右美托咪定對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響

王磊，吳海龍，張金強(qiáng)

中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心麻醉科，北京 102209

椎間盤(pán)退變是慢性腰痛的常見(jiàn)原因，主要原因?yàn)樗韬碎L(zhǎng)期慢性勞損、反復(fù)外力刺激，導(dǎo)致髓核水分流失嚴(yán)重，進(jìn)而出現(xiàn)變性改變，臨床表現(xiàn)為腰背部或頸部疼痛、感覺(jué)異常及活動(dòng)障礙等［1］。椎間盤(pán)受損后易引起形態(tài)學(xué)改變，有研究顯示，炎性微環(huán)境改變是椎間盤(pán)疼痛的主要原因，而白細(xì)胞介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞損傷是其主要病理特征，進(jìn)而介導(dǎo)椎間盤(pán)髓核細(xì)胞再生、衰老、凋亡和炎癥反應(yīng)等過(guò)程，加速疾病進(jìn)展［2-3］。右美托咪定（Dex）是臨床常用的麻醉藥，具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抑制術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)等作用，現(xiàn)階段主要用于麻醉誘導(dǎo)、急危重癥鎮(zhèn)痛、減少術(shù)后躁動(dòng)等［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，Dex通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶通路可減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、外基質(zhì)降解和炎癥損傷［5］。但有關(guān)Dex 對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞損傷的影響尚不清楚。2021 年10 月—2022 年11 月本研究通過(guò)建立體外細(xì)胞模型模擬椎間盤(pán)退變，以探究Dex 對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人髓核細(xì)胞購(gòu)自武漢賽奧斯生物科技有限公司；胎牛血清、杜氏改良依格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibo公司；Dex購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；外源性IL-1β 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒、凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-8、IL-6 試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒購(gòu)自上海科艾博生物科技有限公司；B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病2（Bcl-2）抗體、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）抗體、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體、環(huán)氧化酶2（COX-2）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人髓核細(xì)胞于恒溫水浴鍋中解凍，復(fù)蘇后，將細(xì)胞加至含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞生長(zhǎng)融合至90%，加胰酶消化傳代培養(yǎng)；取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 將生長(zhǎng)良好的髓核細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（Control 組）、IL-1β 組、IL-1β+Dex-L組、IL-1β+Dex-M 組、IL-1β+Dex-H 組。Control 組不做任何處理，其他組依次給予10 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β+25 nmol/L Dex、10 ng/mL IL-1β+50 nmol/L Dex、10 ng/mL IL-1β+100 nmol/L Dex，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT 法。收集各組細(xì)胞并將其接種96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24、48 h，加MTT 試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加150 μL 的二甲基亞砜試劑，結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm 處的吸光度值（OD 值），細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷緩沖液洗滌細(xì)胞，并調(diào)整至1×105/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，加磷脂結(jié)合蛋白V FITC和碘化丙啶各5 μL，避光孵育15 min，繼續(xù)加400 μL 細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡率（%）=（早期凋亡數(shù)+晚期凋亡數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 TNF-α、IL-8、NO、IL-6 檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法。取各組細(xì)胞，4 ℃下4 000 r/min 離心8 min（離心半徑12 cm）后取細(xì)胞上清液，按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)TNF-α、IL-8、NO、IL-6因子表達(dá)。

1.7 Bcl-2、Bax、iNOS、COX-2 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。檢測(cè)收集各組細(xì)胞，用蛋白裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA 法檢測(cè)定量后，將50 μg上樣蛋白通過(guò)電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加5%脫脂奶粉封閉培養(yǎng)120 min，與Bcl-2、Bax、iNOS、COX-2 一抗在4℃下過(guò)夜孵育，次日與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育120 min。最后加ECL 試劑顯影，ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。服從正態(tài)分布計(jì)量資料以-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dex 對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)后髓核細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)表1。

表1 各組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞存活率比較（%，-x ± s）

2.2 Dex 對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)后髓核細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

2.3 Dex 對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)后髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞上清液中炎癥因子水平比較（pg/mL，-x ± s）

2.4 Dex 對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)后髓核細(xì)胞中COX-2、iNOS蛋白表達(dá)及上清液中NO水平的影響 見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞中COX-2、iNOS蛋白表達(dá)及上清液中NO水平比較（-x ± s）

