鱷梨蒂腐病毛色二孢屬真菌對(duì)6 種殺菌劑的敏感性

徐璐茜, 高銀潔, 葉倩倩, 賀 瑞, 王 萌, 楊 葉*,

(1.海南大學(xué) 南繁學(xué)院 (三亞南繁研究院)，海南 三亞 572025；2.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228；3.海南大學(xué) 生命健康學(xué)院，海口 570228)

鱷梨Persea americanaMill.又名牛油果、油梨、酪梨，屬于樟科 (Lauraceae) 鱷梨屬 (Persea)果樹，是一種重要的熱帶和亞熱帶經(jīng)濟(jì)水果，兼具果、糧、油性質(zhì)。因其果實(shí)富含促進(jìn)健康的營養(yǎng)物，兼具食用及保健等功能，深受全球消費(fèi)者的喜愛[1-3]。截至2020 年全球鱷梨種植面積達(dá)到77.2 萬hm2，全球的市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到了716 億元，預(yù)計(jì)2026 年將達(dá)到901 億元[4]。2020 年我國鱷梨栽培面積為2.3 萬 hm2，產(chǎn)量為12.9 萬噸，云南、廣西和海南是國內(nèi)鱷梨的主要產(chǎn)地[5-6]。目前，國內(nèi)鱷梨產(chǎn)業(yè)總體上還處于起步階段，國內(nèi)市場(chǎng)主要依靠進(jìn)口。海關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2010—2018 年，中國鱷梨進(jìn)口量從 1.93 噸飆升至4.39 萬噸，是所有進(jìn)口水果中增長幅度最大的品種， 2017 年和 2018年我國鱷梨進(jìn)口額均在 1 億美元以上[6]。

采后鱷梨果實(shí)的保鮮期短，且容易被病菌感染而導(dǎo)致腐爛，是目前制約鱷梨產(chǎn)業(yè)化的主要因素之一。據(jù)報(bào)道，由于管理措施不當(dāng)，鱷梨果實(shí)中由真菌性病害導(dǎo)致的采前和采后損失可高達(dá)80%[7]。蒂腐病 (stem-end rot) 也稱焦腐或黑腐病，在世界上所有鱷梨種植區(qū)都有發(fā)現(xiàn)，也是危害鱷梨果實(shí)的重要采后病害之一[8]?？汕秩诀{梨導(dǎo)致蒂腐病的病原體有多種，主要是葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae) 的毛色二孢屬 (Lasiodiplodiaspp.)，如L.theobromae和L.pseudotheobromae[9-11]；另外，葡萄座腔菌科的Diplodia mutila、Diaporthe rudis和Neofusicoccum luteumin等也能引起鱷梨蒂腐病的發(fā)生[11-13]。Lasiodiplodiaspp.病菌具有潛伏侵染的特性，在鱷梨發(fā)育過程中通過果柄基部自然孔洞或機(jī)械傷口入侵果實(shí)，潛伏至采摘后果實(shí)后熟過程中才發(fā)??；早期癥狀為果?；砍霈F(xiàn)褐色不規(guī)則小斑點(diǎn)，隨著果實(shí)成熟病斑迅速擴(kuò)展，后期果皮變色壞死、果肉軟化腐爛[8-9,14]。同時(shí)該病原菌還可引起多種熱帶和亞熱帶水果蒂腐病的發(fā)生，如：芒果、番荔枝、番石榴、山竹、百香果、菠蘿蜜和龍眼等[15-20]。

