142例惡性胸水細(xì)胞蠟塊的免疫組化檢測(cè)及分子病理檢測(cè)

隋燕霞，柳 雨，蔣 娜，蔣伊娜，張冠軍

142例惡性胸水細(xì)胞蠟塊的免疫組化檢測(cè)及分子病理檢測(cè)

隋燕霞，柳 雨，蔣 娜，蔣伊娜，張冠軍

目的 探討細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化在惡性胸水的診斷及鑒別診斷中的作用，并分析胸水細(xì)胞蠟塊在肺腺癌分子病理檢測(cè)中的作用。方法 回顧性分析142例惡性胸水的液基細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞蠟塊HE染色以及免疫組化EnVision兩步法染色，并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)抗體的表達(dá)情況對(duì)惡性胸水進(jìn)行腫瘤分類。采用ARMS-PCR法對(duì)其中40例經(jīng)免疫組化EnVision染色確診為肺腺癌的胸水細(xì)胞蠟塊，進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變檢測(cè)。結(jié)果 142例胸水細(xì)胞蠟塊經(jīng)免疫組化染色證實(shí)肺腺癌99例，肺小細(xì)胞癌4例，肺鱗狀細(xì)胞癌3例，乳腺癌13例，卵巢癌9例，胃癌 2例，甲狀腺癌1例，子宮內(nèi)膜癌1例，間皮瘤5例，淋巴瘤3例，惡性黑色素瘤1例，滑膜肉瘤1例。40例肺腺癌中EGFR 基因突變20例，其中19del突變9例，L858R突變11例。結(jié)論 惡性胸水細(xì)胞蠟塊行免疫組化檢測(cè)不僅有助于腫瘤的明確診斷，更有助于對(duì)腫瘤進(jìn)行分類并判斷腫瘤原發(fā)部位及幫助判斷預(yù)后。利用胸水細(xì)胞蠟塊可以對(duì)肺腺癌進(jìn)行EGFR基因突變的檢測(cè)，為肺腺癌的基因檢測(cè)提供新型的標(biāo)本來(lái)源。

胸水；細(xì)胞蠟塊；免疫組織化學(xué)；基因突變

胸水是許多疾病的常見(jiàn)臨床表現(xiàn)，其性質(zhì)的判斷對(duì)臨床診斷及治療具有重要意義。胸水細(xì)胞學(xué)檢查具有損傷小、方法簡(jiǎn)易等特點(diǎn)，目前傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢查既無(wú)法對(duì)胸水樣本長(zhǎng)期保存，也未能對(duì)臨床提供更多的有效信息[1]。本文現(xiàn)采用細(xì)胞蠟塊技術(shù)，探討細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化EnVision兩步法染色在胸水診斷中的應(yīng)用。同時(shí)對(duì)經(jīng)免疫組化EnVision兩步法確診為肺腺癌的部分病例進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變檢測(cè)，從而為臨床靶向藥物的篩選提供新型的標(biāo)本來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料 收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2015年1月～2016年6月確診為惡性胸水142例，其中男性58例，女性84例，男女比為1 ∶1.45，年齡27～99歲，平均(60.98±12.12)歲。

1.2 方法

1.2.1 液基細(xì)胞學(xué) 使用廣州安必平液基細(xì)胞沉降式制片染色機(jī)，按試劑盒操作步驟進(jìn)行制片，巴氏染色，閱片。

1.2.2 細(xì)胞蠟塊的制作 取液基制片后剩余胸水放入50 mL離心管中，離心機(jī)2 000 r/min，離心5 min，棄上清，如果沉淀物不夠可反復(fù)離心收集(血性標(biāo)本先加入3%醋酸乙醇10 mL，振蕩均勻，2 000 r/min，離心5 min，去除血細(xì)胞干擾)；向沉淀物中加入10%中性福爾馬林5 mL，振蕩，2 000 r/min，離心5 min，棄上清；向沉淀物中加入95%乙醇10 mL，振蕩，2 000 r/min，離心10 min，棄上清液；底部沉淀鑷取至擦鏡紙上，包好，與常規(guī)組織一起行脫水處理，制成細(xì)胞蠟塊。

