柴歸湯調(diào)控環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶B信號(hào)通路干預(yù)原發(fā)性高血壓大鼠作用機(jī)制

許欣穎,胡小海,朱紅俊

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院,江蘇 無(wú)錫 214071)

高血壓是冠狀動(dòng)脈疾病、心衰、腦卒中、外周血管疾病等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素,每年有850萬(wàn)人因高血壓死亡[1-3]。高血壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床需聯(lián)合使用多種單一機(jī)制的降壓藥物控制血壓水平,存在局限性及不良反應(yīng),且難以治愈[4]。中醫(yī)藥治療高血壓具有巨大潛力,中藥復(fù)方治療疾病具有“多成分”“多通路”“多靶點(diǎn)”協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì),并已獲得高質(zhì)量臨床證據(jù)[5-7]。本研究團(tuán)隊(duì)采用柴歸湯(小柴胡湯與當(dāng)歸芍藥散的合方)治療1-2級(jí)高血壓,取得一定臨床療效,且單用柴歸湯治療在降低舒張壓幅度方面優(yōu)于單純西藥治療[8]。第二信使cAMP對(duì)心血管系統(tǒng)的血管舒張、心室收縮、心肌肥厚、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等具有廣泛調(diào)節(jié)作用[9]。cAMP信號(hào)通路是否參與以及如何參與柴歸湯治療高血壓機(jī)制仍不清楚。本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探索柴歸湯對(duì)cAMP/AKT信號(hào)通路的干預(yù)及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證編號(hào) SCXK(滬) 2017-0005]購(gòu)買(mǎi)野生型Wistar-Kyoto大鼠(SPF級(jí))和原發(fā)性高血壓(Spontaneously hypertensive,SH)大鼠。在江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2017-0052]隨機(jī)分籠飼養(yǎng),每籠5只。SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)屏障環(huán)境,環(huán)境濕度維持在50%,溫度保持在25 ℃左右,進(jìn)食飲水自由。采用燈光控制系統(tǒng),每天50%光照與50%黑夜時(shí)間交替。

1.1.2 藥物與試劑:柴歸湯處方組成與劑量參照前期研究[10],柴胡、茯苓、生白術(shù)各60 g,北沙參、黃芩、生姜、當(dāng)歸、姜半夏各45 g,生白芍240 g,川芎、澤瀉各120 g,柴歸湯灌胃藥劑由無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。柴歸湯入腸代表性成分參照前期研究:柴胡皂苷A 0.15 mg/kg、毛蕊花糖苷5.09 mg/kg[11]。貝那普利(批號(hào)H20030514,規(guī)格10 mg/片)由無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院藥房提供。采用0.9%氯化鈉溶液配制成0.2 mg/ml溶液。大鼠cAMP、AKT、PKA ELISA試劑盒(批號(hào)20210627)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek Instruments公司);無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(美國(guó)IITC Life Science公司);冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);PEX100磷酸化抗體芯片檢測(cè)技術(shù)由上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥:將購(gòu)買(mǎi)的36只雄性原發(fā)性高血壓大鼠4周齡預(yù)適應(yīng)1周后(按照SPF級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性喂養(yǎng))。Wistar-Kyoto (WKY)大鼠6只,體重175 ～ 225 g,雄性,12周齡,購(gòu)自SPF(北京)生物技術(shù)有限公司,WKY大鼠為空白組,給予等體積0.9%氯化鈉溶液。所有原發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組、貝那普利組、柴歸湯高劑量、中劑量、低劑量組,柴歸湯入腸成分組,每組6只。貝那普利組劑量為6 mg/kg,柴歸湯高劑量組15 g/kg、柴歸湯中劑量組5 g/kg、柴歸湯低劑量組3 g/kg,將所有生藥的混合物在80 ℃的9倍熱水中浸泡1 h,然后在96 ℃的水中提取兩次(分別為4、2 h),噴霧干燥,制成干粉進(jìn)行灌胃。柴歸湯入腸成分組劑量為5.24 mg/kg。實(shí)驗(yàn)期間,大鼠自由獲取食物和水。干預(yù)期間,各組大鼠每天灌胃1次,連續(xù)干預(yù)4周,每周檢測(cè)1次血壓并記錄。

