豬源和犬源ELF4蛋白的亞細(xì)胞定位比較研究

高翠翠，喻嬌，唐青海*，侯鑫軍，劉婷，全飛楊，劉建行，趙婷芳，趙鋮，朱鈺英，危艷武*

(1. 衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

E26轉(zhuǎn)錄因子(E26 transformation specific，ETS)家族分子是多細(xì)胞生物的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與發(fā)育和分化等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程[1]。E74 樣因子4(E74-like factor 4，ELF4)是ETS家族的重要一員，該蛋白由N端激活區(qū)域、與DNA共識序列結(jié)合的ETS區(qū)域和富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的區(qū)域組成。人ELF4(hELF4)參與細(xì)胞多種生理或病理的過程，如腫瘤發(fā)生[2]、DNA損傷修復(fù)[3]、天然免疫[4]、細(xì)胞周期調(diào)控[5]和成骨分化[6]等。研究表明，hELF4高表達(dá)可促進(jìn)人胰島素瘤細(xì)胞增殖[7]，然而在急性髓性白血病中，hELF4則是作為一個(gè)抑癌基因起作用[8]。hELF4對胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲有正向調(diào)節(jié)作用[9]，腫瘤來源的外泌體通過傳遞LINC01091調(diào)控microRNA-128-3p/ELF4/CDX2軸促進(jìn)胃癌的生長和轉(zhuǎn)移[10]。此外，hELF4在免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用。You等[11]首次發(fā)現(xiàn)hELF4是一種Ⅰ型干擾素(IFNs)轉(zhuǎn)錄因子，并通過直接調(diào)節(jié)Ⅰ型IFNs反應(yīng)來抑制病毒的復(fù)制。hELF4功能突變?nèi)笔?dǎo)致人類自身炎癥和免疫缺陷疾病[12]。腸道hELF4是維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)、減輕酒精誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性和損傷的重要宿主保護(hù)因子[13]。hELF4蛋白功能區(qū)研究比較透徹，定位在細(xì)胞核中，與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能關(guān)聯(lián)密切[14]。

A. cELF4基因截短示意圖；B. sELF4基因截短示意圖。圖中數(shù)字表示片段長度，單位為bp。

目前尚無豬E74樣因子4(sELF4)和犬E74樣因子4(cELF4)的亞細(xì)胞定位比較研究的報(bào)道。本課題組成員前期成功克隆了sELF4基因，并制備了免疫活性和特異性良好的雞抗sELF4多克隆抗體[15]，克隆cELF4基因，體外表達(dá)重組cELF4蛋白并制備了相應(yīng)的抗體[16]。為揭示sELF4和cELF4蛋白的亞細(xì)胞定位特征，闡明二者亞細(xì)胞定位的異同，本研究采用PCR截短擴(kuò)增基因片段、以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察細(xì)胞定位，研究結(jié)果將為進(jìn)一步探究sELF4 和cELF4功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態(tài)細(xì)胞Top 10購自天根生化科技(北京)有限公司；KOD FX Neo高保真酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Ligation Mix、內(nèi)切酶以及XfectTM轉(zhuǎn)染試劑均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Hoechst 33342購于Abbkine Scientific公司；DMEM和胎牛血清培養(yǎng)基購自Gibico公司；含sELF4基因全長質(zhì)粒pMD19T-sELF4、含cELF4基因全長質(zhì)粒pMD19T-cELF4 以及宮頸癌細(xì)胞HeLa由南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建或保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)本課題組前期已經(jīng)測定的cELF4基因序列(GenBank No. MZ198105)、sELF4基因序列(GenBank No. KU097322)，用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)cELF4和sELF4基因全長PCR擴(kuò)增引物和截短擴(kuò)增引物，各片段相對位置如圖1所示，引物由深圳華大基因股份有限公司合成，引物序列信息見表1和表2。

表1 cELF4引物信息

表2 sELF4引物信息

1.2.2 sELF4和cELF4基因的PCR擴(kuò)增與重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMD19T-cELF4 或pMD19T-sELF4載體為模板，利用KOD FX Neo高保真酶進(jìn)行cELF4和sELF4截短序列的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL、KOD FX Neo 1 μL、2× PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，上下游引物各1 μL，滅菌去離子水10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；69 ℃ 7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進(jìn)行雙酶切，與熒光蛋白報(bào)告載體pEGFP-C1連接、轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆采用雙酶切和序列測定進(jìn)行鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、染色與亞細(xì)胞定位的觀察