1.2.3 免疫組化 用細(xì)胞蠟塊制作3 μm厚切片，免疫組化采用EnVision兩步法，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色。一抗選用CK、vimentin、CEA、CK7、Napsin A、TTF-1、p40、CK5/6、p63、Calretinin、WT-1、MC、D2-40、CD56、CgA、Syn、CA125、Pax-8、p16、CK20、Villin、CDX2、GCDFP-15、Mammaglobin、ER、PR、HER-2、CD45、CD20、CD79a、CD3、CD43、HMB-45、Melan-A、S-100、CK19、Galectin-3、TG、EMA、desmin、p53、Ki-67等進(jìn)行檢測(cè)；抗體及工作液均購(gòu)自福州邁新公司。

1.2.4 ARMS-PCR法 細(xì)胞蠟塊標(biāo)本切片10 μm厚，數(shù)量≥10 張，將切片用鑷子轉(zhuǎn)移至潔凈的1.5 mL離心管中。應(yīng)用廈門艾德公司的石蠟包埋組織樣品DNA提取試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取，DNA樣本經(jīng)Nano Drop 2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific 公司)定量，并調(diào)節(jié)終濃度為2 ng/μL。應(yīng)用ARMS法對(duì)提取的DNA進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 惡性胸水的腫瘤細(xì)胞來(lái)源及肺腺癌的基因突變 142例胸水細(xì)胞蠟塊經(jīng)免疫組化EnVision兩步法染色證實(shí)肺腺癌99例，肺小細(xì)胞癌4例，肺鱗狀細(xì)胞癌3例，乳腺癌13例，卵巢癌9例，胃癌 2例，甲狀腺癌1例，子宮內(nèi)膜癌1例，間皮瘤5例，淋巴瘤3例，惡性黑色素瘤1例，滑膜肉瘤1例(表1)。40例肺腺癌中EGFR 基因突變20例，其中19del突變9例，L858R突變11例。

表1 胸水細(xì)胞蠟塊免疫組化的分型診斷結(jié)果(n=142)

2.2 液基制片觀察 液基細(xì)胞巴氏染色結(jié)果以腺癌多見(jiàn)，其中最常見(jiàn)的是肺腺癌，癌細(xì)胞常聚集成團(tuán)，分化差時(shí)可散在分布，核質(zhì)比增大，核異形，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黏液空泡(圖1A)；另外較常見(jiàn)的腺癌有乳腺癌和卵巢癌，乳腺癌細(xì)胞黏附性強(qiáng)，常形成大小不同的圓形、卵圓形三維細(xì)胞團(tuán)，團(tuán)內(nèi)細(xì)胞可相互重疊，大小較一致(圖1B)；卵巢癌常形成大量的細(xì)胞團(tuán)，三維立體感強(qiáng)，可有黏液空泡。少見(jiàn)腫瘤有肺小細(xì)胞癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、間皮瘤、淋巴瘤以及其他軟組織腫瘤。小細(xì)胞癌細(xì)胞體積小，可成堆或成團(tuán)排列，鑲嵌特征明顯，并常見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞呈列兵式排列，胞質(zhì)稀少或缺如，核形不規(guī)則深染，核分裂象易見(jiàn)；鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞異形性明顯，散在分布，胞質(zhì)豐富，核異形明顯，可見(jiàn)巨核細(xì)胞，核染色質(zhì)粗糙、深染；胃癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌液基細(xì)胞學(xué)均為不同分化程度的腺癌特點(diǎn)，即常聚集成團(tuán)，核質(zhì)比增大，核異形，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黏液空泡；間皮瘤細(xì)胞由一系列的間皮細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞可呈團(tuán)排列，細(xì)胞團(tuán)邊緣呈桑葚狀或結(jié)節(jié)狀，細(xì)胞較腺癌異形性小，核居中，胞質(zhì)核周濃染，邊緣較淡；淋巴瘤細(xì)胞小而一致，呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)稀少，核染色質(zhì)顆粒狀；惡性黑色素瘤細(xì)胞呈圓形、卵圓形及不規(guī)則形，細(xì)胞異形性明顯，核不規(guī)則，可見(jiàn)八字形細(xì)胞核，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黑色素顆粒；滑膜肉瘤細(xì)胞大小形態(tài)多樣，可見(jiàn)梭形細(xì)胞，異形明顯，核染色質(zhì)粗糙，核分裂象多見(jiàn)。

