安羅替尼通過NF-κB信號通路對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響

柳新，謝云鵬，張圣林，李青山，董怡

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，河北 承德 067000；2 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤之一，具有惡性程度高、發(fā)展速度快的特點(diǎn)［1］。目前臨床上治療腦膠質(zhì)瘤通常以手術(shù)切除為主，放化療為輔。但腦膠質(zhì)瘤患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，錯過最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)，而放化療易出現(xiàn)毒副反應(yīng)。因此亟需尋找更有效的治療藥物。安羅替尼是一種口服多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，對血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）和血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等激酶有抑制作用，可通過抑制與癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路，多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞的抑制作用［2-3］。核因子κB（NF-κB）是哺乳動物體中一種極為重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 信號通路參與調(diào)控多種與炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫、凋亡、細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)［4-5］。阻斷NF-κB 信號通路能夠預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥、增殖、凋亡等惡性行為［6］。但目前關(guān)于安羅替尼通過NF-κB 信號通路與腦膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系尚未清晰。2022年2月—2023年2月，本研究將對此展開探討，旨在為腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（T98G 細(xì)胞）購自上海中科院細(xì)胞庫。安羅替尼和NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8 試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司，5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細(xì)胞增殖檢測試劑盒和Hoechst33258 染色液均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（NF-κB p65）及β-actin 單克隆抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 及山羊抗鼠IgG 多克隆抗體購于英國Abcam 公司。DYCZ-24KF 型四板垂直蛋白電泳儀購于北京六一生物科技有限公司，DM IL LED 熒光顯微鏡購于德國徠卡公司，THZ-98A 型二氧化碳培養(yǎng)箱購于上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，F(xiàn)luorChem HD2 型凝膠成像系統(tǒng)購于美國Proteinsimple公司。

1.2 T98G 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的T98G 細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后（≥80%密度）接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2、70%～80%濕度培養(yǎng)箱中，在完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM-H）中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù) 將T98G細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、5 μmol/L 安羅替尼組、10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組、抑制劑組。對照組不予干預(yù)，5 μmol/L 安羅替尼組、10 μmol/L安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組分別以5、10、20 μmol/L 安羅替尼進(jìn)行干預(yù)，陽性藥物組以50 mg/L 的5-氟尿嘧啶進(jìn)行干預(yù)。用CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，因10 μmol/L 安羅替尼組細(xì)胞活力接近對照組的50%，因此抑制劑組加入10 μmol/L 安羅替尼+5 μmol/L NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，后置于37 ℃，5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8 法。將細(xì)胞接種于96孔板中，1×104/孔。分別加藥處理24 h后，各孔加入10% CCK-8 溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm 處的光密度（OD450）值。細(xì)胞活力（%）=［OD（實(shí)驗(yàn)組或抑制劑組或陽性藥物組）-OD空白組］/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.5 細(xì)胞增殖率測算 采用EdU 法。取培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，按照EdU 試劑盒說明書操作，反應(yīng)完成后裝片，并在熒光顯微鏡下拍照，用Image J 軟件處理圖片。細(xì)胞增殖率=EdU陽性染色細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡率測算 采用Hoechst33258染色法。取各組細(xì)胞，用PBS 將細(xì)胞洗滌2 次，每次5 min，加入4%多聚甲醛，在4 ℃條件下固定10 min。用PBS洗滌后，用 5 mg/L Hoechst33258染色液染色10 min，隨后洗滌，封片，置熒光顯微鏡下拍照。細(xì)胞凋亡特征為核體積發(fā)生濃縮變小，且染色不均勻濃染同時(shí)有較強(qiáng)的熒光，為亮藍(lán)色。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting 法。取培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，提取蛋白并定量后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA 電流轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，后加入Cyclin D1（1∶5 000）、Caspase-3（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）及β-actin（1∶5 000）一抗進(jìn)行孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌，加顯影液，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行相應(yīng)的拍照記錄，并用ImageJ 軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，β-actin 為內(nèi)參蛋白。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較 對照組、5 μmol/L 安羅替尼組、10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組細(xì)胞活力分別為（100.00 ±9.36）%、（86.90 ± 2.59）%、（55.47 ± 3.43）%、（42.37 ± 3.75）%、（41.97 ± 2.89）%。5 μmol/L 安羅替尼組細(xì)胞活力與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組比較，10、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組細(xì)胞活力低（P均＜0.05）。10 μmol/L安羅替尼組細(xì)胞活力接近50%。

2.2 安羅替尼對T98G細(xì)胞增殖率的影響 與對照組比較，10 μmol/L安羅替尼組、20 μmol/L安羅替尼組、陽性藥物組細(xì)胞增殖率低、凋亡率高（P均＜0.05）；與陽性藥物組比較，10 μmol/L安羅替尼組細(xì)胞增殖率高、凋亡率低（P均＜0.05），20 μmol/L安羅替尼組細(xì)胞增殖率、凋亡率與陽性藥物組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；與10 μmol/L安羅替尼組比較，抑制劑組細(xì)胞增殖率低、凋亡率高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率比較（%，± s）

表1 各組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率比較（%，± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與陽性藥物組比較，P＜0.05；與10 μmol/L安羅替尼組比較，#P＜0.05。

細(xì)胞凋亡率5.11 ± 1.18 14.33 ± 1.53*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png27.09 ± 2.11*27.05 ± 2.65*37.33 ± 2.08#組別對照組10 μmol/L安羅替尼組20 μmol/L安羅替尼組陽性藥物組抑制劑組細(xì)胞增殖率55.93 ± 3.23 44.40 ± 4.19*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png26.87 ± 3.68*26.47 ± 2.53*19.10 ± 2.35#