將長滿單層的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化、以適當(dāng)密度接種96 孔板內(nèi)，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h；采用XfectTM轉(zhuǎn)染試劑將重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，棄培養(yǎng)基，0.85%的生理鹽水洗滌1次，加入Hoechst 33342染液、室溫孵育15 min，棄染液、用0.85%的生理鹽水洗滌3次，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光蛋白細(xì)胞定位，綠色熒光顯示為目的蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。

1.2.4 sELF4和cELF4基因的序列比較分析

利用DNAStar 7.0 對cELF4和sELF4蛋白的氨基酸序列進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果

2.1 sELF4和cELF4基因截短片段的真核表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到cELF4基因的13個(gè)分子量分別為1 992、1 734、1 476、1 443、1 386、1 119、441、258、516、549、606、873和1 551 bp的核酸片段(圖2)；克隆至pEGFP-C1載體中構(gòu)建13個(gè)重組真核表達(dá)質(zhì)粒，雙酶切鑒定結(jié)果顯示，13個(gè)真核質(zhì)粒均為陽性(圖3)。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到sELF4基因的17個(gè)片段，分子量分別為1 989、1 731、1 473、1 440、1 404、1 383、1 116、948、438、258、516、549、585、606、873、1 041和1 551 bp(圖4)；克隆至pEGFP-C1載體中構(gòu)建17個(gè)重組真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定均為陽性(圖5)。

M. DL2000 Marker；1～13. 分別為cELF4-1-1992、cELF4-259-1992、cELF4-517-1992、cELF4-550-1992、cELF4-607-1992、cELF4-874-1992、cELF4-1552-1992、cELF4-1-258、cELF4-1-516、cELF4-1-549、cELF4-1-606、cELF4-1-873和cELF4-1-1551的PCR產(chǎn)物。

M. DL5000 Marker；1. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-1992的雙酶切產(chǎn)物；2. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-1992；3. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-259-1992的雙酶切產(chǎn)物；4. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-259-1992；5. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-517-1992的雙酶切產(chǎn)物；6. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-517-1992；7. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-550-1992的雙酶切產(chǎn)物；8. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-550-1992；9. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-607-1992的雙酶切產(chǎn)物；10. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-607-1992；11. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-874-1992的雙酶切產(chǎn)物；12. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-874-1992；13. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1552-1992的雙酶切產(chǎn)物；14. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1552-1992；15. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-258的雙酶切產(chǎn)物；16. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-258；17. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-516的雙酶切產(chǎn)物；18. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-516；19. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-549的雙酶切產(chǎn)物；20. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-549；21. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-606的雙酶切產(chǎn)物；22. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-606；23. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-873的雙酶切產(chǎn)物；24. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-873；25. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-1551的雙酶切產(chǎn)物；26. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cELF4-1-1551。

M. DL2000 Marker；1～16. 分別為sELF4-259-1989、sELF4-517-1989、sELF4-550-1989、sELF4-586-1989、sELF4-607-1989、sELF4-874-1989、sELF4-1042-1989、sELF4-1552-1989、sELF4-1-258、sELF4-1-516、sELF4-1-549、sELF4-1-585、sELF4-1-606、sELF4-1-873、sELF4-1-1041和sELF4-1-1551的PCR產(chǎn)物；17. pEGFP-C1-sELE4-1-1989質(zhì)粒。

M. DL5000 Marker；1. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-259-1989；2. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-259-1989的雙酶切產(chǎn)物；3. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-517-1989；4. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-517-1989的雙酶切產(chǎn)物；5. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-550-1989；6. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-550-1989的雙酶切產(chǎn)物；7. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-586-1989；8. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-586-1989的雙酶切產(chǎn)物；9. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-607-1989；10. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-607-1989的雙酶切產(chǎn)物；11. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-874-1989；12. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-874-1989的雙酶切產(chǎn)物；13. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1042-1989；14. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1042-1989的雙酶切產(chǎn)物；15. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1552-1989；16. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1552-1989的雙酶切產(chǎn)物；17. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-258；18. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-258的雙酶切產(chǎn)物；19. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-516；20. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-516的雙酶切產(chǎn)物；21. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-549；22. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-549的雙酶切產(chǎn)物；23. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-585；24. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-585的雙酶切產(chǎn)物；25. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-606；26. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-606的雙酶切產(chǎn)物；27. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-873；28. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-873的雙酶切產(chǎn)物；29. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-1041；30. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-1041的雙酶切產(chǎn)物；31. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-1551；32. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-1551的雙酶切產(chǎn)物；33. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-1989；34. 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-sELF4-1-1989的雙酶切產(chǎn)物。

