缺氧誘導(dǎo)因子1α 通過介導(dǎo)鐵死亡影響動脈粥樣硬化的機制研究

蔡薈芝，羅玲

作者單位：710000 陜西省西安市，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性和代謝性疾病，可引起心臟疾病、缺血性腦卒中和外周動脈疾病，其以脂質(zhì)積累和炎癥浸潤為主要病理特征。研究表明，在動脈粥樣硬化初始階段，循環(huán)中的單核細胞通過功能失調(diào)的內(nèi)皮細胞遷移至內(nèi)膜，后分化為巨噬細胞［1］。巨噬細胞可結(jié)合氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），但當(dāng)ox-LDL含量增多并超過巨噬細胞的清除能力時，巨噬細胞因內(nèi)部的脂肪含量過高而出現(xiàn)泡沫化，而巨噬細胞泡沫化被認為是動脈粥樣硬化壞死核心形成的關(guān)鍵步驟［2］。因此，阻止巨噬細胞泡沫化是動脈粥樣硬化的治療靶點。

鐵死亡是一種新的細胞死亡形式，其特點是鐵積累過多和脂質(zhì)過氧化［3］。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase 4，GPX4）是一種關(guān)鍵的抗鐵死亡酶，其可將脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇，研究顯示，心肌細胞敲除GPX4基因后，發(fā)生了脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致細胞鐵死亡增加；而GPX4過表達可減少脂質(zhì)過氧化，抑制動脈粥樣硬化進展［4］。研究證實，鐵死亡可誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定，而巨噬細胞泡沫化是晚期動脈粥樣硬化斑塊的一個重要特征，其有助于動脈粥樣硬化壞死核心的形成，并導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定［5］。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducing factor 1α，HIF-1α）與動脈粥樣硬化之間存在密切關(guān)系。在缺氧條件下，HIF-1α的泛素化和降解過程被抑制，導(dǎo)致HIF-1α迅速累積，啟動和促進巨噬細胞泡沫化、內(nèi)皮細胞功能障礙，加重炎癥反應(yīng)，促進血管生成及動脈粥樣硬化［6］。HIF-1α被證實是動脈粥樣硬化中與鐵死亡相關(guān)的差異表達基因，PX-478是小分子量化合物，其可以特異性地抑制HIF-1α［7］。因此，推測調(diào)節(jié)鐵死亡可成為動脈粥樣硬化的潛在治療方法。本研究旨在探討HIF-1α通過介導(dǎo)鐵死亡影響動脈粥樣硬化的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 人體試驗

1.1.1 研究對象

選取2022年2月—2023年6月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的6例行頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)的頸動脈粥樣硬化患者的手術(shù)標(biāo)本為頸動脈粥樣硬化組，6例因糖尿病動脈閉塞所致下肢壞死而截肢者的手術(shù)標(biāo)本為糖尿病動脈閉塞組，6例下肢動脈粥樣硬化患者的手術(shù)標(biāo)本為下肢動脈粥樣硬化組，6例先天性四肢動靜脈瘺患者的手術(shù)標(biāo)本為正常組。

1.1.2 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

將四組手術(shù)標(biāo)本縱向切開并暴露動脈內(nèi)膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，后依次將切片放入二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、95%乙醇溶液5 min、90%乙醇溶液5 min、80%乙醇溶液5 min、70%乙醇溶液5 min，后采用蒸餾水清洗，進行HE染色，將切片脫水、封固后采用顯微鏡觀察。

1.1.3 油紅O染色

將四組手術(shù)標(biāo)本縱向切開并暴露動脈內(nèi)膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，采用0.5%油紅O溶液染色30 min，后用60%異丙醇浸洗，將切片脫水、封固后采用顯微鏡觀察。

