黃連厚樸復(fù)方水提物對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲病的療效試驗(yàn)

莫家豪，楊蒙，向俊，張志丹，張麗芳，張歌音，楊金琳，黎江*，司紅彬*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；2. 廣西百色隆林各族自治縣天生橋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，廣西 百色 533400)

雞球蟲病是發(fā)生在雞腸道內(nèi)一種專一性寄生蟲傳染性疾病。隨著肉雞養(yǎng)殖企業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，雞球蟲病的傳染性極速上升，導(dǎo)致每年全球禽業(yè)養(yǎng)殖損失超過140億美元[1]。柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)感染造成的危害最為嚴(yán)重?；疾∪怆u盲腸的上皮和固有層細(xì)胞受損，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，誘發(fā)潛在的致病菌感染[2]。臨床癥狀表現(xiàn)為采食量下降，飲水量上升，常出現(xiàn)鮮紅色血便。目前防治球蟲病主要是選擇用化學(xué)合成藥物，例如聚醚類離子載體抗生素(莫能菌素、鹽霉素)、三嗪苯乙腈化合物(地克珠利)和磺胺類(磺胺氯吡嗪鈉)等。但是，長(zhǎng)期使用化學(xué)合成藥物可能導(dǎo)致球蟲的耐藥性增加，以及抗生素在肉蛋中高殘留等問題的發(fā)生。盡管球蟲疫苗研究是防治球蟲病的熱點(diǎn)之一[3]，但是球蟲疫苗的安全性值得關(guān)注，如果球蟲活體疫苗的穩(wěn)定性較差，雞群很有可能暴發(fā)球蟲病。為維護(hù)我國(guó)動(dòng)物源食品安全和公共衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部決定實(shí)施藥物飼料添加劑退出計(jì)劃。該計(jì)劃強(qiáng)調(diào)不可采用以往低劑量單藥治療疾病，抗生素防球蟲的替代方案需求迫在眉睫。中草藥天然植物具有多成分、多靶點(diǎn)、多作用和不易造成耐藥性等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸受到家禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛的關(guān)注。

雞球蟲病在中獸醫(yī)辨證中屬于由濕熱及外感蟲邪所引起濕熱血痢、蟲積證[4]，因此選用具有清熱燥濕、涼血止痢、驅(qū)蟲等中草藥治療雞球蟲病。前期研究表明[5-6]，厚樸及其復(fù)方具有抗球蟲作用，能有效地控制患病雛雞排出的卵囊數(shù)量、血便以及生長(zhǎng)性能下降情況。為提升療效，根據(jù)雞球蟲病的臨床癥狀，配伍以黃連厚樸為主藥的復(fù)方，組方原則以清熱燥濕為主，涼血止痢和驅(qū)蟲為輔。黃連厚樸復(fù)方水提物(簡(jiǎn)稱：連樸水提物)是以黃連厚樸藥對(duì)為主藥，綜合常山、馬齒莧和地錦草三味中草藥的復(fù)方水提物，具有驅(qū)蟲、止血痢、祛濕行運(yùn)等功效。藥對(duì)黃連厚樸，以黃連降其熱火，以厚樸祛其濕熱，具備清熱、厚腸止痢、消脹止?jié)M等功效，針對(duì)雞球蟲病引起的久痢不止等癥狀進(jìn)行緩解；常山在機(jī)體主要的功效為消滅球蟲；馬齒莧清熱解毒、涼血止痢，配伍地錦草增強(qiáng)清熱解毒、治療血便的功效。五味藥組合發(fā)揮清熱祛濕、驅(qū)蟲止血痢等防治雞球蟲病的療效。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與蟲株

300只1日齡雄性廣西黃羽肉雞購(gòu)自廣西富鳳農(nóng)牧有限公司，柔嫩艾美耳球蟲卵囊來源和保存于廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 藥品及其制備