目前針對(duì)采后蒂腐病的防治措施包括：采前和采后的殺菌處理、物理處理、生物防治、農(nóng)業(yè)技術(shù)和果實(shí)成熟抑制等[15]。蒂腐病菌在鱷梨各發(fā)育階段都可能存在[7]，因此，從鱷梨開花到果實(shí)收獲期間應(yīng)用殺菌劑，均可大幅度降低果實(shí)上初始病原菌數(shù)量，從而有效控制鱷梨采后腐爛[15]。甲基苯并咪唑氨基甲酸酯抑制劑(MBCs)作用于β-微管蛋白合成，抑制細(xì)胞有絲分裂，具有廣譜內(nèi)吸的特點(diǎn)，對(duì)多種真菌病害具有保護(hù)和治療活性，除了單劑，生產(chǎn)上常與其他殺菌劑混合或復(fù)配使用[21]。14α-脫甲基酶抑制劑類殺菌劑(DMIs)作用于14α-脫甲基酶，阻斷病原菌甾醇的生物合成，具有廣譜及持效期長等特點(diǎn)[22]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(QoIs)作用于線粒體呼吸鏈，通過阻斷細(xì)胞色素bc1 復(fù)合體的電子傳遞而抑制ATP 的合成，具有高效、內(nèi)吸和廣譜的特點(diǎn)[23]。其中，MBCs 的多菌靈、苯菌靈和甲基硫菌靈，DMIs 的咪鮮胺、抑霉唑等殺菌劑，在國外很早就被用于控制鱷梨、芒果等熱帶水果的采后病害[24-27]；而QoIs 的嘧菌酯等對(duì)由Botryosphaeria引起鱷梨蒂腐也具有良好的防效[25-26]。上述3 大類型的內(nèi)吸性殺菌劑在國內(nèi)也已被廣泛應(yīng)用于熱帶水果采前和采后病害的防治。針對(duì)鱷梨，有研究指出，咪鮮胺、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑等殺菌劑對(duì)炭疽病具有良好的抑菌效果[28]；本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鱷梨生產(chǎn)上有使用這些殺菌劑防治炭疽病等病害。值得注意的是，雖然鱷梨在采前沒有專門針對(duì)蒂腐病進(jìn)行防治，但是生產(chǎn)上大量使用的各類殺菌劑也可能導(dǎo)致鱷梨蒂腐病原群體產(chǎn)生潛在的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。

雖然中國鱷梨生產(chǎn)規(guī)?；l(fā)展迅速，但尚無相關(guān)登記注冊(cè)藥劑，針對(duì)鱷梨蒂腐病的研究也幾乎為空白，缺乏系統(tǒng)的藥劑篩選及抗藥性監(jiān)測(cè)資料。2021 年本課題組對(duì)海南省部分鱷梨果園的調(diào)查顯示，蒂腐病的發(fā)病率通常在30%左右，個(gè)別果園的鱷梨發(fā)病率高達(dá)60%以上。因此，針對(duì)鱷梨蒂腐病菌進(jìn)行對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定，建立敏感性基線，開展抗藥性監(jiān)測(cè)和抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)殺菌劑的田間科學(xué)使用，以及鱷梨蒂腐病的有效防治均具有重要意義。本研究擬針對(duì)MBCs 殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈，DMIs 殺菌劑咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑以及QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯和嘧菌酯，進(jìn)行鱷梨蒂腐病菌的室內(nèi)敏感性測(cè)定，確定殺菌劑的抑菌活性，評(píng)估潛在的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，以期為指導(dǎo)鱷梨蒂腐病的科學(xué)防治提供理論依據(jù)，也為延緩田間殺菌劑抗性的產(chǎn)生提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

供試的101 個(gè)鱷梨蒂腐病菌菌株分屬Lasiodiplodia的5 個(gè)種，由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院殺菌劑生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。供試菌株中，采自海南省白沙縣的有52 株、儋州市40 株，云南省孟連縣9 株；5 種蒂腐病菌分別為L.pseudotheobromae(58 株)，L.theobromae(27 株)，L.mahajangana(9 株)，L.euphorbiaceicola(2 株)，Lasiodiplodiaspp.(5 株)，其中，L.pseudotheobromae和L.theobromae為優(yōu)勢(shì)種。

1.2 藥劑及配制

供試6 種殺菌劑原藥分別為MBCs 殺菌劑多菌靈 (純度97.2%) 和甲基硫菌靈 (97%)，DMIs 殺菌劑苯醚甲環(huán)唑 (96.1%) 和咪鮮胺 (97%)，QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯 (96%) 和嘧菌酯 (96.5%)，均為海南正業(yè)中農(nóng)高科技有限公司提供。99%水楊羥肟酸(SHAM)，上海麥克林生化科技有限公司。首先將多菌靈、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺分別溶解并配制成1 × 103μg/mL 的母液，吡唑醚菌酯、嘧菌酯和水楊羥肟酸(SHAM)分別配制成5 × 105μg/mL 的母液備用，溶劑見表1。

