（Elongated hypocotyl 5），在植物花青素合成中的調(diào)控作用在多種植物中被證實(shí)。例如擬南芥HY5 可通過結(jié)合PAP1 啟動(dòng)子區(qū)的G-box 和ACE 元件調(diào)節(jié)PAP1 基因的表達(dá)，進(jìn)而影響花青素生物合成［13］。桃PpHY5通過激活花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，來調(diào)節(jié)花青素積累［14］。梨PyHY5 通過與PyMYB10 和PyWD40 啟動(dòng)子的G-box 基序結(jié)合，增強(qiáng)它們的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)紅‘云紅梨1 號(hào)’果皮花青素的積累［15］。草莓FaHY5 與FaBBX22 相互作用促進(jìn)草莓果實(shí)花青素的積累［16］。過表達(dá)FaHY5-VP16 和FaBBX22 可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因草莓和擬南芥植株花青素的積累［17］。除HY5 外，其他bZIP 轉(zhuǎn)錄因子也被證實(shí)參與植物花青素合成調(diào)控。光照條件下，梨PybZIPa 通過與花青素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（PyMYB114、PyMYB10和PyBBX22）和結(jié)構(gòu)基因（PyUFGT）啟動(dòng)子上的G-box 元件結(jié)合調(diào)控它們的表達(dá)，從而促進(jìn)花青素的生物合成［18］。番茄SlAREB1 通過影響SlDFR 和SlF3'5'H 的表達(dá)調(diào)節(jié)幼苗花青素積累［19］。

蘋果（Malus spp.）屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）落葉喬木。根據(jù)葉片與果實(shí)形態(tài)結(jié)構(gòu)，蘋果屬植物可被分為真蘋果組、花楸蘋果組和移海棠組3 組。其中，由山荊子系（M.baccata（L.）Borkh.）和蘋果系（M.domesica Borkh.）組成的真蘋果組被研究最多。bZIP 在調(diào)控蘋果屬植物花青素合成中的作用已有報(bào)道，但多集中于真蘋果組蘋果系的栽培蘋果。如ABA 處理后，蘋果MdbZIP44可與花青素合成調(diào)控關(guān)鍵MYB 轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1互作，并增強(qiáng)其與下游靶基因啟動(dòng)子MdDFR 和MdUF3GT 的結(jié)合能力，進(jìn)而正調(diào)控花青素積累［20］。MdABI5 通過增強(qiáng)MdbHLH3 與MdMYB1 之間的相互作用，參與ABA 誘導(dǎo)的花青素生物合成調(diào)控［21］。MdbZIP23 可通過與編碼基因受ABA 強(qiáng)烈誘導(dǎo)的MdNAC1 互作，進(jìn)而促進(jìn)MdMYB10 和MdUFGT 的表達(dá)和花青素的積累［22］。目前尚無(wú)關(guān)于真蘋果組山荊子系bZIP 調(diào)控花青素相關(guān)的報(bào)道。