2.3 細(xì)胞蠟塊切片觀察 細(xì)胞蠟塊切片HE染色鏡下觀察，切片背景干凈，染色對(duì)比清晰，細(xì)胞數(shù)明顯增多。腺癌的細(xì)胞蠟塊切片不僅具有癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，還可以觀察類似組織學(xué)的排列方式及結(jié)構(gòu)，如腺狀、乳頭狀、梁索狀、巢團(tuán)狀結(jié)構(gòu)等(圖2)。肺小細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、間皮瘤、淋巴瘤及其他軟組織腫瘤形態(tài)上與相應(yīng)的組織學(xué)相似。

2.4 細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化進(jìn)行分型診斷 142例胸水細(xì)胞蠟塊經(jīng)免疫組化染色證實(shí)肺腺癌99例，免疫組化通常CK7、Napsin A(圖3A)和TTF-1均呈陽(yáng)性；乳腺癌13例，免疫組化標(biāo)記CK7、GCDFP-15、Mammaglobin均呈陽(yáng)性，不同程度表達(dá)ER (圖3B)、PR、HER-2；卵巢癌9例，免疫組化標(biāo)記CK7、CA125、Pax-8、WT-1均呈陽(yáng)性，不同程度表達(dá)ER、PR、p16；肺小細(xì)胞癌4例，免疫組化標(biāo)記TTF-1、CD56、Syn、CgA均呈陽(yáng)性；肺鱗狀細(xì)胞癌3例，免疫組化標(biāo)記CK、p40、CK5/6、p63均呈陽(yáng)性；胃癌2例，免疫組化標(biāo)記CK20、Villin、CDX2均呈陽(yáng)性；甲狀腺癌1例，免疫組化標(biāo)記CK19、Galectin-3、TG、TTF-1均呈陽(yáng)性；子宮內(nèi)膜癌1例，免疫組化標(biāo)記CK7、ER、PR均呈陽(yáng)性；間皮瘤5例，免疫組化標(biāo)記CK5/6、WT-1、D2-40、CR、MC、EMA、p53均呈陽(yáng)性；B細(xì)胞淋巴瘤3例，免疫組化標(biāo)記vimentin、CD45、CD20、CD79a均呈陽(yáng)性；惡性黑色素瘤1例，免疫組化標(biāo)記vimentin、HMB-45、Melan-A、S-100均呈陽(yáng)性；滑膜肉瘤1例，免疫組化標(biāo)記CK、EMA、vimentin、Calretinin不同程度陽(yáng)性表達(dá)。

2.5 應(yīng)用細(xì)胞蠟塊進(jìn)行肺腺癌EGFR基因突變檢測(cè) 40例肺腺癌胸水細(xì)胞蠟塊中EGFR基因突變20例(圖4)，其中19del突變9例，L858R突變11例，其余20例未見(jiàn)EGFR基因突變。

3 討論

胸水是許多疾病，尤其是惡性腫瘤的常見(jiàn)臨床表現(xiàn)。雖然胸水細(xì)胞學(xué)檢查具有快速、簡(jiǎn)單、標(biāo)本易于采集等優(yōu)點(diǎn)，但傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)涂片及胸水液基細(xì)胞學(xué)涂片檢查標(biāo)本難以長(zhǎng)期保存，對(duì)惡性胸水無(wú)法行進(jìn)一步檢測(cè)等缺點(diǎn)，使傳統(tǒng)胸水細(xì)胞學(xué)診斷具有一定的局限性，診斷水平停留在“找見(jiàn)腫瘤細(xì)胞”或“未找見(jiàn)腫瘤細(xì)胞”。細(xì)胞蠟塊包埋技術(shù)在國(guó)外許多國(guó)家已成為細(xì)胞學(xué)常規(guī)診斷技術(shù)[2]，而在國(guó)內(nèi)應(yīng)用有限，僅在一些大型醫(yī)院的病理科開展。本文回顧性分析我院確診為惡性胸水細(xì)胞蠟塊142例，對(duì)液基細(xì)胞學(xué)巴氏染色與細(xì)胞蠟塊HE染色進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞蠟塊的腫瘤細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，并能保持一定的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和排列方式，HE染色也更接近組織學(xué)特點(diǎn)，有利于細(xì)胞學(xué)的診斷，從而提高細(xì)胞學(xué)診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性[3]。

