視覺發(fā)育關(guān)鍵期單眼形覺剝奪弱視大鼠視皮層的差異表達(dá)基因及其功能分析

李佳芹，畢愛玲，2，畢宏生，2

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科與視光醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250014；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心山東省眼病防治研究院實(shí)驗(yàn)中心 山東省中西醫(yī)結(jié)合眼病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

弱視是與視皮層發(fā)育相關(guān)的臨床常見眼科疾病，綜合患病率高達(dá)2%～5%，多見于兒童和青少年［1］。在視覺發(fā)育期內(nèi)，由于單眼斜視、屈光參差、高度屈光不正及形覺剝奪等異常視覺經(jīng)驗(yàn)引起單眼或雙眼的最佳矯正視力低于相應(yīng)年齡的正常人，且眼內(nèi)無任何器質(zhì)性病變，排除遺傳相關(guān)眼病，則可診斷為弱視［2］。弱視的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與視覺傳輸通路密切相關(guān)，其發(fā)病最核心的位置是大腦視皮層［3］。研究發(fā)現(xiàn)，視覺發(fā)育關(guān)鍵期對嚙齒動物進(jìn)行單眼形覺剝奪（MD），導(dǎo)致初級視皮層神經(jīng)元的輸入偏好向非剝奪眼發(fā)生顯著變化，引起視覺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常，影響視皮層結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致視覺受損［4］?；蛐酒夹g(shù)是一種運(yùn)用大量特定序列的基因探針與標(biāo)記樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測探針雜交信號強(qiáng)度，獲得相應(yīng)基因序列信息的基因檢測技術(shù)，具有高精確度、高靈敏度、高通量等優(yōu)勢?；蛐酒夹g(shù)已應(yīng)用于各研究領(lǐng)域，而有關(guān)弱視模型動物視覺皮層基因表達(dá)變化的報(bào)道較少。2022年7月—2023年2 月，本研究以形覺剝奪弱視大鼠為模型，運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測各樣本視皮層基因表達(dá)情況，篩選差異表達(dá)基因，運(yùn)用基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，確定弱視相關(guān)發(fā)病基因及其生物學(xué)信息，為分子水平靶向治療弱視提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SD大鼠10只，雌雄各5只，合籠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2016-0006，孕24 d 左右娩出幼鼠，均排除眼部器質(zhì)性疾病。選取出生13 d 尚未睜眼SD 大鼠24 只，雌雄不限，體質(zhì)量12～15 g。大鼠與幼鼠均飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)眼病防治研究院，室溫25 ℃、濕度50%、12 h/12 h 晝夜光照節(jié)律，飼養(yǎng)期間食物水源充足，自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守ARVO 原則，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和使用經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動物管理和使用委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 紅霉素眼膏（北京雙吉制藥有限公司），氧氟沙星滴眼液（辰欣偉都藥業(yè)有限公司），RNeasy mini kit（德國QIAGEN 公司），Gene Expression Hybridization Kit、Low Input Quick Amp Labeling Kit、One-Color（美國Agilent 公司），RNeasy mini kit（德國QIAGEN 公司），Gene Expression Wash Buffer Kit（美國Agilent公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 手術(shù)器械、腦切片模具（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher 公司），Hybridization Oven、Agilent Bioanalyzer 2100、Agilent Microarray Scanner（美國Agilent 公司），Staining Dishes（美國Thermo Shandon公司）。

1.2 動物分組及單眼形覺剝奪弱視模型制備 將24 只出生13 d 尚未睜眼SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法均分為空白對照組、模型組。模型組參照文獻(xiàn)［5］的方法構(gòu)建模型，操作方法：經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉、固定，用復(fù)合碘消毒右眼周圍皮膚，切除右眼上下眼瞼0.8～1.0 mm邊緣組織，用眼科縫合針2～4 針間斷縫合上下眼瞼。術(shù)后7 d 在創(chuàng)緣處使用氧氟沙星滴眼液和紅霉素眼膏，防止感染。正常光照下飼養(yǎng)大鼠，每天早晚觀察縫合部位，剔除脫線、漏光及眼內(nèi)感染大鼠。連續(xù)飼養(yǎng)45 d 后切開右眼眼瞼邊緣。