‘紅滿堂’蘋果系從‘舞美’蘋果（Malus×domestica Borkh.‘Maypole’）和‘山定子’（Malus baccata（L.）Borkh.）雜交F1代群體中選育的果肉全紅株系，其果實(shí)幼果期果皮和果肉均為紅色（俗稱“胎里紅”），至成熟期果皮和果肉轉(zhuǎn)為深紅色［23］。‘紅滿堂’果實(shí)富含花青素、類黃酮等物質(zhì)［24］，是研究蘋果花青素等黃酮類物質(zhì)代謝的理想材料。前期研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)‘紅滿堂’bZIP 基因（C1H46-028789），在果實(shí)成熟過程中差異表達(dá)顯著，且與花青素含量顯著相關(guān)［25］。本研究對(duì)該基因進(jìn)行克隆和序列分析，利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究其編碼蛋白亞細(xì)胞定位情況，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 研究其在不同成熟時(shí)期‘紅滿堂’果實(shí)中的表達(dá)情況，并對(duì)其表達(dá)水平與果實(shí)總黃酮、總酚、黃酮醇和花青素含量進(jìn)行相關(guān)性分析。此外，為驗(yàn)證該基因在花青素合成調(diào)控中的作用，構(gòu)建該基因的過表達(dá)載體，并基于煙草葉片、蘋果葉片和果實(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，研究其對(duì)花青素合成的影響。本研究可為揭示bZIP 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控‘紅滿堂’蘋果花青素生物合成中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘紅滿堂’蘋果果實(shí)采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所蘋果資源圃。于花后7 周（PS1）、11 周（PS2）、15 周（PS3）、19 周（PS4）、23 周（PS5）選取大小均勻一致、無(wú)病蟲害和機(jī)械傷的果實(shí)，液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩１臼蠠煵莺汀死夂Ｌ摹O果植株培養(yǎng)于人工培養(yǎng)室中，培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，濕度為80%-85%、光周期為光照16 h/黑暗8 h，光強(qiáng)為1 500 lx。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取及反轉(zhuǎn)錄 使用多糖多酚植物基因組DNA 提取試劑盒（天根）提取‘紅滿堂’果實(shí)gDNA。使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（離心柱型）（天根）提取5 個(gè)時(shí)期的‘紅滿堂’果實(shí)RNA，采用PrimeScriptTMII 1ststrand cDNA Synthesis（TaKaRa，大連）試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.2 基因全長(zhǎng)克隆與載體構(gòu)建 使用NCBI 設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物（表1）用于基因克隆。PCR 反應(yīng)體系：Dream TaqTMGreen PCR Master（2X）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，gDNA/cDNA 模板及上下游引物各1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。膠回收PCR 產(chǎn)物后進(jìn)行TA 克隆并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。將菌液PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步設(shè)計(jì)基因載體構(gòu)建的引物（表1）用于擴(kuò)增帶有同源臂序列基因，使用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的即用無(wú)縫克隆試劑盒連接到BamH I 和Spe I雙酶切的pBI123 載體，獲得35S∷MbbZIP43-GFP重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

表1 本研究所用引物信息Table 1 Information for the primers used in this study

1.2.3 生物信息學(xué)分析 從薔薇科基因組官網(wǎng)（https://www.rosaceae.org/）下載‘山荊子’蘋果基因組CDS、cDNA 和蛋白序列文件，利用TBtools［26］預(yù)測(cè)MbbZIP43 基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白理化性質(zhì)；利用CDD 在線網(wǎng)站進(jìn)行MbbZIP43 保守結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。參考劉嘉鵬等［27］的方法對(duì)MbbZIP43 進(jìn)行亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、蛋白磷酸化位點(diǎn)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)。從基因組提取MbbZIP43 起始密碼子上游2 000 bp 的序列的片段作為啟動(dòng)子，利用PlantCARE 預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子順式作用元件分布情況。利用NCBI BLASTP 搜索并下載MbbZIP43 同源蛋白，同時(shí)從NCBI 下載已報(bào)道花青素相關(guān)bZIP 蛋白序列，利用Jalview 繪制多序列比對(duì)圖；利用MEGA X 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（neighbor-joining tree,bootstrap 設(shè)定初始值為1 000次）；采用在線軟件MEME 分析MbbZIP43 保守基序（基序數(shù)目閾值設(shè)為15，其余為默認(rèn)值）；采用在線軟件TFBS 預(yù)測(cè)花青素合成結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。所用生物信息學(xué)網(wǎng)址信息如表2 所示。

表2 本研究所用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站信息Table 2 Information for the software used for the bioinformatic analysis in this study

1.2.4 亞細(xì)胞定位 分別將攜帶35S∷MbbZIP43-GFP 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600=0.8，6 000 r/min離心5 min 后棄上清液。隨后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染預(yù)培養(yǎng)24 h 的洋蔥表皮細(xì)胞，吸干菌液后培養(yǎng)于MS 培養(yǎng)基上，23℃下暗培養(yǎng)24-36 h 后，在正置熒光顯微鏡（Leica DM6B）下觀察GFP 熒光信號(hào)并拍照［28］。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）基于測(cè)序結(jié)果，使用Primer3（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)MbbZIP43 基因定量引物（表1）。RT-qPCR 反應(yīng)體 系：TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）熒光染料（TaKaRa）10 μL，ddH2O 7 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板1 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45 個(gè)循環(huán)。使用QuantStudio 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Ap-plied Biosystems）進(jìn)行RT-qPCR。以Actin 作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因在不同時(shí)期果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量［29］。使用SPSS 分析各樣品中MbbZIP43表達(dá)差異顯著性并使用Graphpad Prism 作圖。