表1 本研究中所使用殺菌劑的最終濃度Table 1 The fungicide final concentrations used in the study

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 敏感性測(cè)定 采用菌絲生長速率法測(cè)定101 株鱷梨蒂腐病菌對(duì)6 種殺菌劑的敏感性。在PDA 培養(yǎng)基中分別加入不同量的殺菌劑母液，配制得到不同濃度的含藥培養(yǎng)基平板，最終試驗(yàn)濃度詳見表1。此外，吡唑醚菌酯和嘧菌酯處理組中分別加入水楊羥肟酸母液使其終濃度為100 μg/mL，其作用是降低旁路呼吸途徑對(duì)QoIs 殺菌劑的影響。對(duì)照培養(yǎng)基中僅含有等量的溶劑。每處理3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2 次。然后將培養(yǎng)3 d 后的菌絲塊 (直徑5 mm) 轉(zhuǎn)移到含藥PDA 平板上，于恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)36 h 后，測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率(I，%)。

式中：Dc和Dt分別為對(duì)照組和處理組菌落直徑，cm。

1.3.2CYP51和Cytb基因克隆及序列分析

1.3.2.1 基因組DNA 提取 選取1.3.1 節(jié)中測(cè)得的對(duì)苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺抗性和敏感的菌株、對(duì)吡唑醚菌酯表現(xiàn)高水平抗性和敏感的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。各供試菌株于空白PDA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d 后，從菌落邊緣打取菌餅轉(zhuǎn)接至鋪有75 mm無菌玻璃紙的空白PDA 平板中央，28 ℃培養(yǎng)36 h后，用無菌載玻片刮取菌絲，加入液氮充分研磨，根據(jù)DNA 提取試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.3.2.2 靶標(biāo)基因克隆及測(cè)序 設(shè)計(jì)引物L(fēng)tCYP51-F：5′-CCCTCCGTCTCCCTACACCT-3′，LtCYP51-R：5′-TTCTCCCTCCTCTCCCAAA-3′，用于擴(kuò)增CYP51基因片段。PCR 擴(kuò)增體系：總體系為40 μL，其中2 × Phanta Max Master Mix 20 μL，模板 DNA 0.8 μL，引物各1.6 μL，ddH2O 16 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95°C 預(yù)變性 3 min，35 個(gè)循環(huán) (95°C 預(yù)變性30 s，58°C 退火 50 s，72°C 聚合 90 s)，最后72°C 延伸5 min。設(shè)計(jì)引物Cytb1-F：

5′-TTATGGGTCATACAGAGC3- ′，Cytb1-R：5′-TA CAATAGCAGGCGGAGT -3′，用于擴(kuò)增Cyt b基因片段，該片段含甲氧基丙烯酸酯類抗性潛在基因突變位點(diǎn) (F129L、G137R、G143A)。PCR 擴(kuò)增體系：總體系為40 μL，其中2 × Phanta Max Master Mix 20 μL，模板 DNA 0.8 μL，引物各1.6 μL，ddH2O 16 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95°C 預(yù)變性3 min，35 個(gè)循環(huán) (95°C 預(yù)變性30 s，55°C 退火50 s，72°C 聚合 90 s)，最后72°C 延伸 5 min。上述所有PCR 產(chǎn)物運(yùn)用凝膠電泳檢測(cè)，通過DNA 回收試劑盒純化，將純化后的DNA 送天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司（廣州）測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別采用BLAST 和DNAMAN 進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.3CYP51和Cyt b基因表達(dá)量測(cè)定 使用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量 (qRT-PCR) 引物，以actin基因作為內(nèi)參基因，測(cè)定CYP51和Cyt b基因的表達(dá)量，設(shè)計(jì)引物見表2。針對(duì)1.3.2.1節(jié)所選菌株，先將PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 的菌株于菌落邊緣取菌餅轉(zhuǎn)移至PDB 培養(yǎng)液中，28 ℃、145 r/min 下培養(yǎng)24 h，然后分別采用終濃度為10 μg/mL 的苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺以及100 μg/mL 的吡唑醚菌酯含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，以加入等量溶劑的PDB 為對(duì)照。參照RNA 提取試劑盒說明書提取上述各處理菌株的RNA，使用Vazyme HiScriptRIII RT SuperMix for qPCR (+ g DNA wiper) 試劑盒對(duì)RNA Sample 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序： 4 × g DNA wiper Mix 4 μL，RNA 樣品500 ng，加入RNase-free ddH2O 至16 μL，42 ℃條件下孵育5 min；加入5 × HiScript qRT Super Mix 4 μL，37 ℃條件下孵育15 min，85 ℃條件下孵育5 s。cDNA 產(chǎn)物置于 -20 ℃環(huán)境中保存。qRT-PCR 反應(yīng)體系：2 × ChamQ SYBR qPCR 10 μL，ddH2O 8.2 μL，引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，總體系20 μL。qRT-PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃，30 s 預(yù)變性；95 ℃，5 s，42 個(gè)循環(huán)，變性；60 ℃，30 s，42 個(gè)循環(huán)，退火/延伸。相對(duì)基因表達(dá)量參照 2-ΔΔCT方法計(jì)算[29]。每次試驗(yàn)含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)與3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表2 qRT-PCR 分析特異性引物Table 2 Specific primers for qRT-PCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理

