微小RNA-125a-5p對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

萬(wàn)芳竹，張浩炯，張宗璞

1 上海市質(zhì)子重離子醫(yī)院放療科 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，上海 201321；2 上海市放射腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 上海質(zhì)子重離子放射治療工程技術(shù)研究中心；4 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科

鼻咽癌（NPC）是原發(fā)于鼻咽部的一類惡性腫瘤，好發(fā)于亞洲東部及南非，我國(guó)兩廣地區(qū)高發(fā)［1-2］。早期NPC對(duì)放療較為敏感，隨著疾病進(jìn)展，化療及手術(shù)等手段也納入治療策略。雖然NPC的治療手段不斷發(fā)展，但由于NPC細(xì)胞有著較高的增殖能力，仍有部分患者在放療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)［3］，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗。微小RNA（miR）是一類小的非編碼RNA，其在多種惡性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4-5］。miR-125a 位于11、19、21 號(hào)染色體上，并與多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移密切相關(guān)［6］。研究表明miR-125a 與NPC 化療敏感性相關(guān)［7］。含PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）是Hippo通路中的關(guān)鍵分子，可調(diào)控組織穩(wěn)態(tài)［8］。TAZ 表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［9］。miR-125a 可直接調(diào)控TAZ 表達(dá)，從而影響乳腺癌細(xì)胞增殖和存活［10］。而二者在NPC 細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系及其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響尚不明確。2022 年8 月—2023 年6 月，本研究探討miR-125a 及其潛在下游靶點(diǎn)TAZ 在NPC細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞系（HK-1細(xì)胞）及人胚腎細(xì)胞永生化細(xì)胞系（293T 細(xì)胞）均儲(chǔ)存于上海市質(zhì)子重離子臨床技術(shù)研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室。CCK-8 試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；TAZ 抗體、GAPDH 抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司。B76707 流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Cytoflex 公司，TOUCH 凝膠電泳成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司，Cytation 3 酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Cytation 公司，定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)QuantaStudio公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HK-1 細(xì)胞及293T 細(xì)胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加100 U/mL 青霉素及100 mg/mL 鏈霉素。培養(yǎng)箱溫度37 ℃，CO2含量5%。待細(xì)胞達(dá)到可傳代密度（80%～90%）時(shí)，用0.25%胰蛋白酶液消化細(xì)胞，以1∶3比例傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 待HK-1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，將細(xì)胞接種于六孔板中，取部分細(xì)胞并隨機(jī)分為對(duì)照1 組、過(guò)表達(dá)miR-125a 組（轉(zhuǎn)染miR-125a mimics）、沉默miR-125a 組（轉(zhuǎn)染miR-125a inhibitor）；另取部分細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照2 組、miR-125a 過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-125a mimics）及回補(bǔ)組（轉(zhuǎn)染miR-125a mimics 同時(shí)過(guò)表達(dá)TAZ）。依據(jù)說(shuō)明書(shū)所示步驟用Lipofectamine ?3000 試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h 后檢測(cè)miR-125a表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 miR-125a-5p、TAZ mRNA檢測(cè) 采用RT-qPCR法。用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后，進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系共25 μL：cDNA 模板2 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 12.4 μL，上下游引物各1 μL，無(wú)酶水8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 40 s、60 ℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-125a-5p 上游引物5'-GGTCATTCCCTGAGACCCTTTAAC-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；TAZ 上游引物5'-ACCCACCCACGATGACCCCA-3'，下游引物5'-GCACCCTAACCCCAGGCCAC-3'；miR-125a-5p的對(duì)照U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGATTTGCGT-3'；TAZ 的對(duì)照GAPDH 上游引物5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3'，下游引物5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'。用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 TAZ 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。將各組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用RIPA 試劑將細(xì)胞裂解，用BCA 法評(píng)估蛋白濃度。加入上樣緩沖液并將蛋白于100 ℃下變性10 min。各組蛋白上樣于SDS PAGE 凝膠，電泳后，再將凝膠附于PVDF膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。封閉液封閉1 h，將膜置于TAZ 一抗（1∶1 000）4 ℃下過(guò)夜。將膜洗滌，置于二抗中室溫孵育1.5 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法來(lái)觀察蛋白條帶。通過(guò)ImageJ 軟件分析蛋白條帶的強(qiáng)度并加以量化統(tǒng)計(jì)。

