基于生物信息學(xué)技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選急性心肌梗死核心基因

李淑娟，柯妍，劉旭東，賀茜，徐遙琴，田宇佳，盧冠軍，馬娟，朱澈，汪樂新，

作者單位：1.750004 寧夏回族自治區(qū)銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診科 2.750003 寧夏回族自治區(qū)銀川市第一人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科 3.750004 寧夏回族自治區(qū)銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心胸外科 4.750004 寧夏回族自治區(qū)銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué) 5.750001 寧夏回族自治區(qū)銀川市婦幼保健院兒科

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）指動(dòng)脈內(nèi)壁斑塊導(dǎo)致流向心臟的血液減少甚至中斷，進(jìn)而使心肌細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧性損傷［1］。但心肌細(xì)胞是永久性細(xì)胞，其損傷后一般不能再生［2］，故早期篩查AMI高風(fēng)險(xiǎn)人群具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來生物信息學(xué)技術(shù)在疾病診斷和預(yù)測方面應(yīng)用廣泛，而基因代謝組學(xué)作為生物信息學(xué)技術(shù)，其主要探究基因與疾病的關(guān)系［3-4］。目前，基于基因代謝組學(xué)探究肝癌、胃癌等核心基因的文獻(xiàn)較多［5-6］，但應(yīng)用該技術(shù)篩選AMI核心基因的報(bào)道較少。機(jī)器學(xué)習(xí)是基于數(shù)據(jù)構(gòu)建的計(jì)算模型。本研究旨在通過生物信息學(xué)技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選AMI核心基因并進(jìn)行驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間

本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2021—2022年。

1.2 采用生物信息學(xué)技術(shù)篩選差異表達(dá)基因

1.2.1 數(shù)據(jù)來源

從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載與AMI相關(guān)的3個(gè)mRNA基因芯片數(shù)據(jù)集（GSE34198、GSE66360和GSE83500），其中GSE66360〔非AMI患者20例（對(duì)照組），AMI患者17例（AMI組）〕和GSE83500〔健康對(duì)照者46例（對(duì)照組），AMI患者49例（AMI組）〕為測試集，GSE34198〔健康對(duì)照者46例（對(duì)照組），AMI患者49例（AMI組）〕為驗(yàn)證集。

1.2.2 篩選差異表達(dá)基因

運(yùn)用R 4.2.0軟件中的“l(fā)imma包”，以|log2FC|＞1、P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選GSE66360和GSE83500中差異表達(dá)基因。

1.2.3 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析

應(yīng)用差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，分析其主要富集的生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）；通過Metascape官網(wǎng)（https://metascape.org）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.3 采用機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選核心基因

使用LASSO回歸方法縮小差異表達(dá)基因的范圍，然后使用支持向量機(jī)-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）方法在差異表達(dá)基因中尋找特征基因，取兩種機(jī)器學(xué)習(xí)算法的交集，即為核心基因。

1.4 核心基因表達(dá)水平及預(yù)測能力

比較測試集中AMI組和對(duì)照組核心基因表達(dá)水平，繪制ROC曲線以評(píng)估核心基因表達(dá)水平對(duì)測試集、驗(yàn)證集受試者發(fā)生AMI的預(yù)測價(jià)值，AUC為0.5～1.0，其值越大提示核心基因表達(dá)水平對(duì)AMI的預(yù)測價(jià)值越高。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證核心基因

1.5.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞株H9C2購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.5.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

胎牛血清（Gibco，美國），DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國），總RNA提取試劑盒（Axygen，美國），PrimeScript? RT reagent Kit（Takara，日本），TB Green? Premix Ex Taq? Ⅱ（Takara，日本），IL1R2、NR4A2、TREM1引物〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕；微量臺(tái)式離心機(jī)（5810R）（Eppendorf，德國），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）（德國耶拿分析儀器股份公司），厭氧培養(yǎng)袋及厭氧產(chǎn)氣包（AnaeroPack-Anaero）（三菱公司，日本）。

1.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞，將其置于37 ℃、95% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.5.4 構(gòu)建衰老心肌細(xì)胞模型及分組