將供試藥劑濃度轉(zhuǎn)換為濃度對(duì)數(shù)，抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值，使用probit 分析求回歸方程y= a +bx并計(jì)算EC50值。所有數(shù)據(jù)均采用Levene 檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析。敏感性分布采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)正態(tài)性，當(dāng)P＞ 0.05 時(shí)為正態(tài)分布；采用基于log10轉(zhuǎn)換的EC50值構(gòu)建直方圖，通過箱形圖識(shí)別異常值，繪制鱷梨蒂腐病菌對(duì)6 種殺菌劑的敏感性分布圖，并進(jìn)行正態(tài)分析[29-30]。以EC50值大于敏感性基線的5 倍為抗性菌株。統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 軟件 (V 21.0)和Tukey 檢驗(yàn)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MBCs 殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈的毒力及敏感性基線

多菌靈和甲基硫菌靈對(duì)供試101 個(gè)鱷梨蒂腐病菌菌株的EC50值范圍分別為0.01～0.19 μg/mL和0.02～2.19 μg/mL，2 種藥劑對(duì)蒂腐病菌均表現(xiàn)出很好的抑制活性。不同種類鱷梨蒂腐病菌對(duì)多菌靈的敏感性差異較小，平均EC50值在0.06～0.09 μg/mL 之間，對(duì)甲基硫菌靈的敏感性則存在較大差異，平均EC50值為0.50～1.03 μg/mL (表3)。

表3 不同種類鱷梨毛色二孢屬菌株對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈的敏感性Table 3 Sensitivity of different species of Lasiodiplodia spp.on avocado to carbendazim and thiophanate-methyl

58 個(gè)L.pseudotheobromae菌株對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈的敏感性均呈單峰曲線；依據(jù)箱形圖，多菌靈和甲基硫菌靈各刪除一個(gè)異常值后，所得敏感性頻率分布曲線經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)均呈正態(tài)分布(W= 0.970,df= 57，P= 0.171 和W= 0.986,df= 58，P= 0.761) (圖1A 和1B)，剔除異常值后平均EC50值分別為(0.06 ± 0.03)和(0.69 ± 0.47)μg/mL，該平均EC50值可分別作為鱷梨蒂腐病菌對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈的敏感性基線。參照所得敏感性基線，本研究中暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈已產(chǎn)生抗性的菌株。

圖1 鱷梨蒂腐病菌對(duì)6 種殺菌劑的敏感性頻率分布Fig.1 Frequency distribution of the sensitivity of Lasiodiplodia spp.to 6 fungicides