1.2.2 收縮壓與舒張壓檢測(cè):通過(guò)尾壓法測(cè)量大鼠的收縮壓和舒張壓,使用嚙齒動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血清cAMP、主動(dòng)脈組織AKT、PKA水平:大鼠禁食過(guò)夜后,麻醉處死,取部分血樣入普通試管,4 ℃下3000 r/min離心15 min分離血清。獲得的血清樣本保存在-80 ℃。快速收集部分主動(dòng)脈組織,4%多聚甲醛固定48 h用于組織病理學(xué)分析,收集剩余主動(dòng)脈組織,立即在-80 ℃冷凍。主動(dòng)脈組織取勻漿,設(shè)置參數(shù)1500 r/min,運(yùn)行20 s,間隔10 s,重復(fù)3次,于冷凍高速離心機(jī)離心20 min,12000 r/min,半徑12 cm,取上清。檢測(cè)全部在無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院心血管疾病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,采用酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.2.4 PEX100磷酸化抗體芯片檢測(cè)關(guān)鍵蛋白磷酸化:PEX100抗體芯片為信號(hào)通路廣篩抗體芯片,芯片上固定有識(shí)別多條信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的抗體,共1318種。該芯片上大部分抗體為配對(duì)抗體(584對(duì)),即每種磷酸化位點(diǎn)會(huì)有2種抗體共同檢測(cè),隨機(jī)選擇空白組、模型組和柴歸湯高劑量組的部分大鼠心肌組織進(jìn)行測(cè)定。使用Gene Pix Pro 6.0軟件讀取原始數(shù)據(jù),樣本內(nèi)磷酸化水平計(jì)算:同一樣本中,具有配對(duì)抗體的所有磷酸化位點(diǎn)蛋白,采用某位點(diǎn)磷酸化抗體信號(hào)值除以非磷酸化抗體信號(hào)值。組間磷酸化比值計(jì)算:在不同樣本比較中,采用實(shí)驗(yàn)組某位點(diǎn)磷酸化水平除以對(duì)照組該位點(diǎn)磷酸化水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠收縮壓、舒張壓比較 見(jiàn)表1。與模型組相比,柴歸湯低劑量、柴歸湯中劑量、柴歸湯高劑量組,柴歸湯入腸成分組及貝那普利組均可顯著降低原發(fā)性高血壓大鼠第4周的收縮壓和舒張壓(P<0.01)。

表1 各組大鼠干預(yù)4周后收縮壓及舒張壓比較(mmHg)

2.2 各組大鼠血清cAMP及主動(dòng)脈組織AKT、PKA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。與空白組相比,柴歸湯入腸成分組cAMP、柴歸湯低劑量、中劑量組PKA、貝那普利組AKT均有所升高(P<0.05)。與模型組相比,柴歸湯入腸成分組血清cAMP,柴歸湯高劑量組、柴歸湯中劑量組主動(dòng)脈組織AKT,柴歸湯中劑量組主動(dòng)脈組織PKA水平均顯著升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠干預(yù)4周后血清cAMP及主動(dòng)脈組織AKT、PKA比較

2.3 各組大鼠磷酸化抗體芯片檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)表3、4(圖1)。柴歸湯將eNOS Ser1177磷酸化水平從模型組的2.8倍回調(diào)至1.5倍,柴歸湯高劑量組AKT1 Thr450磷酸化修飾水平較模型組上調(diào)3.52倍,較空白組上調(diào)1.75倍。芯片上的每種抗體設(shè)置兩次技術(shù)重復(fù),以兩次技術(shù)重復(fù)校正信號(hào)值作后續(xù)分析。

圖1 各組大鼠AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位點(diǎn)免疫熒光圖

表3 各組大鼠干預(yù)4周后AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位點(diǎn)校正信號(hào)值比較

表4 各組大鼠干預(yù)4周后AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位點(diǎn)磷酸化比值比較

3 討 論

高血壓仍是全球心血管疾病死亡和殘疾的主要原因。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,高血壓歸屬于“頭痛”“眩暈”范疇,其病機(jī)主要與“風(fēng)、火、痰、虛、瘀”等有關(guān),病位與肝、脾、腎三臟關(guān)系密切,病因與情志、飲食、勞逸失常等相關(guān),病機(jī)多屬本虛標(biāo)實(shí),虛實(shí)夾雜[12-13]?！端貑?wèn)·至真要大論篇》提出“諸風(fēng)掉眩,皆屬于肝”,黃莉等[14]總結(jié)當(dāng)代名醫(yī)經(jīng)驗(yàn),提出調(diào)整肝的陰陽(yáng)平衡是中醫(yī)治療高血壓的關(guān)鍵樞紐。團(tuán)隊(duì)基于龍砂醫(yī)派和仝小林院士“三期六態(tài)”高血壓診治體系學(xué)術(shù)思想提出了高血壓的新分型,其中體型正?；蛳莸母哐獕喝巳憾x為厥陰型[15-16]。厥陰型高血壓患者常多血少氣,常有疲倦乏力、面黃無(wú)華、水腫貌等特征,脈象平弦或浮弦,為肝失疏泄,水液運(yùn)輸不利而致,針對(duì)厥陰型高血壓,團(tuán)隊(duì)選用柴歸湯治療,柴歸湯由小柴胡湯和當(dāng)歸芍藥散合方而成,具有疏利氣機(jī),調(diào)暢肝氣,活血利水之功[16-17]。日本漢方RCT循證醫(yī)學(xué)報(bào)告提出《傷寒雜病論》經(jīng)典方劑小柴胡湯、當(dāng)歸芍藥散是治療高血壓等循環(huán)系統(tǒng)疾病的常用有效方劑[18]。柴歸湯治療高血壓,已經(jīng)取得較好的臨床療效[8]。團(tuán)隊(duì)通過(guò)UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法解析了柴歸湯的功效成分;并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究,柴歸湯能明顯降低原發(fā)性高血壓和高血壓大鼠[19]的血壓,參與調(diào)控原發(fā)性高血壓的RAAS平衡及磷脂代謝[10-11]。本研究通過(guò)對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠cAMP信號(hào)通路檢測(cè),進(jìn)一步探索cAMP信號(hào)通路對(duì)柴歸湯干預(yù)高血壓的作用機(jī)制。