1.1.4 透射電子顯微鏡檢查

將四組手術(shù)標(biāo)本置于0.1 mmol/L 2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液（pH值7.4）中固定，室內(nèi)放置2～3 h，采用2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液洗滌3次，采用1%鋨酸水溶液在4 ℃下固定2 h，后分別采用10%、30%、50%、70%、90%、100%乙醇脫水，采用3%醋酸鈾酰和枸櫞酸鉛進行雙染色，在LVEM5臺式透射電子顯微鏡下觀察動脈結(jié)構(gòu)變化。

1.1.5 Western blotting法檢測GPX4、HIF-1α表達水平

將四組手術(shù)標(biāo)本冷凍在液氮中，在RIPA緩沖液中剪碎組織后，4 ℃下12 000 r/min離心15 min（離心半徑6.0 cm），收集上清液，采用BCA法測定樣品中總蛋白濃度。每個樣品分離50 μg蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在含有0.05% Tween-20的tris緩沖液（tris buffered saline，TBS）中加入5%干奶粉，室溫封閉2 h后加入GPX4抗體（67763-1-Ig）、HIF-1α抗體（BF8002）與抗GAPDH小鼠單克隆抗體（60004-1-Ig），于4 ℃環(huán)境下孵育過夜，加入經(jīng)辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）處理的二抗，室溫孵育1 h，采用Image J軟件分析各目的蛋白條帶的灰度值。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗時間、實驗動物及分組

實驗時間：2022年3月—2023年6月。從西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗室實驗動物中心選取ApoE-/-C57BL/6小鼠（4周齡）18只。將小鼠置于溫度控制的環(huán)境中（溫度24～25 ℃，相對濕度55%），光照12 h/黑暗12 h，自由攝入食物和水。采用簡單隨機法將小鼠分為對照組、高脂肪飲食（high fat diet，HFD）組、PX-478組，每組6只。對照組小鼠采用正常飼料喂養(yǎng)；HFD組和PX-478組小鼠采用HFD連續(xù)喂養(yǎng)5個月。之后PX-478組小鼠給予PX-478 5 mg·kg-1·d-1，每2 d腹腔注射1次；對照組和HFD組小鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液，每2 d腹腔注射1次，均連續(xù)給藥2個月。腹腔注射結(jié)束后處死小鼠，取其主動脈。

1.2.2 HE染色

將小鼠主動脈竇縱向切開并暴露內(nèi)膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，檢測方法同1.1.2。

1.2.3 油紅O染色將小鼠主動脈竇縱向切開并暴露內(nèi)膜表面，采用4%多聚甲醛溶液固定過夜，切片，檢測方法同1.1.3。

1.2.4 Russell-Movall五色染色

Russell-Movall五色染色試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司。將小鼠主動脈竇縱向切開并暴露內(nèi)膜表面，石蠟封層，后進行脫蠟；采用試劑盒A液染色20 min，之后采用流水沖洗5 min；采用試劑盒B液染色1 h，之后采用流水沖洗20 min；采用試劑盒C液染色15 min，之后采用蒸餾水沖洗5次；采用試劑盒D液分化至彈力纖維與背景對比鮮明，然后采用蒸餾水清洗5次；采用試劑盒E液染色1 min，之后采用流水沖洗5 min、蒸餾水稍洗；采用試劑盒F液染色1～5 min，之后采用蒸餾水沖洗5次、0.5%醋酸稍洗；采用試劑盒G液染色2次、5 min/次，之后采用0.5%醋酸稍洗，然后速洗3次；采用試劑盒H液染色15 min，然后快洗3次；采用二甲苯透明2～3次，然后采用人工樹脂封固。測量斑塊面積、脂質(zhì)面積和黏蛋白面積。

1.2.5 Western blotting法檢測HIF-1α表達水平

將小鼠主動脈標(biāo)本冷凍在液氮中，其余步驟同1.1.5。

1.3 細胞實驗

1.3.1 實驗時間

2022年3月—2023年6月。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

THP-1細胞購自北京伊萊瑞生物科技有限公司，將THP-1細胞在PRMI-1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素）中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2的潮濕孵化箱中。將THP-1細胞接種于6孔板中，每孔1×106個細胞，采用100 nmol/L佛波酯處理48 h，以誘導(dǎo)THP-1細胞向巨噬細胞分化。將THP-1巨噬細胞分為THP-1巨噬細胞組、ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組，其中ox-LDL組加入100 μg/ml ox-LDL并孵育48 h，ox-LDL＋PX-478組加入100 μg/ml ox-LDL 和PX-478（100 μmol/L）并孵育48 h。