1.2.6 總酚和黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定 將‘紅滿堂’果實(shí)樣品液氮速凍后研磨成粉末，取2.5 g 溶于10 mL 80%乙醇中，超聲提取15 min 后4℃條件下5 000 r/min 離心10 min 后收集上清液至25 mL 棕色容量瓶中，重復(fù)提取一次后定容至20 mL，即獲得提取液，用于總酚和總黃酮含量測(cè)定。總酚含量測(cè)定采用福林酚法，具體步驟參照Slinkard 和Singleton方法［30］。總黃酮含量測(cè)定參照Z(yǔ)heng 等［31］的方法。使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的黃酮醇含量測(cè)定試劑盒（分光光度計(jì)法）測(cè)定‘紅滿堂’果實(shí)總黃酮醇含量。花青素提取與測(cè)定參考仝月澳等［32］的方法。

1.2.7 MbbZIP43 基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 分別將攜帶35S∷MbbZIP43-GFP 重組質(zhì)粒和pBI123 空載體（EV）的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8，6 000 r/min 離心5 min后棄上清液。使用MES 緩沖液（含10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和200 μmol/L 乙酰丁香酮（AS），pH 為5.8 左右）重新懸浮，調(diào)節(jié)至OD600=0.8，然后于28℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)30 min 后用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化參照Wang 等［33］的方法。用針頭輕輕刺破本氏煙草的葉片，并用1 mL 注射器從背面注射40 μL 的農(nóng)桿菌菌液。隨后，將煙草移至培養(yǎng)室［（25±2）℃，相對(duì)濕度約80%］中暗培養(yǎng)2 d 后恢復(fù)正常光照，5 d 后測(cè)定葉片花青素含量。

采用真空滲透法進(jìn)行蘋果葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化［34］。將‘八棱海棠’葉片分別浸入攜帶35S∷MbbZIP43-GFP重組質(zhì)粒和pBI123 空質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染液中，真空滲透40 min 后使用濾紙吸干葉片表面菌液，平鋪于鋪有無(wú)菌水濕潤(rùn)的濾紙的培養(yǎng)皿上。暗培養(yǎng)1 d后恢復(fù)正常光照，9 d 后收集葉片用于RNA 提取和花青素含量測(cè)定。蘋果果實(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化參照An 等［35］的方法。使用1 mL 注射器注射50 μL 農(nóng)桿菌菌液至套袋未轉(zhuǎn)色的成熟‘嘎啦’蘋果，隨后將果實(shí)置于培養(yǎng)室［（25±2）℃，相對(duì)濕度約80%］暗培養(yǎng)2 d后恢復(fù)正常光照，5 d 后收集蘋果果皮用于RNA 提取和花青素含量測(cè)定。此外，為研究MbbZIP43 瞬時(shí)過表達(dá)影響蘋果花青素積累的機(jī)制，參照Yu 等［36］的方法利用RT-qPCR 分析蘋果葉片和果實(shí)中花青素合成結(jié)構(gòu)基因的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析，使用GraphPad Prism8 和Origin 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及圖形繪制。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆和序列分析結(jié)果

以gDNA 和cDNA 為模板均克隆獲得長(zhǎng)度為522 bp 的目的片段（圖1-A），說明該基因不含內(nèi)含子。該基因與基因組參考序列（C1H46-028789）存在4 個(gè)堿基差異，相似度達(dá)99.23%（圖1-B）。NCBI BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示，該基因與MdbZIP43（XP_008393381.1）的相似度最高（98.27%），故命名為MbbZIP43。

圖1 MbbZIP43 基因PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)（A）及序列比對(duì)（B）結(jié)果Fig.1 Electrophoresis detection（A）and sequence alignment（B）results of PCR products for the MbbZIP43