2.2 DMIs 殺菌劑苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺的毒力及敏感性基線

苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺對(duì)供試101 株鱷梨蒂腐病菌的EC50值范圍分別為0.04～9.64 μg/mL 和0.002～6.44 μg/mL。其中，苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺EC50值小于5 μg/mL 的菌株分別占92%和96%，表明2 種藥劑對(duì)大部分鱷梨蒂腐病菌均表現(xiàn)出很好的抑制活性。苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺對(duì)不同種類鱷梨蒂腐病菌的EC50值范圍分別為1.01～1.78 和0.80～1.34 μg/mL，其中L.pseudotheobromae和L.theobromae由于菌株數(shù)量較多，EC50值的范圍也較大 (表4)。

表4 不同種類鱷梨毛色二孢屬菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺的敏感性Table 4 Sensitivity of different species of Lasiodiplodia spp.on avocado to difenoconazole and prochloraz

58 個(gè)L.pseudotheobromae菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺的敏感性均呈單峰曲線；敏感性頻率經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)均呈正態(tài)分布(W= 0.976，df=58，P= 0.302 和W= 0.980，df= 58，P= 0.462)(圖1C 和1D)，未出現(xiàn)異常值，苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺的平均EC50值分別為 (1.31 ± 1.62) 和 (0.81 ±0.71) μg/mL，可將該平均EC50值分別作為鱷梨蒂腐病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺的敏感性基線。參照該敏感性基線，發(fā)現(xiàn)對(duì)苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)敏感性降低的鱷梨蒂腐病菌有8 株，對(duì)咪鮮胺表現(xiàn)敏感性降低的菌株有7 株。

2.3 QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯和嘧菌酯的毒力及敏感性分析

101 株鱷梨蒂腐病菌中，有1 個(gè)菌株在吡唑醚菌酯和嘧菌酯質(zhì)量濃度高達(dá)1000 μg/mL 時(shí)抑制率均低于10%，無法準(zhǔn)確計(jì)算其EC50值，因此統(tǒng)計(jì)時(shí)刪除了該菌株。吡唑醚菌酯和嘧菌酯對(duì)其余100 株病原菌的EC50值范圍分別在0.14～1292.96 μg/mL 和14.55～4789.25 μg/mL 之間，平均EC50值分別為371.03 和622.86 μg/mL。其中優(yōu)勢(shì)種L.pseudotheobromae和L.theobromae的菌株數(shù)量多，EC50值范圍較大。吡唑醚菌酯和嘧菌酯EC50值大于10 μg/mL 的菌株分別占供試菌株的91%和100%，表明供試絕大部分菌株對(duì)這2 種殺菌劑的敏感性均極低。不同種類鱷梨蒂腐病菌對(duì)吡唑醚菌酯和嘧菌酯的EC50平均值差異較大，但是5 種病原菌群體均對(duì)2 種藥劑表現(xiàn)出極低的敏感性 (表5)。

表5 不同種類鱷梨毛色二孢屬菌株對(duì)吡唑醚菌酯和嘧菌酯的敏感性Table 5 Sensitivity of different species of Lasiodiplodia spp.on avocado to pyraclostrobin and azoxystrobin

吡唑醚菌酯和嘧菌酯對(duì)57 個(gè)L.pseudotheobromae菌株的EC50平均值分別高達(dá)375.07 和721.32 μg/mL (表5)，經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)其敏感性頻率均為非正態(tài)分布 (W= 0.881,df= 57,P=0.00 和W= 0.954,df= 57,P= 0.03) (圖1E 和1F)。

2.4 殺菌劑靶標(biāo)基因序列分析

2.4.1CYP51基因序列及比對(duì) 使用特異性引物L(fēng)tCYP51-F 與LtCYP51-R 擴(kuò)增鱷梨蒂腐病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺不同抗性及敏感菌株CYP51基因的編碼區(qū)，擴(kuò)增出一段長約1700 bp 的序列，包含3 個(gè)內(nèi)含子，該序列共編碼了510 個(gè)氨基酸。將堿基序列在GenBank中進(jìn)行BLAST 搜索，結(jié)果顯示與L.theobromae(Genebank No.MK107983.1)的CYP51同源性為99%～100%。對(duì)不同菌株的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，除苯醚甲環(huán)唑的1 個(gè)敏感菌株在第207 位與其他菌株相比存在差異外，其余菌株的序列完全一致；這些表現(xiàn)低水平抗性的菌株，其CYP51基因與敏感菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株相比并沒有發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變 (圖2)。