1.3.3 Western blotting法檢測GPX4、HIF-1α表達水平

用含有Roche蛋白酶抑制劑和磷酸鹽抑制劑的RIPA緩沖液在冰上裂解三組細胞。細胞裂解物進行SDS-PAGE，4 ℃下12 000 r/min離心15 min（離心半徑6.0 cm），收集上清液，采用BCA法測定樣品中總蛋白濃度，之后操作步驟同1.1.5。

1.3.4 Mito-Tracker染色法

使用Mito-Tracker染色法對三組細胞進行染色，具體方法為：在三組細胞中加入提前配制好的Mito-Tracker Red氯甲基-X-迷迭胺（chloromethyl-X-rosemary amine，CMXRos），于37 ℃陰暗環(huán)境中孵育30 min，后采用PBS洗滌，用4%多聚甲醛溶液固定，在室溫下靜置15 min，使用熒光顯微鏡計數(shù)20倍鏡下隨機5個視野中染色的細胞〔即活性氧（reactive oxygen species，ROS）陽性細胞〕數(shù)，求平均值。

1.3.5 鐵含量測定

將三組細胞接種于24孔板，密度為2×103個/孔，采用細胞內(nèi)鐵比色測定試劑盒（E1042）檢測鐵含量。

1.3.6 谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定

將三組細胞接種于24孔板，密度為2×103個/孔，收集細胞進行裂解，使用谷胱甘肽測定試劑盒（A006-2）檢測GSH水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人體試驗結(jié)果

2.1.1 HE染色和油紅O染色

HE染色結(jié)果顯示，與正常組相比，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈中可見內(nèi)膜增厚、纖維帽和核心壞死的動脈粥樣硬化斑塊，見圖1。油紅O染色結(jié)果顯示，與正常組相比，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈內(nèi)膜存在廣泛的脂質(zhì)沉積，見圖2。

圖1 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining results of normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

圖2 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組油紅O染色結(jié)果Figure 2 Oil red O staining results of normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

2.1.2 透射電子顯微鏡檢查

透射電子顯微鏡檢查結(jié)果顯示，與正常組相比，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈中線粒體普遍較小，線粒體嵴模糊，見圖3。

圖3 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組透射電子顯微鏡檢查結(jié)果Figure 3 Transmission electron microscopy examination results of normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

2.1.3 GPX4、HIF-1α表達水平

四組GPX4、HIF-1α表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中下肢動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和頸動脈粥樣硬化組GPX4表達水平低于正常組，HIF-1α表達水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組GPX4、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels in normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

表1 正常組、頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組GPX4、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels in normal group，carotid atherosclerosis group，diabetes artery occlusion group and lower extremity atherosclerosis group

注：GPX4=谷胱甘肽過氧化物酶4，HIF-1α=缺氧誘導(dǎo)因子1α；a表示與正常組比較，P＜0.05。

組別例數(shù)GPX4HIF-1α正常組61.31±0.431.01±0.31下肢動脈粥樣硬化組60.51±0.42a1.92±0.46a糖尿病動脈閉塞組60.59±0.33a2.56±0.39a頸動脈粥樣硬化組60.71±0.38a1.89±0.38a F值5.2016.10 P值0.04＜0.01

2.2 動物實驗結(jié)果

2.2.1 HE染色、油紅O染色

HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，HFD組小鼠主動脈竇中斑塊形成，膠原纖維沉積；與HFD組相比，PX-478組小鼠主動脈竇中斑塊形成、膠原纖維沉積減少，見圖4。油紅O染色結(jié)果顯示，與對照組相比，HFD組小鼠主動脈竇中脂質(zhì)沉積；與HFD組相比，PX-478組小鼠主動脈竇中脂質(zhì)沉積減少，見圖5。