1.6 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) CCK-8實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種于96孔板中，調(diào)整為每孔3×103個(gè)細(xì)胞，并培養(yǎng)過(guò)夜使其貼壁生長(zhǎng)。之后每孔加入CCK-8 溶液10 μg/mL，并將96 孔板放入培養(yǎng)箱，37 °C 溫度下避光孵育1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（OD450值）。集落形成實(shí)驗(yàn)：將每組細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液，接種于六孔板中，每孔細(xì)胞調(diào)整為1 000 個(gè)。將各組細(xì)胞培養(yǎng)約14 d，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保所形成集落包含50 個(gè)以上細(xì)胞。PBS 洗滌各孔3 次，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，用0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞，對(duì)每個(gè)孔中的細(xì)胞集落進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.7 miR-125a 與TAZ 的靶向關(guān)系分析 通過(guò)預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan（http：//www. targetscan. org/）和miRDB（http：//mirdb.org/）預(yù)測(cè)miR-125a 與TAZ 的結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，pGL3-TAZ 和pGL3-mutTAZ 報(bào)告基因載體質(zhì)粒均由Bio-Asia公司（中國(guó)）建立。將293T細(xì)胞隨機(jī)分為4 組：WT+miR-ctrl 組共轉(zhuǎn)染TAZ 野生型（TAZWT）和miR-125a 空載對(duì)照（miR-ctrl）、Mut+miR-ctrl組共轉(zhuǎn)染TAZ 突變型（TAZ-MUT）和miR-ctrl、WT+miR-125a 組共轉(zhuǎn)染TAZ-WT 和miR-125a 模仿物（miR-125a）、Mut+miR-125a 組共轉(zhuǎn)染TAZ-MUT 和miR-125a，轉(zhuǎn)染48 h 后，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞分解，用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)報(bào)告蛋白的活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.00 軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 對(duì)照1組、過(guò)表達(dá)miR-125a組、沉默miR-125a 組miR-125a 的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ±0.15、1.61 ± 0.11、0.68 ± 0.16，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2 miR-125a對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 各組轉(zhuǎn)染后第2、3、4、5、6天細(xì)胞增殖活力比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表1。對(duì)照1 組、過(guò)表達(dá)miR-125a組、沉默miR-125a 組集落形成數(shù)分別為（108.00 ±11.14）、（73.33 ± 12.34）、（266.67 ± 36.50）個(gè)，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表1 各組不同時(shí)間的增殖活力（± s）

表1 各組不同時(shí)間的增殖活力（± s）

組別對(duì)照1組過(guò)表達(dá)miR-125a組沉默miR-125a組OD450值轉(zhuǎn)染后第1天0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.03轉(zhuǎn)染后第2天0.33 ± 0.02 0.31 ± 0.03 0.40 ± 0.03轉(zhuǎn)染后第3天0.54 ± 0.06 0.41 ± 0.06 0.78 ± 0.11轉(zhuǎn)染后第4天0.87 ± 0.05 0.63 ± 0.06 0.99 ± 0.07轉(zhuǎn)染后第5天1.11 ± 0.02 0.80 ± 0.08 1.25 ± 0.10轉(zhuǎn)染后第6天1.28 ± 0.04 1.03 ± 0.07 1.44 ± 0.05

2.3 miR-125a 下游靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-125a的下游靶點(diǎn)之一為TAZ。對(duì)照1組、過(guò)表達(dá)miR-125a組、沉默miR-125a組TAZ蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.80 ± 0.05、0.48 ± 0.07、1.23 ±0.11，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

通過(guò)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-125a 與TAZ 的結(jié)合位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)突變型序列（TAZ-3'UTR MT），miR-125a與TAZ 的非編碼區(qū)結(jié)合，miR-125a 的直接下游靶點(diǎn)為TAZ。見(jiàn)圖1。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，WT+miR-ctrl 組、Mut+miR-ctrl 組、WT+miR-125a 組、Mut+miR-125a 組的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為1.00 ± 0.03、0.98 ± 0.03、0.56 ± 0.09、0.88 ±0.06。WT+miR-125a 組相對(duì)熒光強(qiáng)度低于WT+miR-ctrl 組、Mut+miR-ctrl 組（P均＜0.05），Mut+miR-125a 組相對(duì)熒光強(qiáng)度與WT+miR-ctrl 組、Mut+miRctrl 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

圖1 miR-125a與TAZ結(jié)合位點(diǎn)及突變型序列

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第2、3、4、5、6 天細(xì)胞增殖活力比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表2。對(duì)照2 組、miR-125a mimics 組、miR-125a mimics+TAZ組集落形成數(shù)分別為（140.33 ± 19.13）、（72.33 ±10.01）、（140.33 ± 19.13）個(gè)，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表2 各組不同時(shí)間的增殖活力（± s）