圖2 苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺不同抗性及敏感菌株CYP51 基因氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment of CYP51 gene in different resistance and susceptible isolates of difenoconazole and prochloraz

2.4.2Cyt b基因序列及比對(duì) 使用特異性引物Cytb1-F/Cytb1-R 擴(kuò)增得到長度為466～481 bp 的Cyt b基因部分序列，無內(nèi)含子，可編碼155～160 個(gè)氨基酸。將供試菌株的Cyt b基因序列在GenBank 中進(jìn)行BLAST 搜索，結(jié)果顯示與L.theobromae菌株MCC2345 (Genebank No.MH880818.1) 同源性為99%～100%。將供試菌株的序列與MCC2345 菌株進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些表現(xiàn)高水平抗性的菌株，其Cyt b基因序列與敏感菌株相比也并未發(fā)現(xiàn)任何點(diǎn)突變 (圖3)。

圖3 吡唑醚菌酯和嘧菌酯不同抗性及敏感菌株Cyt b 基因序列比對(duì)Fig.3 Sequence alignment of Cyt b gene in the resistant and sensitive isolates of pyraclostrobin and azoxystrobin

2.5 殺菌劑靶標(biāo)基因表達(dá)量分析

2.5.1CYP51基因表達(dá)量 在10 μg/mL 苯醚甲環(huán)唑處理下，所有菌株CYP51基因相對(duì)表達(dá)量均明顯上調(diào)；其中，抗性菌株該基因的平均相對(duì)表達(dá)量為7.83，是敏感菌株的2.3 倍，即抗性菌株的相對(duì)表達(dá)量顯著高于敏感菌株 (圖4A) (P＜ 0.05)。在10 μg/mL 咪鮮胺脅迫下，所有菌株CYP51基因的相對(duì)表達(dá)量均大幅上調(diào)；其中，抗性菌株的平均相對(duì)表達(dá)量為26.07，是敏感菌株的8.2 倍，抗性菌株的相對(duì)表達(dá)量更遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于敏感菌株 (圖4B)(P＜ 0.05)。

圖4 苯醚甲環(huán)唑 (A) 及咪鮮胺 (B) 處理后抗性(R)與敏感(S)菌株CYP51 基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of CYP51 gene in the sensitive (S) or resistant (R) isolates after treatment with difenoconazole (A) and prochloraz (B)

2.5.2Cyt b基因表達(dá)量 經(jīng)100 μg/mL 吡唑醚菌酯處理后，抗性菌株Cyt b基因平均相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的5.30 倍，而敏感菌株平均相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的5.55 倍。 即在100 μg/mL 吡唑醚菌酯脅迫下，雖然所有菌株Cyt b基因相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，但抗性菌株與敏感菌株表現(xiàn)一致，二者之間沒有明顯的差異 (圖5) (P＜ 0.05)。

圖5 吡唑醚菌酯處理后抗性菌株 (R) 與敏感菌株 (S)Cyt b 基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of Cyt b gene in the sensitive(S) or resistant (R) isolates after treatment with pyraclostrobin

3 結(jié)論與討論

本研究供試的 101 個(gè)菌株除了 5 個(gè)未鑒定到種外，其他96 個(gè)菌株分別被劃歸為 4 個(gè)種，包括L.pseudotheobromae、L.theobromae、L.mahajangana和L.euphorbiaceicola。針對(duì)6 種殺菌劑，采用菌絲生長速率法對(duì)上述101 個(gè)鱷梨蒂腐病菌菌株進(jìn)行了敏感性測(cè)定，結(jié)果表明：不同藥劑處理對(duì)菌絲的抑制活性存在明顯差異，不同種鱷梨蒂腐病菌及同種不同菌株之間也均存在一定差異。所有供試鱷梨毛色二孢屬菌株對(duì)MBCs 殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈均表現(xiàn)為高度敏感，沒有出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性亞群體，且敏感性呈正態(tài)分布，可根據(jù)多菌靈和甲基硫菌靈的平均EC50值建立其敏感性基線，作為監(jiān)測(cè)田間鱷梨毛色二孢屬蒂腐病菌，尤其優(yōu)勢(shì)種L.pseudotheobromae對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈敏感性變化的參考標(biāo)準(zhǔn)。本研究中的絕大多數(shù)鱷梨蒂腐病菌菌株對(duì)DMIs殺菌劑苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺也呈現(xiàn)出較高的敏感性，敏感性頻率分布均呈單峰曲線和正態(tài)分布，同樣根據(jù)其平均EC50值建立敏感性基線，作為田間抗藥性監(jiān)測(cè)的參考標(biāo)準(zhǔn)。