圖4 對照組、HFD組、PX-478組HE染色結(jié)果Figure 4 HE staining results of control group，HFD group，PX-478 group

圖5 對照組、HFD組、PX-478組油紅O染色結(jié)果Figure 5 Oil red O staining results of control group，HFD group，and PX-478 group

2.2.2 斑塊面積、脂質(zhì)面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平

三組斑塊面積、脂質(zhì)面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HFD組斑塊面積、脂質(zhì)面積、黏蛋白面積大于對照組和PX-478組，HIF-1α表達水平高于對照組和PX-478組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 對照組、HFD組、PX-478組斑塊面積、脂質(zhì)面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of plaque area，lipid area，mucin area and HIF-1α expression level in control group，HFD group，PX-478 group

表2 對照組、HFD組、PX-478組斑塊面積、脂質(zhì)面積、黏蛋白面積、HIF-1α表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of plaque area，lipid area，mucin area and HIF-1α expression level in control group，HFD group，PX-478 group

注：HFD=高脂肪飲食；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與HFD組比較，P＜0.05。

組別只數(shù) 斑塊面積（mm2）脂質(zhì)面積（mm2）黏蛋白面積（mm2）HIF-1α對照組60.54±0.14 0.62±0.31 0.49±0.22 0.96±0.24 HFD組6 1.22±0.34a 1.16±0.37a 1.19±0.42a 1.85±0.31a PX-478組6 0.66±0.42b 0.58±0.41b 0.54±0.36b 1.06±0.36b t值7.598.416.439.02 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 細胞實驗結(jié)果

三組GPX4表達水平、HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數(shù)、鐵含量、GSH水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平低于THP-1巨噬細胞組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數(shù)、鐵含量高于THP-1巨噬細胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平高于ox-LDL組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數(shù)、鐵含量低于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 THP-1巨噬細胞組、ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4、HIF-1α表達水平及ROS陽性細胞數(shù)、鐵含量、GSH水平比較（±s，n=6）Table 3 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels，ROS positive cells，iron content，GSH level in THP-1 macrophage group，ox-LDL group，ox-LDL＋PX-478 group

表3 THP-1巨噬細胞組、ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4、HIF-1α表達水平及ROS陽性細胞數(shù)、鐵含量、GSH水平比較（±s，n=6）Table 3 Comparison of GPX4 and HIF-1α expression levels，ROS positive cells，iron content，GSH level in THP-1 macrophage group，ox-LDL group，ox-LDL＋PX-478 group

注：ROS=活性氧，GSH=谷胱甘肽，ox-LDL=氧化型低密度脂蛋白；a表示與THP-1巨噬細胞組比較，P＜0.05；b表示與ox-LDL組比較，P＜0.05。

組別GPX4HIF-1αROS陽性細胞數(shù)（×106/L）鐵含量（μmol）GSH（μmol）THP-1巨噬細胞組1.19±0.411.22±0.5811.13±1.331.56±0.2811.21±0.98 ox-LDL組0.52±0.32a4.77±0.64a78.98±3.23a3.17±0.41a7.71±0.86a ox-LDL＋PX-478組0.64±0.33ab2.09±0.55ab54.64±2.33ab2.01±0.36ab9.09±0.62ab F值5.459.4356.5610.4213.33 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