2.2 sELF4和cELF4的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，cELF4的1～86 aa(1～258 bp)、292～663 aa(874～1 992 bp)、518～663 aa(1 552～1 992 bp)熒光分布在整個(gè)細(xì)胞；1～172 aa(1～516 bp)、1～183 aa(1～549 bp)、1～202 aa(1～606 bp)熒光分布在細(xì)胞質(zhì)中；1～291 aa(1～873 bp)、1～517 aa(1～1 551 bp)、1～663 aa(1～1 992 bp)、87～663 aa(259～1 992 bp)、173～663 aa(517～1 992 bp)、184～663 aa(550～1 992 bp)、203～663 aa(607～1 992 bp)熒光分布在細(xì)胞核中，1～291 aa(1～873 bp)、203～663 aa(607～1 992 bp)均定位在細(xì)胞核，cELF4的核定位信號肽分布在203～291 aa，292～663 aa (874～1 992 bp)定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，且熒光蛋白發(fā)生凝聚現(xiàn)象(如圖6)。

圖6 cELF4不同截短片段與EGFP融合表達(dá)的亞細(xì)胞定位觀察(標(biāo)尺=100 μm)

sELF4的1～86 aa(1～258 bp)、1～202 aa(1～606 bp)、292～662 aa(874～1 989 bp)、348～662 aa(1 042～1 989 bp)、518～662 aa(1 552～1 989 bp)熒光分布在整個(gè)細(xì)胞，1～172 aa(1～516 bp)、1～183 aa(1～549 bp)、1～195 aa(1～585 bp)熒光分布在細(xì)胞質(zhì)中，1～291 aa(1～873 bp)、1～347 aa(1～1 041 bp)、1～517 aa(1～1 551 bp)、1～662 aa(1～1 989 bp)、87～662 aa(259～1 989 bp)、173～662 aa(517～1 989 bp)、184～662 aa(550～1 989 bp)、196～662 aa(586～1 989 bp)、203～662 aa(607～1 989 bp)熒光分布在細(xì)胞核中，1～291 aa(1～873 bp)、203～662 aa(607～1 989 bp)均定位在細(xì)胞核，sELF4的核定位信號肽分布也在203～291 aa(607～873 bp)(如圖7)。

圖7 sELF4不同截短片段與EGFP融合表達(dá)的亞細(xì)胞定位觀察(標(biāo)尺=100 μm)

通過對比發(fā)現(xiàn)，sELF4的1～202 aa(1～606 bp)分布在整個(gè)細(xì)胞中，在sELF4-585-606之間還存在一段不完全的定位信號肽，在sELF4 196～291 aa(586～873 bp)之間有可能存在兩個(gè)核定位信號肽。cELF4 1～202 aa(1～606 bp)僅僅分布在細(xì)胞質(zhì)中，在cELF4 516～606 aa之間還存在一段細(xì)胞質(zhì)信號肽。 sELF4 292～662 aa和cELF4 292～663 aa在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，且部分熒光蛋白發(fā)生凝聚現(xiàn)象。

2.3 sELF4和cELF4基因序列比較分析

氨基酸序列對比分析結(jié)果顯示(圖8)，cELF4蛋白和sELF4蛋白的氨基酸序列中第169～303 aa序列完全一致，說明該區(qū)段十分保守。第 320～400 aa序列中差異位點(diǎn)相對較多，共有20個(gè)變異位點(diǎn)；cELF4在第357 aa缺失H，在第70～160 aa共有13個(gè)差異位點(diǎn)，sELF4在第116、117位缺失S和A。