常山、馬齒莧、地錦草、厚樸、黃連均購(gòu)自湖南省松齡堂中藥飲片有限公司。地克珠利由天津瑞普生物科技有限公司提供。分別稱取一定重量份配比的常山、地錦草、厚樸、馬齒莧和黃連后，逐一粉碎5～10 min、過50目篩后所得的粉末混合。將其組合粉末物加入蒸餾水浸泡4 h，隨后分別加入中藥質(zhì)量10、8、6倍的蒸餾水進(jìn)行煎煮。煮沸后改為文火繼續(xù)煎煮1 h，而后過濾到藥液。將3次過濾得到的藥液合并在一起，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)、蒸發(fā)濃縮藥液，使得藥液最終濃度為2 g/mL，所得藥液即為連樸水提物。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及處理

300只1日齡廣西黃羽肉雞統(tǒng)一飼養(yǎng)至13日齡，隨機(jī)選取96只體重相近(±5g)的雛雞進(jìn)行分組，共4組，每組3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)8只?？瞻捉M，不感染球蟲+無藥物治療；攻蟲組，感染球蟲+無藥物治療；地克珠利組，感染球蟲+0.2 mL/L地克珠利，攻蟲當(dāng)天給藥，連續(xù)飲水給藥8 d(14～22日齡)；連樸水提物組，感染球蟲+4 mL/L連樸水提物，攻蟲前1 d給藥，連續(xù)飲水給藥9 d(13～22日齡)。

14日齡早上9：00除空白組外(空白組灌服相同體積生理鹽水)，經(jīng)口灌服2×104子孢子化卵囊至嗉囊。自感染球蟲后，每日檢測(cè)雞精神狀態(tài)、死亡情況、臨床癥狀。在攻蟲后的第5～7天，觀察糞便并記錄血便評(píng)分。在攻蟲后第6～8天收集糞便，統(tǒng)計(jì)每克糞便中卵囊數(shù)(OPG)。攻毒后第7天，記錄雛雞體重(末重)。在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)挑選雛雞頸椎脫臼處死，頸靜脈收集約6～7 mL新鮮雛雞的血液。血液4 ℃保存1～2 h，隨后3 500 r/min、5 min、4 ℃離心收集血清。血清保存-20 ℃冰箱，以便后續(xù)使用。

1.2.2 抗球蟲指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 相對(duì)增重率

相對(duì)增重率=(感染用藥組的平均增重/不感染不用藥組的平均增重)×100%。

1.2.2.2 存活率

存活率=(每組雞總數(shù)-死亡數(shù))/每組雞總數(shù)×100%。

1.2.2.3 血便評(píng)分

血便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]：100%糞便不帶血記0分；1%～25%糞便帶血記1分；26%～50%糞便帶血記2分；51%～75%糞便帶血記3分；76%～100%糞便帶血記4分。

1.2.2.4 盲腸病變?cè)u(píng)分

依據(jù)Johnson和Reid[8]的標(biāo)準(zhǔn)，剖檢后根據(jù)盲腸病變的嚴(yán)重程度進(jìn)行記分。無肉眼病變記0分；盲腸璧有很少散在出血點(diǎn)，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常記1分；病變數(shù)較多，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，盲腸壁較厚，內(nèi)容物正常記2分；腸壁出血的數(shù)量較多，內(nèi)容物明顯帶血，盲腸璧稍增厚記3分；盲腸中充滿大量的血液和腸芯，盲腸腫大，腸芯中含有糞渣或不含糞渣記4分。盲腸病變值=盲腸病變?cè)u(píng)分×10。

1.2.2.5 卵囊值評(píng)分[9]

在感染后第6.5、7、7.5、8天，統(tǒng)計(jì)雛雞中OPG。統(tǒng)計(jì)的方法如下：稱取1 g糞便放入玻璃燒杯中，加入10 mL的蒸餾水均勻攪拌，隨后吸取適量的溶液滴到血球計(jì)數(shù)板上，統(tǒng)計(jì)血球計(jì)算板里面的4個(gè)大方格中球蟲卵囊的數(shù)量。