采用D-半乳糖8 mg/ml刺激第2代心肌細(xì)胞9 d以制備衰老心肌細(xì)胞。將衰老心肌細(xì)胞按5×106個(gè)的數(shù)量接種到25T培養(yǎng)瓶中，然后隨機(jī)將其分為正常氧組和缺氧/復(fù)氧組，其中正常氧組心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞缺氧3 h后復(fù)氧2 h，以制備AMI細(xì)胞模型。

1.5.5 qPCR法檢測IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量

在25T培養(yǎng)瓶中收集正常氧組和缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。基因引物序列和產(chǎn)物長度見表1，擴(kuò)增條件見表2。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)9次。

表1 基因引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 Gene primer sequence and product length

表2 基因引物擴(kuò)增條件Table 2 Gene primer amplification conditions

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

從GSE66360和GSE83500中篩選出145個(gè)AMI差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因125個(gè)、下調(diào)差異表達(dá)基因20個(gè)，見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖Figure 1 Volcano map of differentially expressed genes

2.2 GO功能富集分析結(jié)果

GO功能富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要涉及的BP為細(xì)菌的防御反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化性、粒細(xì)胞趨化性、中性粒細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞遷移、骨髓白細(xì)胞遷移、白細(xì)胞趨化性、細(xì)胞對(duì)白介素1的反應(yīng)、白介素1介導(dǎo)的信號(hào)通路；主要涉及的CC為三級(jí)顆粒、特殊顆粒、分泌顆粒管腔、細(xì)胞質(zhì)小泡腔、富含纖維膠凝蛋白1的顆粒膜、特殊顆粒管腔、三級(jí)顆粒膜、液泡管腔；主要涉及的MF為碳水化合物的結(jié)合物、免疫受體活性、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結(jié)合物、IgG結(jié)合物、病毒顆粒結(jié)合物、細(xì)胞核糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合物、肽聚糖溶血活性、核視黃醇X受體結(jié)合物、低聚糖結(jié)合物、調(diào)理素結(jié)合物。

2.3 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要涉及的信號(hào)通路為天然免疫反應(yīng)應(yīng)答、吞噬細(xì)胞殺傷的正性調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。

2.4 核心基因

在差異表達(dá)基因中，通過LASSO回歸分析篩選出10個(gè)特征基因，見圖2；通過SVM-RFE方法篩選出10個(gè)特征基因，見圖3；取交集得到9個(gè)核心基因，分別為NFIL3、IL1R2、NR4A2、IRAK3、VCAN、CCL20、TREM1、LYZ、ITLN1，見圖4。

圖2 差異表達(dá)基因的LASSO回歸分析結(jié)果Figure 2 LASSO regression analysis results of differentially expressed genes

圖3 差異表達(dá)基因的SVM-RFE方法分析結(jié)果Figure 3 SVM-RFE method analysis results of differentially expressed genes

圖4 差異表達(dá)基因的韋恩圖Figure 4 Venn diagram of differentially expressed genes

2.5 AMI核心基因表達(dá)水平及其預(yù)測價(jià)值

在測試集中，AMI組僅IL1R2、NR4A2、TREM1表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。ROC曲線分析結(jié)果顯示，IL1R2、NR4A2、TREM1 表達(dá)水平預(yù)測測試集受試者發(fā)生A M I 的AUC分別為0.648〔95%CI（0.534～0.756）〕、0.623〔95%CI（0.511～0.728）〕、0.622〔95%CI（0.502～0.730）〕，見圖6；IL1R2、NR4A2、TREM1 表達(dá)水平預(yù)測驗(yàn)證集受試者發(fā)生A M I 的AUC分別為0.834〔95%CI（0.761～0.898）〕、0.866〔95%CI（0.802～0.923）〕、0.808〔95%CI（0.729～0.880）〕，見圖7。

圖5 測試集中對(duì)照組與AMI組IL1R2、NR4A2、TREM1表達(dá)水平比較的箱式圖Figure 5 Box plot of comparison of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels between the control group and the AMI group

圖6 IL1R2、NR4A2、TREM1表達(dá)水平預(yù)測測試集受試者發(fā)生AMI的ROC曲線Figure 6 ROC curve of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels in predicting AMI in subjects in test set