MbbZIP43 預(yù)測(cè)可編碼包含173 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，MbbZIP43 分子量為19.8 kD，等電點(diǎn)為7.93，脂肪系數(shù)為73.87，不穩(wěn)定系數(shù)為56.37，總平均親水性為-0.887，屬于不穩(wěn)定親水蛋白。MbbZIP43 不含信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，說明其屬于非分泌和非跨膜蛋白。CDD 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MbbZIP43 含有bZIP_plant_GBF1 結(jié)構(gòu)域。蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MbbZIP43 含有12 個(gè)絲氨酸、3 個(gè)蘇氨酸和1 個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MbbZIP43 二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（52.60%）、無(wú)規(guī)則卷曲（46.24%）、β-折疊和延伸鏈（各占0.58%）組成。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MbbZIP43 蛋白與桃環(huán)形結(jié)構(gòu)域蛋白（A0A2N517U0.1.A）的三維結(jié)構(gòu)最為接近，相似度為72.73%。

啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MbbZIP43啟動(dòng)子區(qū)含有8 種14 個(gè)光響應(yīng)相關(guān)元件（其中GT1-motif 元件有6 個(gè)，Box 4 元件有2 個(gè)，其余6種光響應(yīng)相關(guān)元件各1 個(gè)）、2 種生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件（分生組織表達(dá)和胚乳表達(dá)元件各1 個(gè)）、4 種激素相關(guān)元件（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件最多有4 個(gè)，其次是赤霉素響應(yīng)元件3 個(gè)，脫落酸和水楊酸響應(yīng)元件各1 個(gè)）和8 種20 個(gè)逆境響應(yīng)相關(guān)元件（包括防御脅迫元件8 個(gè)，其中包含4 個(gè)MYB 元件、2 個(gè)W box 元件、各1 個(gè)DRE core 元件和TC-rich repeat元件，干旱和高溫脅迫元件各4 個(gè)，傷害響應(yīng)元件2 個(gè)以及低溫和厭氧誘導(dǎo)元件各1 個(gè)）（表3）。

表3 MbbZIP43 啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Predicted cis-regulatory elements in the promoter region of MbbZIP43

利 用NCBI-blastp 對(duì)‘紅滿堂’MbbZIP43 同源蛋白進(jìn)行了搜索發(fā)現(xiàn)，MbbZIP43 蛋白與蘋果MdbZIP43、白梨PbbZIP43、沙梨PybZIP43、甜櫻桃PabZIP43、扁桃PdbZIP43 和桃PpbZIP43 相似度較高，分別為98.27%、94.80%、93.06%、81.50%、80.92%和80.92%。將MbbZIP43 同源蛋白及已報(bào)道的花青素合成相關(guān)bZIP 蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些bZIP 均具有典型的bZIP 保守結(jié)構(gòu)（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示（圖3），MbbZIP43 與MdbZIP43 親緣關(guān)系最近，與其他物種bZIP43 蛋白聚為一支；MdbZIP44 單獨(dú)一支，而已報(bào)道的花青素相關(guān)HY5蛋白聚為一支。

圖2 不同植物bZIP43 以及已知花青素調(diào)控相關(guān)bZIP 蛋白多序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Multiple sequence alignment results for bZIP43 proteins and bZIP proteins related to known anthocyanin biosynthesis from different plant species

圖3 不同植物bZIP 蛋白保守基序（A）及motif1 序列Logo 圖（B）Fig.3 Conserved motifs in bZIP proteins from different plant species（A）and sequence Logo for the motif1（B）

保守基序分析結(jié)果顯示（圖3），所有成員均含有motif1。PFAM 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，motif1 具有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈區(qū)域，說明motif1 對(duì)應(yīng)典型的bZIP保守結(jié)構(gòu)域。除RcbZIP43、MdbZIP44 和GbHY5 外，所有蛋白均含有motif6。進(jìn)化關(guān)系近的成員具有相似的保守基序，如所有bZIP43 蛋白均有motif1、motif2、motif3、motif4 和motif8，而所有的HY5 均含有motif1 和motif7，說明這些bZIP43 蛋白與HY5蛋白序列和保守基序存在較大差異。