計(jì)算公式為：OPG=4個(gè)計(jì)數(shù)室的平均值×105。如果顯微鏡下觀察到的卵囊數(shù)目非常多，可以選擇100或者1 000倍稀釋卵囊溶液。

卵囊比=(感染用藥組的卵囊數(shù)/不感染不用藥組的卵囊數(shù))×100%。卵囊值評(píng)分：卵囊比0～1%記0分；1%～25%記5分；26%～50%記10分；51%～75%記20分；76%～100%記40分。

1.2.2.6 抗球蟲指數(shù)(ACI)

計(jì)算公式[10]：ACI=(相對(duì)增重率+存活率)-(盲腸病變值+卵囊值)。ACI在120以下為無效，120～160為差，160～180為良好，180以上為優(yōu)。

1.2.3 雞外周血清細(xì)胞因子測(cè)定

使用南京博研生物科技有限公司試劑盒測(cè)定雛雞外周血清中的白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平。

1.2.4 雞外周血清抗氧化指標(biāo)水平測(cè)定

使用南京博研生物科技有限公司試劑盒測(cè)定雛雞外周血清中的總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的水平。

1.2.5 盲腸病理組織學(xué)分析

1.2.5.1 盲腸的采集以及固定

感染7 d后雛雞斷頸處死，取出雞的腸道組織，小心分離盲腸。手術(shù)鑷子固定盲腸近段，利用手術(shù)剪刀分離出2～3 cm的盲腸小段。將盲腸小段放入4%甲醛溶液中，每12 h更換一次甲醛溶液，直至溶液澄清。

1.2.5.2 盲腸組織切片的制作

盲腸按照包埋盒尺寸修整后，放入包埋盒并且標(biāo)記。將包埋盒放至大燒杯中，流水沖洗約24 h。隨后脫水浸泡、浸蠟、包埋、蠟塊的切片和展片、脫蠟以及HE染色。最后將組織切片進(jìn)行封片與鏡檢。在光學(xué)顯微鏡上觀察組織結(jié)構(gòu)是否完整，細(xì)胞形態(tài)是否正常。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。雞體重、盲腸病變?cè)u(píng)分和OPG結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示。體重、血便評(píng)分、盲腸病變?cè)u(píng)分、OPG、血清細(xì)胞因子以及抗氧化指標(biāo)采用單因素方差分析，鄧肯分析進(jìn)行比較，P<0.05為差異顯著。采用Prism 9軟件進(jìn)行圖型分析。

2 結(jié)果

2.1 相對(duì)增重比較

雛雞感染球蟲后臨床出現(xiàn)便血、采食量減少和生產(chǎn)性能下降等情況，表現(xiàn)為雛雞增重減緩，嚴(yán)重感染情況下甚至出現(xiàn)負(fù)增重。如表1所示，攻蟲組的雛雞相對(duì)增重率減少至55.67%。在使用連樸水提物后，相對(duì)增重率到達(dá)94.48%。