1.3 視皮層腦組織獲取 出生60 d，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后快速斷頭處死大鼠，取大腦放于腦切片模具中，參考大鼠腦立體定位圖譜［6］切取雙側(cè)視皮層腦組織，放于EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 差異表達(dá)基因篩選 采用基因芯片實(shí)驗(yàn)。RNA 的抽提、純化及芯片雜交實(shí)驗(yàn)：用RNeasy mini kit抽提樣品總RNA，并用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)及Agilent Bioanalyzer 2100 進(jìn)行電泳質(zhì)檢；質(zhì)檢合格的總RNA 用Agilent 表達(dá)譜芯片配套試劑盒進(jìn)行放大和標(biāo)記，并用RNeasy mini kit 純化標(biāo)記后的cRNA；按照Agilent 表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行雜交，在65 ℃、10 r/min滾動雜交爐中滾動雜交17 h，雜交cRNA 上樣量1.65 μg；雜交后，使用Gene Expression Wash Buffer Kit 在洗缸中洗片；使用Agilent Microarray Scanner 對雜交芯片進(jìn)行掃描，軟件設(shè)置Dye channel： Green， Scan resolution=3 μm，PMT 100%，20 bit。用Feature Extraction software讀取基因芯片掃描原始數(shù)據(jù)，用R軟件中l(wèi)imma包Quantile 算法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。繪制箱線圖，觀察樣本數(shù)據(jù)分布的總體特征。用表達(dá)差異倍數(shù)及t檢驗(yàn)對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)差異倍數(shù)≥2 且P＜0.05。采用火山圖分析兩組間差異基因總體分布情況，聚類熱圖分析組內(nèi)各樣本間差異基因的分布。

1.5 差異表達(dá)基因GO 和KEGG 富集分析 用GO和KEGG 工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析。挑選標(biāo)準(zhǔn)：term/GO 或term/pathway 上至少存在2 個差異表達(dá)基因（P＜0.05）。篩選出基因富集顯著的功能和信號通路，按照Enrich factor 值從大到小降序排列，取前30個結(jié)果制作可視化氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 將原始數(shù)據(jù)經(jīng)過均一化和對數(shù)轉(zhuǎn)換處理，繪制得到箱線圖，見圖1，數(shù)據(jù)中位數(shù)基本為一條直線，各樣本間具有可比性。模型組與空白對照組視皮層差異基因總體表達(dá)情況見圖2。其中，左側(cè)視皮層差異表達(dá)基因共163 個，表達(dá)上調(diào)基因28個、表達(dá)下調(diào)基因135個；右側(cè)視皮層差異表達(dá)基因數(shù)共38 個，表達(dá)上調(diào)基因25 個、表達(dá)下調(diào)基因13個。共獲得16個共有差異表達(dá)基因，表達(dá)上調(diào)基因9個、表達(dá)下調(diào)基因7個。

圖1 箱線圖

圖2 大鼠左側(cè)、右側(cè)視皮層差異表達(dá)基因火山圖

2.2 差異表達(dá)基因GO 富集分析結(jié)果 空白對照組與模型組左側(cè)視皮層差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，選取富集最顯著的30 個功能，其中富集程度大于2 的GO 條目共有22 個，參與分子功能的條目有5 個，包含核糖體的結(jié)構(gòu)成分、結(jié)構(gòu)分子活性、氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、氣味結(jié)合；參與細(xì)胞組成的條目有8個，包含細(xì)胞質(zhì)核糖體大亞基、核糖體大亞基、細(xì)胞質(zhì)核糖體、核糖體亞基、核糖體、細(xì)胞體、核糖核蛋白復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)；參與生物過程的條目有9 個，包含蛋白質(zhì)翻譯、感覺器官發(fā)育、氧化還原過程、器官形態(tài)形成、離子跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞增殖正調(diào)節(jié)、羧酸代謝過程、有機(jī)環(huán)化合物反應(yīng)、有機(jī)酸代謝過程。

空白對照組與模型組右側(cè)視皮層差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，選取富集最顯著的30個功能，其中富集程度大于2 的條目共有19 個，參與分子功能的條目有4個，包含蛋白質(zhì)二聚化活性、相同蛋白結(jié)合、受體結(jié)合、水解酶活性；參與細(xì)胞組成的條目有1 個，構(gòu)成神經(jīng)元細(xì)胞突起；參與生物過程的條目有14 個，包含多細(xì)胞生物繁殖過程、化學(xué)穩(wěn)態(tài)、穩(wěn)態(tài)過程、繁殖、移動、基因表達(dá)正向調(diào)控、組織發(fā)育、細(xì)胞代謝過程負(fù)調(diào)控等。