圖7 IL1R2、NR4A2、TREM1表達(dá)水平預(yù)測驗(yàn)證集受試者發(fā)生AMI的ROC曲線Figure 7 ROC curve of IL1R2，NR4A2 and TREM1 expression levels in predicting AMI in subjects in validation set

2.6 qRT-PCR法驗(yàn)證核心基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 正常氧組與缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=9）Table 3 Comparison of relative expression levels of IL1R2，NR4A2 and TREM1 mRNA between normal oxygen group and hypoxia/reoxygenation group

表3 正常氧組與缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=9）Table 3 Comparison of relative expression levels of IL1R2，NR4A2 and TREM1 mRNA between normal oxygen group and hypoxia/reoxygenation group

組別IL1R2NR4A2TREM1正常氧組0.187±0.0430.127±0.0440.424±0.279缺氧/復(fù)氧組0.245±0.0290.257±0.0292.784±2.639 t值3.3157.3742.668 P值0.004＜0.0010.028

3 討論

AMI發(fā)病迅速且具有較高的死亡率［7-8］。目前，冠狀動(dòng)脈造影是診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其屬于有創(chuàng)檢查，故尋找AMI非創(chuàng)傷性診斷方法具有臨床價(jià)值。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出9個(gè)AMI核心基因，且在測試集中，AMI組僅IL1R2、NR4A2、TREM1表達(dá)水平高于對(duì)照組；ROC曲線分析結(jié)果顯示，IL1R2、NR4A2、TREM1表達(dá)水平預(yù)測測試集受試者發(fā)生AMI的AUC分別為0.648、0.623、0.622，三者預(yù)測驗(yàn)證集受試者發(fā)生AMI的AUC分別為0.834、0.866、0.808；且缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞IL1R2、NR4A2、TREM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常氧組，提示IL1R2、NR4A2、TREM1是AMI核心基因。

RONG 等［9］研究表明，IL1R2 基因多態(tài)性（rs11674595、rs4851527、rs2072472和rs3218977）可能與中國漢族人群骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病有關(guān)，但其在AMI中的作用有待深入挖掘。NR4A2屬于核受體4A亞家族，其編碼類固醇甲狀腺激素類維生素A受體，是核受體轉(zhuǎn)錄因子，而核受體轉(zhuǎn)錄因子在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元發(fā)育、炎癥、記憶形成等方面具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，NR4A2基因突變與癲癇發(fā)作、神經(jīng)發(fā)育異常和機(jī)體發(fā)育異常有關(guān)［10-13］。KARKI等［14］研究表明，NR4A2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中是促癌基因，且其在心血管應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用。ASHRAF等［15］研究表明，在成年哺乳動(dòng)物心臟，特別是在心肌細(xì)胞中，在β-腎上腺素能刺激下NR4A2表達(dá)明顯上調(diào)，其特異性過表達(dá)導(dǎo)致終末分化的心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期和DNA復(fù)制增加，但不導(dǎo)致心肌細(xì)胞分裂。TREM1是髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體家族成員，屬于免疫球蛋白超家族受體，其主要功能是識(shí)別外源性抗原和毒性物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［16］。LIU等［17］研究表明，TREM1放大了腦源性和腸源性免疫原性成分的促炎反應(yīng)，在TREM1上表達(dá)的觸發(fā)受體可在多種心血管疾病中驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)。VANDESTIENNE等［18］研究表明，TREM1可參與腹主動(dòng)脈瘤的病理生理過程。KIMMOUN等［19］研究表明，TREM1與心源性休克患者90 d死亡率和各種器官損傷有關(guān)，但其在AMI中的具體分子機(jī)制尚不清楚。

4 結(jié)論

綜上所述，IL1R2、NR4A2、TREM1是AMI核心基因，三者有望成為AMI潛在的生物標(biāo)志物。但本研究仍存在一定局限性：（1）無法闡明IL1R、NR4A2、TREM1導(dǎo)致AMI的具體機(jī)制；（2）無法明確IL1R、NR4A2、TREM1是否與其他組學(xué)有關(guān)，如代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)等。

作者貢獻(xiàn)：李淑娟進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；柯妍進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；劉旭東、賀茜、徐遙琴進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；田宇佳、盧冠軍、馬娟、朱澈進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；汪樂新負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。