2.3 安羅替尼對T98G 細(xì)胞中Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組Caspase-3 蛋白表達(dá)高，Cyclin D1 蛋白表達(dá)低（P均＜0.05）；與陽性藥物組比較，10 μmol/L 安羅替尼組Caspase-3 蛋白表達(dá)低，Cyclin D1 蛋白表達(dá)高（P均＜0.05）；20 μmol/L 安羅替尼組Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達(dá)與陽性藥物組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；與10 μmol/L 安羅替尼組比較，抑制劑組Caspase-3 蛋白表達(dá)高，Cyclin D1 蛋白表達(dá)低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達(dá)比較（± s）

表2 各組Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與陽性藥物組比較，P＜0.05；與10 μmol/L安羅替尼組比較，#P＜0.05。

Cyclin D1蛋白1.02 ± 0.08 0.86 ± 0.06*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png0.51 ± 0.03*0.51 ± 0.04*0.12 ± 0.03#組別對照組10 μmol/L安羅替尼組20 μmol/L安羅替尼組陽性藥物組抑制劑組Caspase-3蛋白0.41 ± 0.02 0.81 ± 0.04*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png1.23 ± 0.06*1.22 ± 0.04*2.05 ± 0.11#

2.4 安羅替尼對T98G 細(xì)胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，10 μmol/L 安羅替尼組、20 μmol/L 安羅替尼組、陽性藥物組NFκB p65 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)低（P均＜0.05）；與陽性藥物組比較，10 μmol/L 安羅替尼組NF-κB p65 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)高（P＜0.05）；20 μmol/L 安羅替尼組NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白與陽性藥物組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；與10 μmol/L安羅替尼組比較，抑制劑組NF-κB p65 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），p-NF-κB p65蛋白表達(dá)低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（± s）

表3 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與陽性藥物組比較，P＜0.05；與10 μmol/L安羅替尼組比較，#P＜0.05。

p-NF-κB p65蛋白0.80 ± 0.06 0.51 ± 0.02*images/BZ_11_559_1087_587_1120.png0.37 ± 0.02*0.38 ± 0.02*0.08 ± 0.01#組別對照組10 μmol/L安羅替尼組20 μmol/L安羅替尼組陽性藥物組抑制劑組NF-κB p65蛋白1.02 ± 0.06 1.02 ± 0.08 1.02 ± 0.08 1.03 ± 0.08 1.08 ± 0.05

3 討論

與正常腦組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織因邊界不明，手術(shù)難度較高，導(dǎo)致腫瘤無法完全切除，極易復(fù)發(fā)，放化療又易產(chǎn)生較大不良反應(yīng)［7］。因此，探索有效治療腦膠質(zhì)瘤的藥物并明晰其相關(guān)作用機(jī)制具有非常重要的意義。安羅替尼是一種多靶點(diǎn)的酪氨酸酶抑制劑，具有高選擇性以及強(qiáng)效抑制的特點(diǎn)［8］。安羅替尼可以通過調(diào)控與癌細(xì)胞生長、分化相關(guān)的信號通路直接抑制癌細(xì)胞，對腫瘤血管的生成和生長有較強(qiáng)的抑制作用［9］。HE 等［10］研究表明，安羅替尼可抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡；安羅替尼也可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡［11］。吳廣銀等［12］研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。增殖與凋亡相關(guān)因子Cyclin D1 可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期；而Caspase-3 作為一種半胱氨酸蛋白酶，與細(xì)胞的凋亡具有緊密聯(lián)系。蘇俊玲等［13］報(bào)道，Cyclin D1 蛋白可通過干擾細(xì)胞周期進(jìn)而影響癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，10、20 μmol/L 安羅替尼組和陽性藥物組細(xì)胞活力、增殖率、Cyclin D1 蛋白表達(dá)低，凋亡率、Caspase-3 蛋白表達(dá)高；與陽性藥物組比較，10 μmol/L 安羅替尼組增殖活力、增殖率和Cyclin D1 蛋白表達(dá)高，凋亡率和Caspase-3 蛋白表達(dá)低；20 μmol/L 安羅替尼組與陽性藥物組比較細(xì)胞活力、增殖率、凋亡率、Cyclin D1和Caspase-3蛋白表達(dá)均無顯著差異。說明高濃度安羅替尼對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用與陽性藥物5-氟尿嘧啶相當(dāng)，這與相關(guān)研究［14］相符。結(jié)果提示安羅替尼可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

NF-κB 作為對細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的因子，對腫瘤血管生成也同樣重要。NF-κB信號通路和腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡關(guān)系密切，在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。王文忠等［15］研究表明，NF-κB信號通路能夠影響鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中NF-κB 信號通路出現(xiàn)過激活現(xiàn)象［16］。安羅替尼可通過降低p-NF-κB p65表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用［17］。在本研究中為避免細(xì)胞死亡太多干擾實(shí)驗(yàn)，選取了細(xì)胞活力接近50%的10 μmol/L 安羅替尼加入NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082 驗(yàn)證NF-κB 通路的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制劑組較10 μmol/L安羅替尼組細(xì)胞增殖率、Cyclin D1 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)低，而細(xì)胞凋亡率和Caspase-3 水平較10 μmol/L 安羅替尼組高。抑制劑能夠抑制NF-κB 通路活性，但該通路并未被完全阻斷。本研究在安羅替尼基礎(chǔ)上加入NF-κB通路抑制劑后與單獨(dú)安羅替尼組相比，作用被進(jìn)一步加強(qiáng)，說明安羅替尼與BAY 11-7082可能具有協(xié)同作用，提示安羅替尼可能通過抑制NF-κB 通路信號抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，安羅替尼可能通過抑制NF-κB 信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤T98G 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。但安羅替尼在腦膠質(zhì)瘤中的作用是否與其他機(jī)制有關(guān)，尚需進(jìn)一步深入探究。