紅色背景區(qū)代表氨基酸差異區(qū)域；無背景色區(qū)表示氨基酸保守區(qū)域。

3 討論

hELF4是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫中至關(guān)重要的癌基因[2]。研究表明，hELF4參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[5]，介導(dǎo)成脂成骨細(xì)胞的分化[6]，參與DNA損傷修復(fù)[3]。DNA損傷會破壞代謝穩(wěn)態(tài)并引發(fā)炎癥反應(yīng)，Shi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，hELF4的敲低增加了4細(xì)胞胚胎的DNA損傷，這表明hELF4通過控制基因組完整性進(jìn)而影響豬的早期胚胎發(fā)育。Kosti等[18]的研究結(jié)果表明hELF4是miRNA-轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤受體信號通路和脂質(zhì)動態(tài)的橋梁調(diào)節(jié)因子。衛(wèi)國紅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，hELF4能促進(jìn)胰島素瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，將其與其他類型腫瘤相比，發(fā)現(xiàn)ELF4的功能具有一定的多樣性，在不同類型腫瘤中，由于hELF4定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中而發(fā)揮功能的差異性，可能激活不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而其原因可能是在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合的關(guān)鍵蛋白因子不同。HeLa細(xì)胞是一種宮頸癌細(xì)胞，具有無限增殖潛能，且繁殖速度快、可連續(xù)傳代，被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究、細(xì)胞培養(yǎng)以及生物學(xué)試驗(yàn)等。由于其穩(wěn)定且增殖活性好、外源基因的蛋白表達(dá)量高、便于蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位觀察，常用于各類蛋白質(zhì)定位研究的模式細(xì)胞[19]。

本研究以GFP為報(bào)告基因，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，觀察目的蛋白的亞細(xì)胞定位，確定了sELF4全長蛋白和cELF4全長蛋白均定位在細(xì)胞核中，這與人ELF4蛋白定位一致。cELF4和sELF4的核定位信號分布在203～291 aa(607～873 bp)，而人ELF4包含兩個(gè)核定位信號分別位于173～183 aa和196～202 aa[14]，這說明不同種屬來源的ELF4蛋白的核定位信號肽分布有差異。一般來說，信號肽大概為16～26個(gè)氨基酸，而本研究發(fā)現(xiàn)信號肽分布在203～291 aa，推測cELF4和sELF4可能存在多個(gè)核定位信號；cELF4和sELF4的亞細(xì)胞定位存在差異，在cELF4-516-606之間還存在1段細(xì)胞質(zhì)信號肽，而sELF4-516-585之間存在1段細(xì)胞質(zhì)信號肽。此外，發(fā)現(xiàn)去除了N端核定位信號肽的sELF4 292～662 aa和cELF4 292～663 aa在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，且部分熒光蛋白發(fā)生凝聚現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象在全長蛋白的表達(dá)中并未觀察到，推測這種現(xiàn)象可能與蛋白質(zhì)翻譯后折疊、修飾或親水性發(fā)生改變有關(guān)。Hamdan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會導(dǎo)致胞質(zhì)蛋白穩(wěn)態(tài)缺陷和蛋白質(zhì)聚集體的形成。蛋白質(zhì)構(gòu)象異常或折疊錯(cuò)誤可導(dǎo)致其結(jié)合成更大的、不可溶的結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集[21]，這與應(yīng)激或衰老條件下的翻譯錯(cuò)誤、突變或缺乏寡聚組裝伴侶有關(guān)[22]。Jamar等[23]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺乏無義介導(dǎo)的mRNA降解、翻譯停滯降解和無終止降解的突變體中，mRNA監(jiān)測途徑的缺失會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集增加。喻嬌等[16]研究發(fā)現(xiàn)cELF4基因(GenBank No. MZ198105)與sELF4基因(GenBank No.KU097322)的氨基酸相似性為91.8%。本研究利用DNAStar 7.0 軟件對cELF4基因編碼的氨基酸序列與sELF4基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)二者在某特定區(qū)域(169～303 aa)保守性極高，亞細(xì)胞定位試驗(yàn)顯示cELF4和sELF4的核定位信號均分布在203～291 aa，表明來源于豬和犬的ELF4蛋白核定位信號肽高度保守。

綜上所述，本研究明確了cELF4和sELF4基因的信號肽定位序列分布特征，為后續(xù)開展基因功能研究提供了依據(jù)。