黃曲霉毒素在肉雞肝臟中的代謝規(guī)律研究

張蓉銀，杜婷婷，魏佩玲，王曉濤，胡 波

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，新疆烏魯木齊 830026）

霉菌毒素是由曲霉菌、鐮刀菌、青霉菌和鏈格孢菌等真菌產(chǎn)生的天然有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物（Steynp，1995），迄今為止，已在自然界中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)500 多種霉菌毒素。其中黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是由曲霉菌產(chǎn)生的毒性最強(qiáng)的毒素，具有肝毒性、致癌性、誘變性和致畸性（Johan等，2010），也是污染玉米、花生、小麥、堅(jiān)果、油性飼料、飼草產(chǎn)品等飼料原料的主要污染毒素（史海濤等，2019 ；黎進(jìn)，2016）。畜禽受黃曲霉毒素中毒后其肝臟酶活、組織形態(tài)異常嚴(yán)重影響了肝臟功能（Cast，1989）。因此，研究AFB1在靶組織中的代謝規(guī)律受到廣泛關(guān)注。本文選用白羽肉雞為研究對(duì)象，利用非靶向代謝組學(xué)方法探討不同濃度的黃曲霉毒素對(duì)肉雞肝臟組織的影響，為實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中檢測(cè)黃曲霉毒素提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)將80 只21 日齡、平均體重816 g 的白羽肉雞隨機(jī)分為4 組，分別為對(duì)照組（DZ）、低劑量組（D）、中劑量組（Z）、高劑量組（G）。每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 只。采用層疊籠養(yǎng)，自由采食和飲水，常規(guī)免疫。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組以玉米油作為溶劑進(jìn)行注射器灌服，低劑量組灌服濃度為2.4μg/mL；中劑量組灌服濃度10μg/mL 的AFB1；高劑量組灌服100μg/mL的AFB1，每天灌服1 次，每次1 mL，連續(xù)灌服7 d。

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 試劑 甲醇、甲酸、水、乙腈試劑均購(gòu)自Finsher 公司，均為分析純或色譜級(jí)。

1.2.2 主要儀器 SB-5200DT 超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技有限公司）；TYXH-I 漩渦振蕩器（上海汗諾儀器有限公司）；TGL-16MS 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；LNG-T98 冷凍濃縮離心干燥機(jī)（太倉(cāng)市華美生化儀器廠）；Sciex TripleTOF 6600 高分辨質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Agilent 1290 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8μm）色譜柱（Waters）。

1.2.3 肉雞屠宰和肝臟樣品采集 飼喂前各試驗(yàn)組分別屠宰5 只肉雞，其余肉雞待藥物灌服7 d后統(tǒng)一屠宰。宰前稱重，記錄宰前活重、每日飼喂量。屠宰時(shí)采用頸動(dòng)脈放血法，去除頭、羽、爪部位，完整采集雞肝臟樣本，液氮保存。

1.2.4 代謝物提取 取0.1 g 肝臟樣品，加入80% 預(yù)冷的甲醇1 mL，使用組織勻漿機(jī)將肝臟充分研磨。研磨后的樣品在4℃的條件下15000g離心15 min，收集上清液，經(jīng)旋蒸干燥后，加入1mL 50% 的甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

1.2.5 液相色譜- 質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱溫：45℃；流動(dòng)相：A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣體積：2μL。

表1 洗脫梯度

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.6 代謝物鑒定和統(tǒng)計(jì)分析 使用MSDIAL 4.9 對(duì)原始數(shù)據(jù)做峰提取、峰對(duì)齊等數(shù)據(jù)處理，基于MS-DIAL metabolomics MSP 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定，同時(shí)進(jìn)行理論碎片識(shí)別。分析前先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，采取總峰面積歸一化即每個(gè)樣本的每個(gè)代謝物除以該樣本總的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，高濃度組對(duì)肉雞平均日增重產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05），高、中、低組對(duì)肉雞的平均日采食量無(wú)顯著影響（P＞0.05），各飼喂組均未出現(xiàn)肉雞死亡狀況。

表3 AFB1 對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 灌服AFB1對(duì)肝臟代謝的影響 采用非靶向代謝組學(xué)分析流程，使用C18 分離肝臟代謝物，于正、負(fù)離子兩種質(zhì)譜模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，共鑒定到4473 個(gè)代謝物，使用PCA 無(wú)監(jiān)督多維方法分析不同劑量組與對(duì)照組定量結(jié)果。由圖1 可知，與對(duì)照組相比，灌服AFB1的代謝物明顯發(fā)生了變化，但不同劑量之間差異不顯著。