2.2 MbbZIP43亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，MbbZIP43定位于細(xì)胞核。進(jìn)一步利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證該蛋白亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示，在瞬時(shí)表達(dá)35S∷MbbZIP43-GFP 融合蛋白的洋蔥表皮細(xì)胞中，僅在細(xì)胞核檢測(cè)到熒光信號(hào)；而瞬時(shí)表達(dá)35S∷GFP的洋蔥表皮細(xì)胞各部位均有熒光信號(hào)分布。

圖4 MbbZIP43 蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果Fig.4 Subcellular localization analysis results of Mbb-ZIP43 protein

2.3 MbbZIP43基因表達(dá)和相關(guān)性分析

利用RT-qPCR 研究MbbZIP43 在5 個(gè)發(fā)育時(shí)期‘紅滿堂’果實(shí)中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，該基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升后降的趨勢(shì)。在PS1 階段表達(dá)量最低，在PS2 階段表達(dá)量最高，其次為PS3 階段，分別是PS1 階段的7.11 和1.83 倍（圖5-A）。

圖5 不同發(fā)育時(shí)期‘紅滿堂’蘋果MbbZIP43 相對(duì)表達(dá)量、總酚含量、總黃酮含量、總黃酮醇含量和花青素含量Fig.5 Relative expressions of MbbZIP43,total phenol content,total flavonoid content,total flavonol content and anthocyanin content in ‘Hongmantang’ apple fruits at different ripening stages

隨著果實(shí)發(fā)育，‘紅滿堂’果實(shí)總酚含量呈下降趨勢(shì)，在PS1 階段含量最高（6.695 mg/g FW），PS5 含量最低（1.804 mg/g FW）（圖5-B）。總黃酮含量先上升后下降，在PS2 階段含量最高（4.800 mg/g FW），PS5 含量最低（0.644 mg/g FW）（圖5-C）?？傸S酮醇含量先下降后上升，在PS5 階段含量最高（4.629 mg/g FW），PS2 最低（1.450 mg/g FW）（圖5-D）?；ㄇ嗨睾砍省吧?降-升”的趨勢(shì)，在PS5 階段含量最高（24.065 OD·mL/100 g FW），在PS1 含量最低（13.478 OD·mL/100 g FW）（圖5-E）。

相關(guān)性分析結(jié)果（表4）顯示，‘紅滿堂’果實(shí)總黃酮含量與總黃酮醇含量顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)性系數(shù)為-0.97），與總酚含量正相關(guān)（0.69）。MbbZIP43表達(dá)量與總黃酮含量、花青素含量和總酚含量正相關(guān)，與總黃酮醇含量負(fù)相關(guān)，相關(guān)性均不顯著。

表4 MbbZIP43 基因表達(dá)水平與總黃酮、總酚、總黃酮醇和花青素含量相關(guān)性分析結(jié)果Table 4 Correlation analysis results among the MbbZIP43 expressions,total flavonoids content,total phenolic content,total flavonol content and anthocyanin content

2.4 MbbZIP43基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

為驗(yàn)證MbbZIP43 對(duì)花青素合成的調(diào)控作用，利用煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究其過表達(dá)對(duì)花青素積累的影響，結(jié)果（圖6-A）顯示，瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43基因的煙草葉片中花青素含量顯著高于空載對(duì)照（EV），較EV 提高了17.42%。進(jìn)一步利用‘八棱海棠’葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究其過表達(dá)對(duì)花青素積累的影響（圖6-B）發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43 基因的蘋果葉片中花青素含量顯著高于空載對(duì)照（EV）（圖6-D），較EV 提高了25.66%。利用‘嘎啦’蘋果果實(shí)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究其過表達(dá)對(duì)花青素的積累（圖6-C），結(jié)果（圖6-F）顯示，瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43 基因的蘋果果實(shí)花青素含量顯著高于空載對(duì)照（EV），較EV 提高了48.99%。

圖6 MbbZIP43 瞬時(shí)過表達(dá)對(duì)花青素積累的影響Fig.6 Influences of transient overexpression of MbbZIP43 gene on anthocyanin accumulations

瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43 的蘋果葉脈及蘋果果皮有較為明顯的顏色變化（圖6-B,C）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43 的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’蘋果果皮中MbbZIP43 基因的表達(dá)水平約為EV的28.12 倍和7.85 倍。利用RT-qPCR 進(jìn)一步研究了瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43 的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’果皮中花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因（CHI、F3'H、DFR和UFGT）的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’果皮中這些基因的表達(dá)量顯著提高。其中，‘八棱海棠’葉片中CHI、F3'H、DFR 和UFGT 分別提高了2.27 倍、1.84 倍、2.39倍和2.89 倍；‘嘎啦’果皮中CHI、F3'H、DFR 和UFGT 分別提高了1.79 倍、1.70 倍、1.35 倍和1.51 倍。說明瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43 對(duì)花青素積累的促進(jìn)作用是通過誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。通過預(yù)測(cè)這4 個(gè)花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子上TFBS 分布情況發(fā)現(xiàn)，CHI 和UFGT 啟動(dòng)子區(qū)均含有bZIP 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。過表達(dá)MbbZIP43 的‘八棱海棠’葉片和‘嘎啦’果皮中這兩個(gè)基因的上調(diào)倍數(shù)均較高，推測(cè)MbbZIP43 主要通過誘導(dǎo)它們的表達(dá)促進(jìn)花青素積累。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子在花青素生物合成過程中扮演著重要調(diào)控作用［37］。其中，被研究最多的當(dāng)屬M(fèi)YB、bHLH 和WD40 三類轉(zhuǎn)錄因子。這三類轉(zhuǎn)錄因子通過蛋白互作形成的MYB-bHLH-WD40（MBW）復(fù)合體被認(rèn)為在調(diào)控植物花青素合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［38］。栽培蘋果MdMYB1［39］、MdMYB10［40］和MdMYBA［41］被證實(shí)可以通過上調(diào)花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)促進(jìn)果皮花青素的積累。An 等［42］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MdMYC2 的‘Orin’愈傷組織中花青素生物合成基因MdDFR、MdUF3GT、MdF3H 和MdCHS 的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。WD40 蛋白對(duì)花青素的調(diào)控多需要同MYB 或bHLH 蛋白互作實(shí)現(xiàn)。如蘋果WD40 蛋白MdTTG1 與bHLH 互作進(jìn)而在調(diào)節(jié)花青素積累中發(fā)揮作用［43］。此外，MdHY5［44］和MdbZIP44［20］等bZIP 轉(zhuǎn)錄因子也被證實(shí)參與蘋果花青素合成調(diào)控。

3.1 MbbZIP43與花青素合成調(diào)控相關(guān)HY5蛋白序列存在較大差異

Li 等［45］研究表明PsbZIP43 可能通過調(diào)節(jié)花青素生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，參與‘黑寶石’李子果肉花青素的積累調(diào)控。本研究從‘紅滿堂’蘋果中克隆獲得一個(gè)CDS 長(zhǎng)為522 bp 的MbbZIP43 基因。序列比對(duì)結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白與PsbZIP43和蘋果、白梨、沙梨、甜櫻桃和桃的bZIP43 序列相似度均高于80%，且這些蛋白含有相同的保守基序。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，MbbZIP43 與蘋果和梨等薔薇科植物的bZIP43 聚為一類，說明它們?cè)谶M(jìn)化過程中高度保守且可能具有相似的功能。MbbZIP43 與已報(bào)道的調(diào)控花青素合成的bZIP 蛋白MdbZIP44 及HY5 均不聚在一支說明它們的功能和作用機(jī)制可能不同。

3.2 MbbZIP43的表達(dá)可能受光、逆境等多種因素影響

花青素的合成和積累受光照條件影響顯著。光照條件下，MdHY5 可直接與MdMYB1 啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)花青素的積累［44］。UV-B 處理被證實(shí)可以顯著促進(jìn)蘋果花青素積累。UV-B 處理后，受UV-B 誘導(dǎo)的MdWRKY72 基因的編碼蛋白可以通過調(diào)節(jié)MdHY5和MdMYB1 的表達(dá)來促進(jìn)花青素的積累［46］；An等［47］發(fā)現(xiàn)UV-B 處理誘導(dǎo)MdBBX22 的表達(dá)，該基因編碼的蛋白通過與MdHY5 互作增強(qiáng)MdHY5 與MdMYB10 和MdCHS 啟動(dòng)子的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致花青素積累。本研究發(fā)現(xiàn)，MbbZIP43 啟動(dòng)子上存在大量光響應(yīng)相關(guān)元件，暗示其可能參與光調(diào)控的蘋果花青素積累。

