二氫楊梅素對(duì)LPS/ATP誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的影響及機(jī)制

喬秀梅，厲彥翔，薛彩彩，陳心茹，袁浩銘，王金紅

山東第二醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山東 濰坊 261053

研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體是機(jī)體抵抗外源病原體感染和消除內(nèi)源危險(xiǎn)因子刺激的重要免疫屏障［1］。我們前期研究結(jié)果表明，NLRP3 炎癥小體的異常活化可觸發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［2-4］。二氫楊梅素（DHM）是一類廣泛存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中的黃酮類化合物［5］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DHM 能夠抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)脂代謝，具有潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［6-7］。然而，DHM是否通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化進(jìn)而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用尚未見(jiàn)報(bào)道。2021 年12 月—2022 年12 月，我們?cè)诩韧芯炕A(chǔ)上觀察DHM 對(duì)脂多糖（LPS）/三磷酸腺苷（ATP）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 DHM 由上海源葉生物科技有限公司提供；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自American Type Culture Collection（ATCC，CRL-1730）；LPS、ATP購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich 公司；DMEM/F-12 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（caspase-1）、接頭蛋白ASC（CARD）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、β-actin、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體（IgG-HRP）等抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；NLRP3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；IgG-FITC抗體購(gòu)自武漢Abbkine公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVEC 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔24 h換1次完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用0.25%胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、DHM 組。DHM 組給予不同濃度（25、50、100 μmol/L）DHM 預(yù)孵育細(xì)胞1 h，正常對(duì)照組加入100 μL 培養(yǎng)基，其余各組每孔加入100 μL 0.5 μg/mL 的LPS 刺激細(xì)胞3.5 h，加入5 mmol/L ATP處理細(xì)胞30 min。

1.4 NLRP3、ASC、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1 前體蛋白（pro-caspase-1）、剪切體半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（cleaved caspase-1）、SIRT1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取各組細(xì)胞加入RIPA裂解液冰浴裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量BCA 試劑盒定量后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分離目的蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜以5%脫脂牛奶封閉后，加入NLRP3（1∶4 000）、ASC（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、SIRT1（1：1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗，室溫下孵育2 h 后顯影。以β-actin 為內(nèi)參，Quantity One軟件分析NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 SIRT1的功能分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，基因本體論（GO）分析包括生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）；京都基因與基因組百科全書（KEGG）進(jìn)行通路富集分析。采用人工注釋轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（TRRUST）中轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析SIRT1調(diào)控的靶基因并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 SIRT1 的定位檢測(cè) 采用免疫熒光法。取各組細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定，以0.3% Triton X-100透化30 min，正常山羊血清封閉。加入適量SIRT1（1∶50）一抗，4 ℃避光孵育過(guò)夜，IgG-FITC 抗體室溫避光孵育2 h，DAPI 染液染細(xì)胞核后于熒光顯微鏡（×200）下觀察。用ImageJ 軟件分析細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.7 DHM 與SIRT1 的作用模式檢測(cè) 采用分子對(duì)接分析。將蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中SIRT1蛋白的三維結(jié)構(gòu)作為受體模板并進(jìn)行必要的修飾，用Sybyl-X 2.0 軟件Surflex-Dock模塊分析DHM與SIRT1的作用模式。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1 蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，LPS/ATP 組NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 蛋白表達(dá)高（P均＜0.05）；與LPS/ATP 組比較，各DHM 組NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 蛋白表達(dá)低（P均＜0.05）。各組pro-caspase-1 蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)比較（± s）

表1 各組NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與LPS/ATP組比較，#P＜0.05。

組別空白對(duì)照組LPS/ATP組LPS/ATP+25 μmol/L DHM組LPS/ATP+50 μmol/L DHM組LPS/ATP+100 μmol/L DHM組cleaved caspase-1蛋白0.44 ± 0.06 0.71 ± 0.06*0.60 ± 0.02#0.44 ± 0.02#0.42 ± 0.05#NLRP3蛋白0.11 ± 0.01 0.15 ± 0.01*0.12 ± 0.01#0.10 ± 0.01#0.11 ± 0.01#ASC蛋白0.98 ± 0.08 1.55 ± 0.10*1.33 ± 0.10#1.00 ± 0.08#0.92 ± 0.08#pro-caspase-1蛋白2.31 ± 0.03 2.26 ± 0.20 2.25 ± 0.05 2.12 ± 0.04 2.23 ± 0.06

2.2 SIRT1 的功能 GO 富集分析結(jié)果：BP 富集結(jié)果顯示與對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)等生物過(guò)程聯(lián)系密切；CC富集結(jié)果顯示與染色質(zhì)沉默復(fù)合體等密切相關(guān)；MF 富集結(jié)果顯示與染色質(zhì)DNA 結(jié)合等分子功能有關(guān)（圖1A）。KEGG通路富集分析結(jié)果：SIRT1涉及長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)（圖1B）。SIRT1對(duì)IL-1β等靶基因有調(diào)控作用，見(jiàn)圖1C。

圖1 SIRT1的功能分析

2.3 各組SIRT1的定位與表達(dá)比較 SIRT1主要分布于細(xì)胞核內(nèi)?？瞻讓?duì)照組、LPS/ATP 組、LPS/ATP+100 μmol/L 相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為1.00 ±0.04、0.63 ± 0.05、0.97 ± 0.05。與空白對(duì)照組比較，LPS/ATP 組相對(duì)熒光強(qiáng)度弱（P＜0.05）；與LPS/ATP 組比較，LPS/ATP+100 μmol/L DHM 組相對(duì)熒光強(qiáng)度強(qiáng)（P＜0.05）。