①A①B②A②B③A③B

圖1 A.肺腺癌細(xì)胞聚集成團(tuán)或散在分布，核質(zhì)比增大，核異形，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黏液空泡，巴氏染色；B.乳腺癌癌細(xì)胞形成大小不等的圓形、卵圓形三維細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞大小較一致，巴氏染色 圖2 A.肺腺癌細(xì)胞蠟塊切片可見(jiàn)腺樣及乳頭狀結(jié)構(gòu)；B.乳腺癌細(xì)胞蠟塊切片癌細(xì)胞呈巢團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)可見(jiàn)小的腺腔形成 圖3 A.肺腺癌Napsin A癌細(xì)胞胞質(zhì)陽(yáng)性，EnVision兩步法；B.乳腺癌ER癌細(xì)胞胞核陽(yáng)性，EnVision兩步法

圖4 內(nèi)控(A)、外控(B)信號(hào)均升起，表明檢測(cè)體系正常；可見(jiàn)EGFR基因突變信號(hào)

細(xì)胞蠟塊的最大優(yōu)點(diǎn)是可以連續(xù)切片，并可以行免疫組化染色以滿足診斷需要，提高診斷的準(zhǔn)確性，幫助判斷腫瘤細(xì)胞的原發(fā)部位[4-5]。隨著細(xì)胞學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，免疫組化染色已逐步應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)的診斷中，但免疫組化標(biāo)志物種類繁多，其敏感性和特異性各異，因此要求細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師能夠熟練掌握各種腫瘤細(xì)胞與間皮細(xì)胞免疫標(biāo)志物的表達(dá)特點(diǎn)，對(duì)胸水細(xì)胞學(xué)作出精確的診斷，確定腫瘤類型為臨床提供治療依據(jù)[6]。大量數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)移性腺癌是胸水中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，包括肺腺癌、乳腺癌、卵巢癌等，其中以肺腺癌最常見(jiàn)[7]。轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞和胸水中的反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞、間皮瘤細(xì)胞的形態(tài)也有不少相似之處，因此器官特異性抗體的應(yīng)用為確定診斷以及判斷腫瘤的來(lái)源提供較大的幫助。Napsin A、TTF-1在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)，聯(lián)合兩者是肺腺癌較為可靠的標(biāo)志物[8]；聯(lián)合應(yīng)用p40、p63是鱗狀細(xì)胞癌較為可靠的標(biāo)志物；聯(lián)合應(yīng)用CD56、CgA、Syn是小細(xì)胞癌較為可靠的標(biāo)志物；聯(lián)合應(yīng)用Mammaglobin、ER、PR是乳腺癌較為可靠的標(biāo)志物；CA125是卵巢癌較為可靠的標(biāo)志物；聯(lián)合應(yīng)用Calretinin、WT-1、MC、D2-40是間皮細(xì)胞較為可靠的標(biāo)志物。然而具有異型性的間皮細(xì)胞是反應(yīng)性增生還是惡性間皮瘤，需使用EMA、desmin、p53和Ki-67加以鑒別，惡性間皮瘤細(xì)胞EMA呈強(qiáng)陽(yáng)性，而在反應(yīng)性間皮細(xì)胞中為灶狀弱陽(yáng)性，反應(yīng)性增生的間皮細(xì)胞中desmin呈陽(yáng)性，而在惡性間皮瘤細(xì)胞中呈陰性，p53陽(yáng)性率大于50%，Ki-67大于20%提示惡性間皮瘤細(xì)胞[9]。少見(jiàn)腫瘤的免疫組化根據(jù)細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)與特異性免疫組化標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行確定。本組142例惡性胸水細(xì)胞蠟塊的免疫組化結(jié)果：肺腺癌99例，肺小細(xì)胞癌4例，肺鱗狀細(xì)胞癌3例，乳腺癌13例，卵巢癌9例，胃癌 2例，甲狀腺癌1例，子宮內(nèi)膜癌1例，間皮瘤5例，淋巴瘤3例，惡性黑色素瘤1例，滑膜肉瘤1例；其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