MeJA 和ABA 處理都可以促進(jìn)蘋果花青素的積累［48-49］。MbbZIP43 啟動(dòng)子上存在4 個(gè)MeJA 響應(yīng)相關(guān)元件和1 個(gè)ABA 響應(yīng)元件，說明其可能參與這兩種激素調(diào)節(jié)的花青素合成反應(yīng)。

大量研究表明花青素的生物合成受環(huán)境因素影響顯著［50］。Ubi 等［51］發(fā)現(xiàn)低溫可以顯著提高花青素生物合成結(jié)構(gòu)基因CHS、ANS 和UFGT 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)蘋果皮中花青素的積累；高溫抑制MdMYB10 的表達(dá)，導(dǎo)致花青素在蘋果皮中的生物合成和積累減少［52］；在干旱條件下，MdERF38 的過表達(dá)可通過提高花青素合成結(jié)構(gòu)基因（MdCHS、MdCHI、MdDFR 和MdUF3GT）的表達(dá)，促進(jìn)了花青素生物合成［53］。An 等［54］的研究指出機(jī)械傷誘導(dǎo)的花青素積累與MdWRKY40-MdMYB1 相互作用有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MbbZIP43 啟動(dòng)子上存在20 個(gè)逆境響應(yīng)相關(guān)元件，其中包括干旱和高溫脅迫元件各4 個(gè)，傷害響應(yīng)元件2 個(gè)以及低溫響應(yīng)元件1 個(gè)，說明該基因的表達(dá)可能受溫度、水分、機(jī)械傷等逆境環(huán)境影響。

3.3 MbbZIP43的表達(dá)水平與花青素含量正相關(guān)，瞬時(shí)過表達(dá)該基因可以促進(jìn)煙草葉片、蘋果葉片和蘋果果實(shí)花青素積累

通過分析MbbZIP43 基因在不同發(fā)育時(shí)期‘紅滿堂’果實(shí)中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，該基因隨著果實(shí)成熟呈先升后降的表達(dá)趨勢(shì)，表達(dá)水平與花青素含量呈正相關(guān)。瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，瞬時(shí)過表達(dá)該基因的煙草、蘋果葉片和果皮中花青素含量分別提高了17.42%、25.66% 和48.99%。CHS、CHI、F3'H、DFR、ANS 和UFGT 是花青素合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因［55-56］。An 等［20］發(fā)現(xiàn)MdbZIP44 通過上調(diào)花青素生物合成相關(guān)基因（MdDFR、MdUF3GT、MdF3H、MdCHI 和MdCHS）的表達(dá)來促進(jìn)蘋果果皮花青素積累。本研究通過利用RT-qPCR 研究瞬時(shí)過表達(dá)MbbZIP43 的蘋果葉片和蘋果果皮中花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，其過表達(dá)激活了CHI、F3'H、DFR 和UFGT 基因的表達(dá)，且對(duì)啟動(dòng)子區(qū)含有bZIP結(jié)合位點(diǎn)的CHI 和UFGT 基因的誘導(dǎo)效果顯著，說明MbbZIP43 可能通過上調(diào)它們的表達(dá)促進(jìn)蘋果花青素積累。

4 結(jié)論

從‘紅滿堂’蘋果中克隆獲得一個(gè)CDS 長(zhǎng)為522 bp 的bZIP 基因MbbZIP43。該基因的編碼蛋白定位于細(xì)胞核，與多個(gè)植物bZIP43 蛋白高度同源但與已報(bào)道的花青素合成調(diào)控相關(guān)HY5 蛋白序列差異較大。MbbZIP43 瞬時(shí)過表達(dá)可以顯著提高煙草葉片、蘋果葉片和蘋果果實(shí)花青素的積累，MbbZIP43瞬時(shí)過表達(dá)激活了花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因CHI 和UFGT 等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花青素的積累。