表2 各組不同時(shí)間的增殖活力（± s）

組別對(duì)照2組miR-125a mimics組miR-125a mimics+TAZ組OD450值轉(zhuǎn)染后第1天0.20 ± 0.02 0.21 ± 0.02 0.20 ± 0.03轉(zhuǎn)染后第2天0.33 ± 0.05 0.32 ± 0.03 0.33 ± 0.02轉(zhuǎn)染后第3天0.58 ± 0.02 0.43 ± 0.02 0.57 ± 0.05轉(zhuǎn)染后第4天0.88 ± 0.04 0.55 ± 0.03 0.80 ± 0.03轉(zhuǎn)染后第5天1.05 ± 0.07 0.77 ± 0.02 0.89 ± 0.03轉(zhuǎn)染后第6天1.25 ± 0.06 0.97 ± 0.06 1.16 ± 0.04

3 討論

探究導(dǎo)致NPC 增殖的分子機(jī)制，對(duì)制定新的治療策略、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間有重要意義。研究表明，miR 參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［11-12］。LIRUSSI等［13］發(fā)現(xiàn)，在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌中，微小RNA let-7b-5p 和促癌分子單鏈選擇性單功能尿嘧啶DNA 糖基化酶1（SMUG1）形成抑制性調(diào)節(jié)環(huán)路，降低SMUG1的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抑制乳腺癌發(fā)展的作用。LI 等［14］發(fā)現(xiàn)，miR-34c 與NPC 患者預(yù)后相關(guān)，其可通過(guò)抑制受體酪氨酸激酶，減弱NPC 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力。

miR-125a 在頭頸鱗癌等腫瘤中被證實(shí)為抑癌基因［15］。在肝細(xì)胞癌中，miR-125a 抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用；而長(zhǎng)鏈非編碼RNA PDIA3P1 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-125a 從而減弱了miR-125a 對(duì)肝細(xì)胞癌的抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的化療耐藥［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a 低表達(dá)后，NPC 細(xì)胞增殖能力有了較為顯著的提升。這說(shuō)明在NPC 中miR-125a 發(fā)揮抑癌作用。

本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125a 后Hippo 信號(hào)通路關(guān)鍵分子TAZ 表達(dá)降低，敲低miR-125a 則促進(jìn)TAZ 高表達(dá)，符合二者結(jié)合的表達(dá)趨勢(shì)，因此預(yù)測(cè)miR-125a 的潛在下游靶點(diǎn)為TAZ；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-125a 可與TAZ 序列的3'UTR區(qū)域結(jié)合，證明TAZ 是miR-125a 的靶基因。Hippo通路是一條進(jìn)化上保守的信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、增殖和遷移，一旦該通路的表達(dá)失衡，便會(huì)引起細(xì)胞增殖能力改變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［17］。TAZ 通常在腫瘤中表達(dá)較高，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡過(guò)程［18］。在NPC 中，愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒可使TAZ 異?；罨?，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［19］，但尚未有文獻(xiàn)證明miR-125a 可負(fù)調(diào)控TAZ 從而抑制NPC 細(xì)胞增殖。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，miR-125a 可抑制TAZ 的表達(dá)，從而減弱TAZ 對(duì)NPC增殖的促進(jìn)作用。同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-125a 及TAZ 時(shí)，miR-125a 的抑癌作用有較大程度的減弱，說(shuō)明TAZ是miR-125a 有效的下游靶點(diǎn)，miR-125a 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用很大程度是通過(guò)降低TAZ 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這驗(yàn)證了miR-125a-TAZ 通路的存在，該通路對(duì)NPC細(xì)胞的增殖能力有調(diào)控作用。miR-125a對(duì)TAZ乃至Hippo 通路的調(diào)控對(duì)NPC 的治療有重要臨床意義，可通過(guò)小分子藥物等手段恢復(fù)NPC 中miR-125a的表達(dá)或抑制TAZ 過(guò)度活化，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。然而目前仍有部分問(wèn)題亟待解答，如miR-125a 對(duì)Hippo 信號(hào)通路中的其他分子是否有調(diào)控作用等，對(duì)于這些問(wèn)題可以后續(xù)進(jìn)一步探究。

綜上所述，miR-125a 可通過(guò)下游靶點(diǎn)TAZ 抑制NPC細(xì)胞的增殖，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步挖掘，以期對(duì)NPC的診斷和治療提供依據(jù)。