2.3 差異表達(dá)基因KEGG 富集分析結(jié)果 對空白對照組與模型組左側(cè)視皮層差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，篩選出富集程度最顯著的30 個信號通路，包括胚胎背腹軸線形成、光信號傳導(dǎo)通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、氧化磷酸化信號通路、醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收信號通路、碳水化合物的消化吸收信號通路、B 細(xì)胞受體信號通路等，見圖3?？瞻讓φ战M與模型組右側(cè)視皮層差異表達(dá)基因KEGG 信號通路主要富集于維生素消化和吸收、脂肪消化和吸收、長期抑制、血管平滑肌收縮、肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、癌癥信號通路、嗅覺傳導(dǎo)信號通路。

圖3 左側(cè)視皮層差異表達(dá)基因KEGG富集分析氣泡圖

左、右兩側(cè)視皮層差異基因的KEGG 富集代謝通路不盡相同，其中與視覺相關(guān)的主要代謝通路包括背腹軸形成、光信號傳導(dǎo)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、神經(jīng)活性配體—受體相互作用信號通路等。其中與視功能異常改變有關(guān)的大部分通路集中在MAPK1、鳥氨酸結(jié)合蛋白Gα2（GNAT2）基因。

3 討論

MAPK 是一種常見的細(xì)胞內(nèi)信號通路，在癌發(fā)生、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移、抑制凋亡和刺激血管生成中起著至關(guān)重要的作用［7-8］。MAPK1 是MAPK 信號傳導(dǎo)通路的重要蛋白質(zhì)編碼基因，又稱ERK1/2或p44/42。在正常情況下，其位于細(xì)胞質(zhì)中，在高糖、各種生長因子、過氧化氫、離子射線等刺激下磷酸化激活，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與細(xì)胞增殖和分化［9］。在哺乳動物細(xì)胞中，與MAPK1 相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［10-11］。γ-氨基丁酸（GABA）是大腦中主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)視皮層興奮性神經(jīng)元形態(tài)和功能改變［12-13］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是由視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)視皮層可塑性、調(diào)控視覺系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)育、調(diào)節(jié)突觸發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)［14-15］。研究表明，在視覺早期發(fā)育過程中，興奮性GABA 和BDNF 之間依賴MAPK信號傳導(dǎo)通路形成正反饋回路，其中，GABA 刺激BDNF 表達(dá)，BDNF 促進(jìn)GABA 的突觸釋放［16］。異常的視覺刺激引起GABA 表達(dá)變化，使神經(jīng)元產(chǎn)生異常視覺沖動，并且通過MAPK信號通路，刺激BDNF 異常表達(dá)，引起突觸結(jié)構(gòu)改變和視覺神經(jīng)元異常發(fā)育，導(dǎo)致弱視發(fā)生。另外，MAPK1 通路激活，進(jìn)一步介導(dǎo)一氧化氮合酶（NOS）表達(dá)和一氧化氮（NO）產(chǎn)生［17-18］。NO通過加強(qiáng)谷氨酸的釋放，參與視覺沖動的產(chǎn)生、整合與傳遞，對視覺的發(fā)育有重要影響［19］。在弱視貓模型、形覺剝奪弱視大鼠模型的研究中，分別檢測出視網(wǎng)膜與大腦視皮層NOS、GABA 的表達(dá)明顯減少［20-21］?？梢酝茰y，NOS的降低導(dǎo)致NO 合成減少，影響視覺發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致弱視。另外，BDNF 與谷氨酸突觸表達(dá)調(diào)控長時(shí)程增強(qiáng)（LTP）過程也密切相關(guān)，代謝型谷氨酸受體激活引起神經(jīng)興奮性信號傳遞，并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)LTP，改變神經(jīng)可塑性，參與視皮層發(fā)育［22-23］。