表1 各組體重信息

2.2 各組感染球蟲后的存活情況

如表2所示，感染球蟲后，空白組、地克珠利組和連樸水提物組的雛雞沒有死亡。攻蟲組在第5和第6天分別死亡2只和1只。

表2 各組感染后存活情況

2.3 血便評(píng)分

血便是雞球蟲病的主要臨床診斷特征。如表3所示，感染球蟲后的第5～7天，血便嚴(yán)重。與攻蟲組相比，連樸水提物組各階段的血便都顯著(P<0.05)下降。

表3 血便評(píng)分

表4 盲腸病變?cè)u(píng)分

2.4 盲腸病變?cè)u(píng)分

雛雞感染球蟲后，臨床癥狀表現(xiàn)為痢疾，排鮮紅色糊狀糞便。死亡雞解剖發(fā)現(xiàn)，雛雞皮膚干燥缺水，盲腸腫脹，腸壁不同程度出血點(diǎn)，盲腸無內(nèi)容物，或腸壁細(xì)胞脫落形成腸芯或混合物形成血凝塊。攻蟲組雛雞發(fā)現(xiàn)盲腸出現(xiàn)不同程度的出血點(diǎn)、盲腸芯或血凝塊。連樸水提物組盲腸病變相比攻蟲組顯著下降(P<0.05)，表現(xiàn)為該組雛雞盲腸壁出血點(diǎn)減少，少量雞出現(xiàn)盲腸壁變厚現(xiàn)象，說明該組方能有效減少球蟲感染導(dǎo)致的盲腸病變，保護(hù)了腸道的健康。如表 4所示，攻蟲組和連樸水提物的盲腸評(píng)分別為28.50和15.00。

2.5 卵囊值評(píng)分

雞球蟲的生活史最后階段是排出卵囊，污染雞舍環(huán)境，傳播疾病。表5所示。與攻蟲組相比，連樸水提物組排出卵囊數(shù)量顯著性下降(P<0.05)，表明連樸水提物可以減少雞感染球蟲疾病期間卵囊的數(shù)量，降低卵囊進(jìn)一步感染其他雛雞的風(fēng)險(xiǎn)。攻蟲組和連樸水提物組的卵囊值分別為40和10。

表5 卵囊值

2.6 抗球蟲指數(shù)

如表6所示，連樸水提物抗球蟲指數(shù)為169.48，達(dá)到良好的抗球蟲水平。

表6 抗球蟲指數(shù)

2.7 外周血清中細(xì)胞因子

雛雞在感染球蟲后，會(huì)導(dǎo)致外周血清中的促炎癥因子升高，進(jìn)一步加劇腸炎的發(fā)生。如圖1所示，與空白組相比，促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)在攻蟲組中顯著上調(diào)(P<0.05)。在使用藥物治療后，與攻蟲組相比，地克珠利組和連樸水提物組顯著下調(diào)了促炎因子在外周血清的含量(P<0.05)。與空白組相比，攻蟲組的抑炎因子IL-10顯著上調(diào)(P<0.05)，提示炎癥的發(fā)生。在使用連樸水提物后，與攻蟲組相比，雛雞的IL-10在血清中的含量顯著上升(P<0.05)，從而提升抑制炎癥的效果。

2.8 抗氧化指標(biāo)

如圖2所示，與空白組相比，攻蟲組的外周血清中抗氧化酶(T-AOC和SOD)顯著下調(diào)(P<0.05)。與攻蟲組相比，連樸水提物組的T-AOC和SOD水平顯著上調(diào)。與空白組相比，攻蟲組感染球蟲后MDA和NO含量顯著上調(diào)(P<0.05)。與攻蟲組相比，連樸水提物組的MDA和NO顯著性下降(P<0.05)。這些結(jié)果提示連樸水提物有效的減少雛雞因球蟲感染造成的氧化應(yīng)激。

圖2 各組抗氧化相關(guān)指標(biāo)的變化

2.9 盲腸病理組織學(xué)分析

通過光學(xué)顯微鏡觀察(圖3)感染后第7天盲腸的形態(tài)變化情況。空白組緣狀紋完整沒有斷裂，腸上皮完整，固有層的細(xì)胞完整，腸腺豐富規(guī)律。攻蟲組中，盲腸緣狀紋模糊不清、脫落至腸腔，內(nèi)容物中存在大量即將排出體外的卵囊；盲腸腺體被密集的卵囊占據(jù)，腸腺完全消失，固有細(xì)胞排列疏松，組織間伴隨大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。地克珠利組中，緣狀紋無明顯斷裂較為完整；腸腺與攻蟲組相比數(shù)量較為豐富、排列較為緊密；組之間有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。連樸水提物組中，可見緣狀紋存在部分?jǐn)嗔衙撀?，腸腺較為豐富，但形態(tài)較小；組織間有不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