據(jù)報(bào)道，MBCs 和DMIs 殺菌劑對(duì)采后病害往往具有高效，多菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑在田間的應(yīng)用可大幅度降低柑橘、芒果蒂腐病發(fā)生率[15,31]。咪鮮胺還是一種世界公認(rèn)的采后防腐殺菌劑，采前和采后應(yīng)用均可控制鱷梨和芒果等果實(shí)的采后腐爛[27]。本研究表明，上述4 種殺菌劑對(duì)Lasiodiplodiaspp.鱷梨蒂腐病菌均有明顯抑制活性，其中多菌靈效果最好。相比較而言，DMIs 殺菌劑對(duì)鱷梨蒂腐病菌的抑制效果低于MBCs 殺菌劑，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果類似[27]。病原菌抗藥性的產(chǎn)生除了與殺菌劑本身化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理有關(guān)外，還與殺菌劑施加選擇壓力的頻率和持續(xù)時(shí)間有關(guān)。雖然MBCs 殺菌劑普遍具有高抗性風(fēng)險(xiǎn)，但菌株敏感性分布因殺菌劑使用歷史和使用水平的不同而存在差異。有研究表明，巴西木瓜、海南芒果蒂腐病菌L.theobromae對(duì)該類殺菌劑產(chǎn)生了抗性，對(duì)一些抗藥性菌株的EC50值甚至超過了1000 μg/mL[32-34]。本研究中也有少數(shù)供試菌株出現(xiàn)了對(duì)苯醚甲環(huán)唑或咪鮮胺敏感性下降的現(xiàn)象。因此，在鱷梨蒂腐病菌尚未產(chǎn)生抗藥性之前，雖然上述殺菌劑、尤其是MBCs殺菌劑是控制鱷梨蒂腐病的優(yōu)先選擇，但在應(yīng)用中還須密切監(jiān)測(cè)其抗性變化情況，以防止田間抗性種群的形成并導(dǎo)致藥劑防治失效。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，QoIs 殺菌劑吡唑醚菌酯和嘧菌酯能夠顯著抑制病原菌菌絲生長，明顯降低由可可毛色二孢L.theobromae引起的蒂腐病或枝枯病的發(fā)生[35-36]。然而本研究發(fā)現(xiàn)，供試菌株對(duì)這2 種殺菌劑的敏感性均極低，且敏感性呈非正態(tài)分布。由于不同菌株EC50值差異極大，本研究試驗(yàn)不斷調(diào)整供試藥劑濃度進(jìn)行了多次測(cè)定及重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果是一致的。另外，由于L.mahajangana和L.euphorbiaceicola菌株數(shù)量太少，主要針對(duì)L.pseudotheobromae和L.theobromae進(jìn)行不同種類病原菌之間比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者的EC50值分布相似，平均EC50值也接近，從而排除了病原菌種類的影響。100 個(gè)菌株中，吡唑醚菌酯和嘧菌酯EC50值大于10 μg/mL 的分別有92 株(91%) 和100 株(100%)，平均EC50值分別高達(dá)371.03 μg/mL和622.86 μg/mL，初步認(rèn)為鱷梨蒂腐病菌群體呈現(xiàn)嚴(yán)重的抗藥性分化。QoIs 也是高抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑，本研究表明此類藥劑不宜用于鱷梨蒂腐病的防治。在木瓜和芒果上也有過類似的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)蒂腐病菌L.theobromae對(duì)該類殺菌劑產(chǎn)生了嚴(yán)重抗性[32,37]。鑒于該類殺菌劑在國內(nèi)鱷梨生產(chǎn)上的應(yīng)用水平較低，使用年限也不長，出現(xiàn)如此嚴(yán)重抗性的原因還有待進(jìn)一步研究。總的來說，鱷梨蒂腐病菌對(duì)殺菌劑的潛在抗性風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，生產(chǎn)上在應(yīng)用殺菌劑時(shí)必須嚴(yán)格控制劑量和用藥頻次，盡量降低藥劑的選擇壓以防止和延緩田間群體抗藥性的產(chǎn)生及發(fā)展。