圖1 肝臟中不同劑量組間的PCA 得分圖

圖2 肝臟中不同劑量組間的代謝差異物火山圖

2.3 肉雞中AFB1的差異代謝物火山圖分析 為了進(jìn)一步分析AFB1影響肝臟代謝物的種類，采用T-test 的方法分別分析了低，中、高組相比對(duì)照組中差異代謝物的變化趨勢(shì)，在變化倍數(shù)≥2 倍，P＜0.05 的條件下共鑒定到242 個(gè)化合物，其中132 個(gè)化合物上調(diào)，110 個(gè)化合物下調(diào)。以火山圖展示代謝物表達(dá)差異的分布，其中橫軸表達(dá)代謝物差異倍數(shù)，越偏離中心差異倍數(shù)越大，縱軸值越大差異越顯著。如圖2 所示，其中低劑量組有37個(gè)差異化合物顯著下調(diào)，30 個(gè)差異化合物顯著上調(diào)；高劑量組有36 個(gè)差異化合物顯著下調(diào)，46個(gè)差異化合物顯著上調(diào)；中劑量組中44 個(gè)差異化合物顯著下調(diào)，52 個(gè)差異化合物顯著上調(diào)。

2.4 肉雞中AFB1差異代謝物的層次聚類分析為進(jìn)一步展示受影響的化合物在肝臟中的變化情況，使用熱圖對(duì)不同劑量組進(jìn)行聚類分析，如圖3所示，其中橫軸表示低（D）、中（Z）、高組（G）和對(duì)照組（DZ），縱軸表示相應(yīng)差異代謝物，紅色越深代表該代謝物相對(duì)調(diào)高，綠色越深代表該代謝物相對(duì)調(diào)低。由圖3 可知，各劑量組中的差異代謝物種類與對(duì)照組相比變化明顯，可能是由于AFB1劑量升高，導(dǎo)致對(duì)肝臟代謝功能造成相應(yīng)程度的損傷。

圖3 肝臟中不同劑量組間層次聚類分析熱力圖

2.5 肉雞肝臟中的顯著性差異代謝物 由表4可知，在242 個(gè)差異化合物中，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組上調(diào)的差異化合物132 個(gè)，下調(diào)的差異化合物110 個(gè)。經(jīng)HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)一步篩選出變化最為顯著的內(nèi)源性代謝物10 個(gè)，其中上調(diào)的代謝物9 個(gè)，下調(diào)的代謝物1 個(gè)。

表4 各試驗(yàn)組肉雞肝臟中顯著性差異代謝物信息

3 討論

動(dòng)物采食AFB1后會(huì)引起采食量下降、料重比、日增重增加，更有甚者還會(huì)對(duì)肝臟、腎臟、胸腺等器官造成一定損傷，長(zhǎng)期采食會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的肝、腎、肌肉等產(chǎn)品中沉積AFB1，從而通過(guò)食物鏈危害人體健康。Siloto 等（2013）在飼料中加入1 mg/kg 的AFB1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞肝臟顏色變黃，肝臟發(fā)生明顯的脂肪蓄積，肝臟重量增大，血漿極低密度脂蛋白和甘油三酯濃度下降。石達(dá)友等（2010）研究表明，給雛鴨服用AFB1后，肝臟線粒體膜通透性的變化趨勢(shì)與AFB1劑量成正相關(guān)性，即AFB1劑量越大，線粒體受損傷程度越嚴(yán)重，這可能是AFB1肝毒作用機(jī)理之一。Ishikawa 等（2017）研究表明，毒素濃度與肝臟損傷之間存在直接相關(guān)性。

在本試驗(yàn)中，肉雞采食含有AFB1的日糧后發(fā)現(xiàn)，肝臟中均有一定程度的蓄積，其中高濃度產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物變化，且隨AFB1濃度的升高，代謝產(chǎn)物變化種類越多。肝臟中差異化合物分子大多為脂類和氨基酸類物質(zhì)，磷脂是構(gòu)成質(zhì)膜的主要成分，與其他兩組相比，高劑量處理組中的磷脂類物質(zhì)顯著升高，這與LU 等（2011）的研究結(jié)果一致，說(shuō)明高劑量的AFB1可導(dǎo)致肝臟損傷，內(nèi)源性脂類物質(zhì)迅速增加，發(fā)生肝臟脂肪堆積，膜崩解和急性細(xì)胞腫脹。Harvey 等（1990）研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)給豬飼喂AFB1污染的日糧，其肝臟、腎臟和肝臟脂肪的相對(duì)重量明顯升高。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綜上所述，通過(guò)AFB1對(duì)肉雞肝臟組織的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，白羽肉雞采食含有AFB1的飼料后會(huì)引起肝臟組織內(nèi)不等量殘留，且隨著飼料中AFB1濃度的增加，加重了肝臟的損傷情況。