GNAT2 基因包含8 個外顯子，共編碼354 個氨基酸，主要功能為光信號傳導(dǎo)通路［24］。研究證實(shí)，GNAT2 參與的光信號傳導(dǎo)通路與視功能作用發(fā)揮密切相關(guān)。光信號傳導(dǎo)通路中，GNAT2 主要參與編碼視錐轉(zhuǎn)導(dǎo)G 蛋白的α 亞基及視錐體光感受器中GTP 酶的活化過程［25］。在視錐光感受器中，光刺激激活光色素與轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（G 蛋白）的相互作用，刺激結(jié)合的GDP 交換為GTP。與GTP 結(jié)合的視錐細(xì)胞特異性α 轉(zhuǎn)導(dǎo)素亞基從其β 和γ 亞基釋放，并通過從cGMP-磷酸二酯酶的活性位點(diǎn)去除抑制性γ 亞基來激活該酶。cGMP 磷酸二酯酶降低了光感受器中cGMP 的濃度，引起cGMP 門控通道關(guān)閉和光感受器的超極化。RONNING 等［26］對敲除小鼠GNAT2 基因，發(fā)現(xiàn)GNAT2表達(dá)缺失情況下不存在視錐驅(qū)動的視網(wǎng)膜信號傳導(dǎo)。另外，研究結(jié)果顯示單眼形覺剝奪GNAT2-/-小鼠的屈光偏移幅度較GNAT2+/+小鼠大兩倍［27］。以上研究表明，GNAT2 基因是光信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵基因，敲除GNAT2基因會引起視網(wǎng)膜光信號傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致小鼠屈光發(fā)育異常，進(jìn)而引起視覺發(fā)育的不完善，導(dǎo)致弱視形成。多巴胺（DA）是弱視發(fā)病分子機(jī)制中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)控遞質(zhì)，參與視覺發(fā)育關(guān)鍵期視覺神經(jīng)元的發(fā)育成熟、突觸結(jié)構(gòu)的可塑性等過程［18，28］。PARK等［29］發(fā)現(xiàn)，具有非功能性視桿細(xì)胞的GNAT1-/-小鼠由于DA 的代謝異常，導(dǎo)致其在產(chǎn)后1～4周DA 代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸水平下降，引起屈光發(fā)育異常。另外，由于ON通道缺陷導(dǎo)致DA 緊張性水平降低［30］或光感受器變性［31］也增加了對形覺剝奪性視覺異常發(fā)育的易感性。這些結(jié)果表明，DA對屈光發(fā)育和形覺剝奪異常視覺表現(xiàn)具有復(fù)雜作用，在視覺發(fā)育過程中，DA 可能出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)視覺分子信號異常表達(dá)，從而增加視覺發(fā)育異常的易感性。

本實(shí)驗(yàn)采用健康大鼠，在其視覺發(fā)育關(guān)鍵期進(jìn)行右眼單眼縫合，以異常視覺經(jīng)驗(yàn)誘導(dǎo)建造形覺剝奪弱視大鼠模型。運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測左、右眼對應(yīng)大腦視皮層基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大量基因表達(dá)顯著下調(diào)，少量表達(dá)上調(diào)。對差異基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)弱視模型大腦視皮層中MAPK1 基因表達(dá)下調(diào)，GNAT2 基因表達(dá)上調(diào)。MAPK1 基因表達(dá)下調(diào)表明弱視狀態(tài)下，與視覺信號傳導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞信號途徑發(fā)生了變化，影響了視覺沖動的產(chǎn)生、整合與傳遞，進(jìn)一步影響了視覺神經(jīng)元異常發(fā)育和連接。G 蛋白在視網(wǎng)膜的視覺傳導(dǎo)途徑中參與感光色素激活、二次信號傳導(dǎo)等過程。GNAT2 基因表達(dá)上調(diào)反映了對視覺信號傳導(dǎo)的一種代償性反應(yīng)，即在弱視條件下，生物體試圖通過增加GNAT2的表達(dá)來增強(qiáng)對有限視覺輸入的感知。

綜上所述，形覺剝奪弱視模型大鼠視皮層MAPK1 基因表達(dá)下調(diào)，由MAPK1 介導(dǎo)的NOS、NO表達(dá)降低，以及GABA、BDNF 參與的視覺信號通路及生物學(xué)活性表達(dá)限制，可能是形覺剝奪弱視相關(guān)的分子學(xué)生物途徑。另外，形覺剝奪弱視模型大鼠GNAT2 基因表達(dá)上調(diào)，可能導(dǎo)致視錐驅(qū)動的視網(wǎng)膜信號傳導(dǎo)異常，進(jìn)一步導(dǎo)致視覺光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，并且伴隨DA 對形覺剝奪視覺發(fā)育的影響，可能是弱視形成的另一分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)從基因?qū)用娣治隽擞绊懭跻曅纬傻拇竽X視皮層神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)變化和功能可塑性的過程，為弱視治療、視覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及大腦視覺發(fā)育的可塑性研究提供了新的方向。當(dāng)然，未來仍需結(jié)合目標(biāo)基因?qū)唧w的分子機(jī)制進(jìn)行探索。