目前認(rèn)為,血管內(nèi)皮通過(guò)釋放各種生化因子來(lái)維持血管張力,調(diào)節(jié)下層血管平滑肌的收縮和松弛行為,調(diào)節(jié)炎癥,免疫調(diào)節(jié),血小板聚集和血栓形成,其機(jī)制與激活負(fù)責(zé)一氧化氮(NO)產(chǎn)生的內(nèi)皮一氧化氮合酶 (eNOS)有關(guān)[20]。eNOS磷酸化是血管舒張的分子開(kāi)關(guān),缺乏eNOS基因的大鼠可表現(xiàn)出血壓水平升高和內(nèi)皮依賴性血管松弛功能喪失[21-22]。eNOS 磷酸化通過(guò) PPAR-γ-eNOS、氧化應(yīng)激、Rho途徑、PI3K/Akt等信號(hào)途徑調(diào)節(jié)NO[23]。NO通過(guò)介導(dǎo)血管舒張,降低血管阻力,從而降低血壓,促進(jìn)血管重塑[24]。

環(huán)狀3',5'-腺苷單磷酸(cAMP)是許多器官中的主要第二信使,在工作心肌中,cAMP可以激活蛋白激酶A(PKA)以介導(dǎo)各種生物學(xué)效應(yīng),包括心臟重塑和肥大[25-26]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果示,柴歸湯入腸成分組cAMP與模型組、空白組相比顯著增加,柴歸湯低劑量、中劑量組較模型組明顯升高主動(dòng)脈組織中PKA水平。cAMP/PKA/eNOS信號(hào)傳導(dǎo)被證明可增強(qiáng)缺血部位的內(nèi)皮祖細(xì)胞募集,誘導(dǎo)內(nèi)皮分化,促進(jìn)新生血管形成[27]。磷酸化抗體芯片檢測(cè)結(jié)果顯示,柴歸湯將eNOS Ser1177磷酸化水平從正常的2.8倍回調(diào)到1.5倍。eNOS Ser1177的過(guò)度磷酸化可能是原發(fā)性高血壓的代償反應(yīng),報(bào)道指出eNOS從產(chǎn)生心臟保護(hù)性NO切換到產(chǎn)生細(xì)胞毒性超氧化物和二級(jí)活性氧,導(dǎo)致內(nèi)皮功能嚴(yán)重喪失[28]。柴歸湯通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS Ser1177的過(guò)度磷酸化更有利于促進(jìn)血管舒張而降低血壓,并減少過(guò)氧化對(duì)血管內(nèi)皮的危害。

本研究發(fā)現(xiàn),柴歸湯中劑量、高劑量組及貝那普利組均可顯著升高大鼠主動(dòng)脈組織AKT水平,PEX100磷酸化抗體芯片檢測(cè)示AKT1 Thr450磷酸化修飾水平上調(diào)3.52倍。而AKT通過(guò)誘導(dǎo)eNOS絲氨酸1177位點(diǎn)(Ser1177)磷酸化,導(dǎo)致eNOS活性增加,實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟的保護(hù),cAMP/PI3K/AKT通路與PKA/eNOS通路可協(xié)同調(diào)節(jié)內(nèi)皮血管生成[29-30]。例如西洛他唑通過(guò)cAMP/PKA和PI3K/AKT依賴性eNOS激活機(jī)制誘導(dǎo)NO產(chǎn)生,從而促使人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成[31]。有研究發(fā)現(xiàn)PKA與AKT可形成物理復(fù)合物,且AKT作為PKA的底物參與調(diào)節(jié),免疫共沉淀結(jié)果示AKT和PKA與eNOS的存在相互作用關(guān)系[29,32]。與此同時(shí),cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)可以激活PI3K的p85α亞基并觸發(fā)AKT激活,抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,同時(shí)維持增殖,對(duì)血管損傷起到保護(hù)作用[33]。筆者推測(cè)柴歸湯降壓機(jī)制可能與cAMP/PKA,cAMP/PI3K/AKT協(xié)同激活eNOS調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能有關(guān),但未測(cè)PI3K水平是一個(gè)遺憾,值得未來(lái)進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及磷酸化芯片抗體檢測(cè),柴歸湯能夠顯著降低原發(fā)性高血壓大鼠血壓,其降壓機(jī)制可能與cAMP/AKT、cAMP/PKA通路對(duì)eNOS的協(xié)同作用有關(guān)。