大量研究已證實(shí)，病原菌對(duì)殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生常常與靶標(biāo)基因的突變有關(guān)。例如：DMIs 殺菌劑的靶標(biāo)基因CYP51和QoIs 殺菌劑靶標(biāo)基因Cyt b的點(diǎn)突變，將導(dǎo)致藥劑與病原菌親和力降低，從而產(chǎn)生抗藥性[38-41]。本研究發(fā)現(xiàn)存在對(duì)DMIs 藥劑敏感性下降的菌株 (低抗菌株)，以及對(duì)QoIs 藥劑敏感性極低的菌株 (高抗菌株)，因而針對(duì)上述菌株進(jìn)一步進(jìn)行了靶標(biāo)基因的克隆、測(cè)序及比較。結(jié)果表明，無論是對(duì)咪鮮胺表現(xiàn)低水平抗性菌株 (EC50＞ 5 μg/mL) 的CYP51基因，還是對(duì)吡唑醚菌酯表現(xiàn)高水平抗性菌株 (EC50＞ 500 μg/mL) 的Cyt b基因，其基因序列均沒有發(fā)現(xiàn)任何點(diǎn)突變。研究顯示，病原菌抗藥性的產(chǎn)生也有可能與靶標(biāo)基因的過表達(dá)相關(guān)。如：對(duì)DMIs 抑制劑的抗性主要與CYP51基因的點(diǎn)突變或過量表達(dá)相關(guān)[38]，對(duì)QoIs 抑制劑的抗性則在很大程度上取決于靶標(biāo)基因Cyt b點(diǎn)突變或基因表達(dá)水平變化[42]。本研究針對(duì)靶標(biāo)基因CYP51和Cyt b基因的測(cè)定結(jié)果表明：在苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺脅迫下，其抗性菌株靶標(biāo)基因CYP51表達(dá)水平顯著高于敏感菌株；但是在吡唑醚菌酯脅迫下，抗性菌株靶標(biāo)基因Cyt b表達(dá)水平與敏感菌株之間沒有差異。有研究指出，在很少或從未使用過該類殺菌劑的歷史背景下，大量馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani菌株對(duì)QoIs 殺菌劑即表現(xiàn)為不敏感，其原因并非由于產(chǎn)生抗藥性所致[43]。因此，本研究中鱷梨蒂腐病菌對(duì)供試2 個(gè)QoIs 殺菌劑表現(xiàn)出如此低的敏感性，其原因是自身的耐藥性還是由于產(chǎn)生了非靶標(biāo)抗性，是一個(gè)值得關(guān)注的問題，還需進(jìn)一步研究探明。

據(jù)我們所知，本研究是國內(nèi)首次針對(duì)鱷梨蒂腐病菌進(jìn)行的殺菌劑敏感性測(cè)定和抗藥性報(bào)道，研究結(jié)果將有助于國內(nèi)鱷梨蒂腐病科學(xué)防控策略的制定，并對(duì)我國鱷梨產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義?？偟膩碚f，鱷梨商業(yè)化種植在國內(nèi)的發(fā)展歷史較短，病蟲害防治等生產(chǎn)管理技術(shù)相對(duì)落后，嚴(yán)重影響了其規(guī)模化種植及品質(zhì)的提高。鑒于目前國內(nèi)對(duì)鱷梨病蟲害防治的深入研究較少，缺乏科學(xué)的綜合防治措施，因此在本研究結(jié)果基礎(chǔ)上，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大調(diào)查范圍，采集更多的菌株就鱷梨蒂腐及其他病害展開研究，建立抗藥性的長期監(jiān)測(cè)體系勢(shì)在必行。