研究顯示，鐵死亡是鐵依賴性調(diào)節(jié)性細胞死亡形式，與細胞凋亡、壞死性凋亡和其他類型的細胞死亡不同［8］。研究顯示，抑制THP-1細胞向巨噬細胞分化及ox-LDL的促動脈粥樣硬化作用可抑制鐵死亡［9］。本研究人體試驗結(jié)果顯示：頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組動脈中可見內(nèi)膜增厚、纖維帽和核心壞死的動脈粥樣硬化斑塊；動脈內(nèi)膜存在廣泛的脂質(zhì)沉積；動脈中線粒體普遍較小，線粒體嵴模糊。同時，頸動脈粥樣硬化組、糖尿病動脈閉塞組和下肢動脈粥樣硬化組GPX4表達水平低于正常組，HIF-1α表達水平高于正常組，表明動脈粥樣硬化過程中存在鐵死亡現(xiàn)象。研究顯示，隨著動脈粥樣硬化的進展，斑塊的生長會導(dǎo)致血管狹窄，從而限制血液中的氧氣擴散到斑塊區(qū)域的能力。隨著斑塊的發(fā)展，氧氣擴散到斑塊的減少可能導(dǎo)致斑塊內(nèi)部缺氧，導(dǎo)致動脈粥樣硬化晚期斑塊中心出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象，而斑塊中心缺氧可能導(dǎo)致一些具有促動脈粥樣硬化作用的分子和細胞的積累，如巨噬細胞和泡沫細胞等，這些細胞在缺氧環(huán)境下會釋放出一些炎癥因子和細胞因子等，如HIF-1α［10］。在缺氧條件下，HIF-1α聚集并易位到細胞核，激活其功能靶基因，且HIF-1α調(diào)控基因?qū)用}粥樣硬化的進展有促進作用［11］。

研究表明，HIF-1α的積累與細胞外脂質(zhì)核心的存在有關(guān)，并與巨噬細胞和巨噬泡沫細胞之間有很好的共定位［12］。PX-478是一種抑制HIF-1α的特異性小分子抑制劑，其通過調(diào)節(jié)參與膽固醇代謝的肝臟基因而降低膽固醇水平，最終抑制動脈粥樣硬化斑塊形成或脂質(zhì)的發(fā)展［13］。本研究動物實驗結(jié)果顯示，HFD組小鼠主動脈竇中斑塊形成，膠原纖維沉積，脂質(zhì)沉積；PX-478組小鼠主動脈竇中斑塊形成、膠原纖維沉積、脂質(zhì)沉積減少；HFD組斑塊面積、脂質(zhì)面積、黏蛋白面積大于對照組和PX-478組，HIF-1α表達水平高于對照組和PX-478組。表明選擇性HIF-1α抑制劑——PX-478可通過下調(diào)HIF-1α表達水平縮小斑塊面積、脂質(zhì)面積、黏蛋白面積，進而抑制動脈粥樣硬化，提示PX-478是一種潛在的抗動脈粥樣硬化藥物。

研究顯示，抑制鐵死亡可以減輕脂質(zhì)過氧化，從而減輕動脈粥樣硬化小鼠主動脈內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮功能障礙［9］。敲除HIF-1α基因能抑制巨噬細胞泡沫化，也可抑制M1型巨噬細胞的分化，降低炎癥基因的表達，進而減輕動脈粥樣硬化［14-15］。本研究細胞實驗結(jié)果顯示，ox-LDL組和ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平低于THP-1巨噬細胞組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數(shù)、鐵含量高于THP-1巨噬細胞組；ox-LDL＋PX-478組GPX4表達水平、GSH水平高于ox-LDL組，HIF-1α表達水平、ROS陽性細胞數(shù)、鐵含量低于ox-LDL組。表明ox-LDL可增加脂質(zhì)ROS生成，降低GSH水平，促進鐵死亡，而PX-478可抑制ox-LDL的上述作用。

4 結(jié)論

綜上所述，動脈粥樣硬化過程中存在鐵死亡現(xiàn)象，HIF-1α表達水平升高；下調(diào)HIF-1α表達可減少ROS生成，升高GSH水平，抑制鐵死亡，從而減輕動脈粥樣硬化。但本研究為單中心、小樣本量基礎(chǔ)研究，其結(jié)論需要在多中心、大樣本量臨床研究中進一步證實。

作者貢獻：蔡薈芝、羅玲進行文章的構(gòu)思與設(shè)計；蔡薈芝進行研究的實施與可行性分析、資料整理、論文撰寫及修訂；羅玲進行資料收集、統(tǒng)計學(xué)處理，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。