箭頭指向的是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，圓圈內(nèi)的是球蟲卵囊。

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲感染會(huì)刺激CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖，而后分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子引發(fā)炎癥反應(yīng)[11]。有研究證明，柔嫩艾美耳球蟲感染雞體內(nèi)后，可以被雞特定受體ChTLR15特異性識(shí)別，進(jìn)而激活 ChTLR15/NLRP3炎癥信號(hào)通路，引起通路中關(guān)鍵因子ChTLR15、MyD88、NF-κB、NLRP3的mRNA表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步上調(diào)炎癥因子IL-1β等細(xì)胞因子水平，加劇炎癥反應(yīng)發(fā)生[12]。細(xì)胞在正常的生理活動(dòng)情況下會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，而低水平的ROS可以正向調(diào)節(jié)機(jī)體的生理活動(dòng)過程[13]。感染球蟲的雛雞，腸黏膜細(xì)胞會(huì)遭受破壞而后死亡。在這個(gè)過程中，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量ROS，其中包括NO，用于清除病原體。但是累計(jì)的大量NO會(huì)表達(dá)細(xì)胞毒性，進(jìn)而加劇腸道的內(nèi)環(huán)境惡化，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致氧化和抗氧化失去平衡。柔嫩艾美耳球蟲會(huì)抑制腸道內(nèi)的抗氧化功能[14]，致使過氧化產(chǎn)物MDA水平的升高，抗氧化酶T-AOC、CAT、SOD的含量下降，同時(shí)也會(huì)繼發(fā)感染細(xì)菌疾病引發(fā)壞死性腸炎的發(fā)生，使得腸道的健康進(jìn)一步破壞[15]。本研究中，攻蟲組血清的抗氧化指標(biāo)和炎癥指標(biāo)也有相同的趨勢(shì)，即炎癥因子和氧化因子顯著上調(diào)。使用連樸水提物后可以下調(diào)部分的炎癥因子和氧化因子，改善腸道的炎癥反應(yīng)。從切片可以發(fā)現(xiàn)，雛雞在感染柔嫩艾美耳球蟲7 d后，盲腸的上皮和腺體被大量的蟲卵寄生；子孢子入侵腸黏膜上皮細(xì)胞和腸腺細(xì)胞，逐步形成裂殖體；裂殖體破裂釋放更多的子孢子，導(dǎo)致腸道黏膜遭受破壞并脫落，這會(huì)引起毛細(xì)血管出血，脫落細(xì)胞與血液混合物形成的“盲腸芯”，阻礙盲腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)一步導(dǎo)致雛雞疾病惡化。使用連樸水提物治療后，相比于攻蟲組，連樸水提物組的腸上皮絨毛和腸腺更完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。這些結(jié)果綜合表明，連樸水提物可以保護(hù)腸道細(xì)胞的完整性，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的發(fā)生，從而達(dá)到治療雞球蟲病的效果。

綜上所述，本研究使用純天然的植物中草藥治療球蟲病，結(jié)果表明連樸水提物的抗球蟲指數(shù)為169.48，達(dá)到良好抗球蟲效果，能有效地減少柔嫩艾美耳球蟲感染造成的盲腸病理?yè)p傷、卵囊的排出數(shù)量以及血便的數(shù)量，恢復(fù)其生長(zhǎng)性能；連樸水提物可以降低促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量，提升抑炎因子(IL-10)的含量，從而達(dá)到降低炎癥的發(fā)生；連樸水提物可以提高雛雞感染期間抗氧化酶(T-AOC和SOD)的含量，減少脂質(zhì)過氧化物MDA以及NO的含量，達(dá)到抗氧化應(yīng)激的效果。因此，連樸水提物可能通過下調(diào)炎癥因子和過氧化物水平，上調(diào)抑炎因子和抗氧化酶的水平，達(dá)到減緩炎癥、氧化應(yīng)激對(duì)雛雞在患球蟲病期間的影響。這種作用可以減少血便、卵囊排出和盲腸損傷，從而保護(hù)了腸道健康，提升雛雞的生長(zhǎng)性能。因此，連樸水提物有望成為抗生素以及化學(xué)合成藥物的替代藥物。