2.4 各組SIRT1蛋白表達(dá)比較 空白對(duì)照組、LPS/ATP 組、LPS/ATP+25 μmol/L DHM 組、LPS/ATP+50 μmol/L DHM 組、LPS/ATP+100 μmol/L DHM 組SIRT1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.37 ± 0.05、0.97 ±0.07、0.94 ± 0.09、1.10 ± 0.06、1.42 ± 0.07。與空白對(duì)照組比較，LPS/ATP 組SIRT1 蛋白表達(dá)低（P＜0.05）；與LPS/ATP 組、LPS/ATP+25 μmol/L DHM組比較，LPS/ATP+50 μmol/L DHM 組、LPS/ATP+100 μmol/L DHM組SIRT1蛋白表達(dá)高（P均＜0.05）。

2.5 DHM 與SIRT1的作用模式 DHM 可有效嵌入SIRT1（受體生物大分子）的“活性口袋”。見(jiàn)圖2。

圖2 DHM與SIRT1活性結(jié)合區(qū)域的分子對(duì)接

3 討論

NLRP3 炎癥小體的異?；罨烧T發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與一系列心血管疾病的發(fā)病過(guò)程［8-9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)血脂藥物非諾貝特、煙酸等均通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮心血管保護(hù)作用［10-11］。本研究探討DHM 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 炎癥小體活化是否存在調(diào)控作用，并觀察DHM可能的初步作用機(jī)制，旨在為臨床預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化以及DHM的開發(fā)提供思路。

研究表明，在血管損傷的早期階段血管內(nèi)膜中存在模式識(shí)別受體NLRP3 的表達(dá)增加［12］。本研究中，LPS/ATP 能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 蛋白高表達(dá)，而DHM 顯著下調(diào)LPS/ATP 誘導(dǎo)的NLRP3 表達(dá)。ASC 作為NLRP3 炎癥小體的接頭蛋白，是炎癥小體多蛋白復(fù)合體組裝和下游促炎細(xì)胞因子IL-1β成熟所必需的［13］。本研究結(jié)果顯示，DHM 可抑制LPS/ATP 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ASC 表達(dá)，表明DHM能夠抑制LPS/ATP 誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化。眾所周知，NLRP3 炎癥小體通過(guò)誘導(dǎo)無(wú)活性的pro-caspase-1 剪切為有活性的cleaved caspase-1，進(jìn)而激活下游的炎癥反應(yīng)［14］。因此，為進(jìn)一步研究DHM對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的影響，本研究同樣檢測(cè)了caspase-1 的蛋白表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)DHM 顯著抑制cleaved caspase-1 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步確認(rèn)了DHM 對(duì)NLRP3 炎癥小體活化的抑制作用。前期研究證實(shí)，半必需氨基酸精氨酸通過(guò)靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的異常活化發(fā)揮獨(dú)立抗炎作用［15］。以上研究表明，DHM 可能通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 炎癥小體活化進(jìn)而發(fā)揮潛在的心血管保護(hù)作用。

研究證實(shí)，SIRT1 已成為防治心血管疾病的重要靶點(diǎn)［16-19］?；贕O 富集分析結(jié)果提示SIRT1 與染色質(zhì)DNA 結(jié)合等分子功能有關(guān)；進(jìn)一步進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果提示，SIRT1 在脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路發(fā)揮重要作用。TRRUST 數(shù)據(jù)庫(kù)在疾病關(guān)鍵基因篩選和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控關(guān)系分析中廣泛應(yīng)用［20-21］。本研究結(jié)果顯示，NLRP3 炎癥小體活化標(biāo)志物IL-1β可能是SIRT1的靶基因。但是，DHM 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的作用是否與調(diào)控SIRT1表達(dá)有關(guān)尚不清楚。前期研究結(jié)果表明，SIRT1 在TNF-α 刺激的血管外膜成纖維細(xì)胞中低表達(dá)［22］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS/ATP 刺激同樣抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1 表達(dá)，而DHM 可明顯上調(diào)LPS/ATP刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，甘草苷通過(guò)調(diào)控氧化型低密度脂蛋白刺激的血管平滑肌細(xì)胞SIRT1 表達(dá)治療冠心病［23］。另有研究報(bào)道，柚皮素通過(guò)激活SIRT1 進(jìn)而延緩高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的血管衰老和病理進(jìn)程［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，DHM 能夠明顯逆轉(zhuǎn)LPS/ATP誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)下調(diào)。更重要的是，DHM 可能結(jié)合到SIRT1 的“活性口袋”進(jìn)而增加DHM 與SIRT1 活性區(qū)域結(jié)合的可能性。研究證實(shí)，DHM 可增加高膽固醇飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈SIRT1 的表達(dá)［25］。提示DHM 可能通過(guò)上調(diào)SIRT1 表達(dá)發(fā)揮潛在的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，DHM可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化，機(jī)制可能與上調(diào)SIRT1 表達(dá)有關(guān)。本研究豐富了藥食同源茶品藤茶主要活性成分DHM 作用的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵，也為DHM 的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了新思路。