EGFR是跨細(xì)胞膜糖蛋白，屬于受體型酪氨酸激酶，其信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR基因在多種腫瘤中存在過(guò)表達(dá)或突變，從而調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[10]。EGFR被認(rèn)為是最有效的肺腺癌治療靶點(diǎn)之一。目前，雖然肺腺癌的靶向治療已經(jīng)進(jìn)入規(guī)范化階段，新的靶向藥物不斷出現(xiàn)，但EGFR依然是靶向治療前的必檢基因[11-12]。臨床上用于EGFR檢測(cè)的標(biāo)本大多來(lái)自于手術(shù)切除標(biāo)本或活檢標(biāo)本，但對(duì)于已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期肺癌患者或者活檢標(biāo)本不易獲取的肺癌患者，胸腔積液就成為進(jìn)行EGFR檢測(cè)重要的標(biāo)本來(lái)源。胸水細(xì)胞蠟塊中腫瘤細(xì)胞富集，是EGFR檢測(cè)的一種新型標(biāo)本[13]。EGFR突變通常發(fā)生于18～21號(hào)外顯子，其中19del缺失及 L858R突變最常見(jiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道在西方國(guó)家，非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變發(fā)生率為10%～15%，而亞洲國(guó)家發(fā)生率高達(dá)30%～40%。EGFR突變?cè)谀贻p女性和不吸煙者患者中更為常見(jiàn)[14-15]。本組40例肺腺癌胸水細(xì)胞蠟塊中EGFR基因突變20例，其中19del突變9例，L858R突變11例，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

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Immunohistochemical detection and molecular pathological examination of 142 cases of malignant pleural effusion

SUI Yan-xia, LIU Yu, JIANG Na, JIANG Yi-na, ZHANG Guan-jun

(DepartmentsofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofxi’anJiaotongUniversity,xi’an710061,China)

Purpose To explore the role of cell blocks combined with immunohistochemical examination in the diagnosis and differential diagnosis of malignant pleural effusion, and to explore the role of pleural effusion cell blocks in lung adenocarcinoma molecular pathology examination. Methods 142 cases of malignant pleural effusion based cytology, cell blocks of HE staining and immunohistochemical staining by EnVision two-step were retrospectively analysed, the tumor classification was made through analyzing the characteristics of the cells combined with antibody expression. The detection of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation of 40 cases of lung adenocarcinoma diagnosed after immunohistochemical staining were used by ARMS-PCR method. Results Among 142 cases of malignant pleural effusion, there were 99 cases caused by lung adenocarcinoma, 4 cases of lung small cell carcinoma, 3 cases of lung squamous cell carcinoma, 13 cases of breast carcinoma, 9 cases of ovarian carcinoma, 2 cases of gastric carcinoma, 1 case of thyroid carcinoma, 1 case of endometrial carcinoma, 5 cases of mesothelioma, 3 cases of lymphoma, 1 case of malignant melanoma, 1 case of synovial sarcoma. In 40 cases of lung adenocarcinoma pleural effusion cell block, there were 20 cases with EGFR mutations, 9 cases of 19del mutations and 11 cases L858R mutations. Conclusion The pleural effusion cell blocks combined immunohistochemistry are useful to improve the accuracy of diagnosis of patients with pleural effusion, and helpful for the determination of classification and the primary site of tumor, assessment of prognosis. Pleural dffusion cell block may used to detect EGFR mutations of lung adenocarcinoma, which provide new source of specimen for the gene detection of lung adenocarcinoma.

pleural effusion；cell blocks；immunohistochemistry； mutation

時(shí)間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.013.html

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)(2016SF-174)

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，西安 710061

隋燕霞，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: suiyanxi029@163.com

R 734.2

A

1001-7399(2017)03-0292-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.013

接受日期：2017-01-14