3 討論

研究顯示，約40%椎間盤(pán)退變患者會(huì)出現(xiàn)下腰痛，而10%患者長(zhǎng)期處于殘疾狀態(tài)。椎間盤(pán)主要由中間凝膠狀的髓核細(xì)胞及包繞周圍的11～15層同心纖維層組成，通過(guò)軟骨終板與上下椎體相互連接，三者之間共同構(gòu)成人體脊柱的基本緩沖和承重單元［6-7］。當(dāng)椎間盤(pán)發(fā)生退變時(shí)，可引起椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中釋放大量炎癥因子，如IL-1β、TNF-α、IL-8 等［8］，激烈炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞合成能力減弱，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致髓核細(xì)胞過(guò)度病變，最終加速椎間盤(pán)退變［9-10］。髓核細(xì)胞含有豐富蛋白多糖、水分和Ⅱ型膠原，其保水能力對(duì)抵抗脊柱壓縮軸向力至關(guān)重要，并維持椎間盤(pán)正常高度。已有研究證明，髓核細(xì)胞代謝失衡、凋亡和炎癥反應(yīng)等與椎間盤(pán)退變密切相關(guān)［11］。IL-1β是生物體常見(jiàn)細(xì)胞因子，幾乎所有核細(xì)胞中都能合成IL-1β，其主要來(lái)源于活化的單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，其在免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、化合物代謝調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，若機(jī)體內(nèi)IL-1β出現(xiàn)失衡，可誘導(dǎo)多種病理生理變化，如膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、椎間盤(pán)退變等炎性疾?。?2-14］。本研究用多功能因子IL-1β處理髓核細(xì)胞以建立椎間盤(pán)退變體外模型，且多數(shù)研究已證明該細(xì)胞模型可成功模擬椎間盤(pán)退變［15-16］。本研究顯示，IL-1β可減弱細(xì)胞存活，并加速細(xì)胞凋亡，這與楊利斌等［16］研究報(bào)道一致，證明模型構(gòu)建成功。

Dex 屬于高效選擇性受體激動(dòng)劑，具有多種功效，除鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用外，還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用［17］。YOSHIKAWA 等［18］報(bào)道稱，Dex 還可通過(guò)激活膽堿能的抗炎通路，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞中炎癥因子合成，進(jìn)而抑制全身炎癥反應(yīng)。近年Dex因具有細(xì)胞保護(hù)作用被廣泛關(guān)注，其對(duì)心臟、腎臟、肝臟及腦等具有保護(hù)作用［19］。于芝等［20］在膝骨關(guān)節(jié)炎中研究發(fā)現(xiàn)，Dex 可減輕炎癥誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞自噬和凋亡。邢丹丹等［21］通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Dex 介導(dǎo)炎癥經(jīng)典信號(hào)通路，進(jìn)而抑制佐劑性膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞滑膜樣凋亡。但其對(duì)椎間盤(pán)退變的實(shí)驗(yàn)研究還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度Dex 處理IL-1β 誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞后，可呈濃度依賴性升高細(xì)胞存活率，并降低細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。表明Dex 可減輕IL-1β 誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

研究顯示，炎癥因子改變與椎間盤(pán)退變發(fā)展具有重要臨床意義，當(dāng)椎間盤(pán)發(fā)生病變時(shí)，可促進(jìn)髓核細(xì)胞釋放較多TNF-α、IL-6 等因子［22］。本研究證實(shí)，IL-1β 處理髓核細(xì)胞可促進(jìn)大量炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8 表達(dá)，可見(jiàn)，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中，炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子增加是其必經(jīng)過(guò)程。持續(xù)神經(jīng)根和脊髓壓迫，可激活iNOS產(chǎn)生大量NO，進(jìn)一步加重受傷區(qū)域中iNOS 表達(dá)，誘導(dǎo)髓核細(xì)胞過(guò)度凋亡，加重椎間盤(pán)退化［23］。COX-2 是一種炎癥反應(yīng)介質(zhì)，是炎癥因子較為重要的一種，COX-2 可催化生成前列腺素含量，進(jìn)而減少蛋白多糖含量，以促進(jìn)椎間盤(pán)退變［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β 誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞可上調(diào)COX-2、iNOS蛋白表達(dá)，并促進(jìn)NO合成，經(jīng)Dex干預(yù)后，可降低COX-2、iNOS 蛋白表達(dá)，減少NO 合成及TNF-α、IL-6、IL-8 釋放，提示Dex 可減輕IL-1β 誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

綜上所述，Dex 可抑制IL-1β 誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，有助于延緩椎間盤(pán)退變疾病進(jìn)展。但本研究側(cè)重于體外細(xì)胞模型研究，下一步可通過(guò)建立椎間盤(pán)退變大鼠模型，體內(nèi)觀察Dex 對(duì)椎間盤(pán)退變大鼠髓核細(xì)胞損傷的影響，以驗(yàn)證本結(jié)論。