一株羊源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及耐藥分析

蔣昀軒，楊 亞，魏 凱*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省泰安市寧陽(yáng)縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東 寧陽(yáng)）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一種可以引起人和多種動(dòng)物患病的條件性致病菌。該菌主要導(dǎo)致人和多種動(dòng)物的肺炎、呼吸道感染、腸炎、腹膜炎、腦膜炎、腹瀉，甚至敗血癥等癥狀[1]。目前，國(guó)內(nèi)外已從多種家畜、家禽、野生動(dòng)物、水生動(dòng)物體內(nèi)分離到該菌[2]。近年來(lái)，關(guān)于肺炎克雷伯氏菌致病的報(bào)道越來(lái)越多，其已經(jīng)成為除大腸桿菌、沙門(mén)氏菌之外常見(jiàn)的條件致病菌[3]。由于抗生素的濫用導(dǎo)致該菌耐藥性不斷增強(qiáng)，全國(guó)各地出現(xiàn)了高耐藥性菌株，大大增加了該菌所致疾病的發(fā)生率和死亡率，給臨床治療帶來(lái)嚴(yán)重困難，也給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。2022年7月，山東萊蕪某養(yǎng)羊場(chǎng)出現(xiàn)黑山羊乳羔羊死亡情況，患病羊發(fā)病急促，眼珠泛紅，被毛凌亂，呼吸困難，原地打轉(zhuǎn)且伴有一定的神經(jīng)癥狀，兩天后精神沉郁，食欲減退，高燒不退，精神萎靡，隨后便倒地死亡。對(duì)死亡羔羊進(jìn)行剖解檢查，可見(jiàn)皮下水腫，肺臟內(nèi)部出現(xiàn)淤血，表面有大的出血點(diǎn)與出血斑，肝臟腫大，大網(wǎng)膜充血出血，腸系膜淋巴結(jié)出血，并且表現(xiàn)一定程度的敗血癥癥狀。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)細(xì)菌的分離純化、生化試驗(yàn)、藥敏實(shí)驗(yàn)等方法，對(duì)萊蕪黑山羊的肺臟、肝臟等組織器官進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，分離到一株羊源肺炎克雷伯氏菌，旨在為臨床上肺炎克雷伯氏菌的防治與耐藥性的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 從山東濟(jì)南萊蕪區(qū)某養(yǎng)羊場(chǎng)收集到萊蕪黑山羊尸體，采用無(wú)菌操作解剖并采集了2 只病羊的肝臟與肺臟病料。

1.1.2 主要試劑及試驗(yàn)動(dòng)物 瓊脂糖粉、核酸染料均購(gòu)自TaKaRa 公司；LB 培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、新鮮綿羊血培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博試劑有限公司；藥敏片由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌DNA 提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；SPF 級(jí)昆明小鼠購(gòu)自山東鵬悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 分離株的分離培養(yǎng) 用酒精燈消毒過(guò)的剪刀燒烙肝臟和肺臟表面，并剪取肝臟和肺臟內(nèi)部的組織0.5 g 于10 mL 離心管中，然后將病料組織剪碎，加入3～4 顆滅菌后的鋼珠以及5 mL 生理鹽水，使用全自動(dòng)組織研磨機(jī)研磨5 min。在超凈臺(tái)中用接種環(huán)蘸取病料研磨液在麥康凱培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、新鮮綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，并做好標(biāo)記，放入37 ℃溫箱過(guò)夜培育，24 h 后觀察菌落形態(tài)特征，挑取典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 革蘭氏染色 使用革蘭氏染色試劑盒將分離純化到的菌液進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌的形態(tài)特征和染色特征。

1.2.3 分離株的細(xì)菌質(zhì)譜儀鑒定 用滅菌的槍頭輕輕蘸取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的單菌落均勻涂布于MSP 96 target polished steel BC 上，然后滴加濃度為 70%的甲酸1 μL，晾干后再加入基質(zhì)溶液1 μL，使用布魯克全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)儀鑒定。

1.2.4 分離株的PCR 檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)羊源肺炎克雷伯氏菌特異性鑒定引物：KpYF5'-GCGG TCTGTCAAGTCGGATGTG-3' KpYR5'-CATCGT TTACGGCGTGGACTACC-3'，交由北京擎科生物有限公司合成。

將純化后培養(yǎng)的細(xì)菌肉湯取5 mL，使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌DNA 作為模板，加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1）。按照反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性94 ℃ 6 min；變性 95 ℃ 30 s；退火 55 ℃ 30 s；延伸 72 ℃1 min；35 個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶大小。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，送到青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，比較其同源性。

1.2.5 分離株的生化試驗(yàn) 將分離到的菌液肉湯按照說(shuō)明書(shū)要求，加入到各種類(lèi)型的生化反應(yīng)管中，37 ℃ 培養(yǎng)24～48 h 后觀察細(xì)菌生化反應(yīng)特性。所有試驗(yàn)操作過(guò)程均在超凈臺(tái)中進(jìn)行，避免實(shí)驗(yàn)室污染對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

1.2.6 小鼠的致病性試驗(yàn) 通過(guò)倍比稀釋的方法測(cè)的菌液濃度為2x109CFU，根據(jù)菌液濃度，同時(shí)設(shè)立感染組15 只和空白對(duì)照組15 只。將菌液肉湯給小鼠進(jìn)行腹腔注射（200 μL/只）。空白組每只注射200 μL 生理鹽水。在小鼠死亡后采集小鼠心血加入LB 肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.7 分離株的藥敏試驗(yàn) 通過(guò)倍比稀釋涂板，24 h 后測(cè)量菌液CFU，然后將分離純化的細(xì)菌接種于普通LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。根據(jù)測(cè)量的菌落CFU 單位對(duì)菌液進(jìn)行定量后涂板，稍干后共選取20 種藥敏片分別平鋪在培養(yǎng)基表面，37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)，用直尺測(cè)量培養(yǎng)基上抑菌圈直徑大小。分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法進(jìn)行，以抑菌圈直徑（mm）表示該藥對(duì)特定細(xì)菌的敏感程度，分別用敏感（S）、中度敏感（I）、耐藥（R）表示。

2 結(jié)果

2.1 分離株細(xì)菌形態(tài)學(xué)上的觀察

利用細(xì)菌分離的方法，從本次的病料中獲得一株疑似肺炎克雷伯氏菌分離株，分別在LB 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、新鮮綿羊血培養(yǎng)基進(jìn)行劃線培養(yǎng)，24 h 觀察到在LB 培養(yǎng)基上形成灰白色、邊緣整齊、圓形突起、濕潤(rùn)且粘稠的菌落，使用接種環(huán)可以輕易拉成絲（圖1 A）；在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)大片粉紅色菌落（圖1 B）；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成灰白色、邊緣整齊、圓形突起、濕潤(rùn)且粘稠的菌落（圖1 C）；在新鮮綿羊血培養(yǎng)基上形成白的粘稠狀菌落，且不溶血（圖1 D）。

2.2 革蘭氏染色鏡檢

將分離株進(jìn)行革蘭氏染色，使用油鏡觀察后發(fā)現(xiàn)視野中分離菌株為紅色，呈短桿狀形態(tài)，表明其為革蘭氏陰性菌（圖2）。

圖2 分離菌株革蘭氏染色結(jié)果（100x）

2.3 分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果

分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，賴(lài)氨酸脫羧酶、尿素酶、甘露醇、枸櫞酸鹽、VP 試驗(yàn)、核糖醇、棉子糖、山梨醇、蜜二糖、試驗(yàn)均為陽(yáng)性；吲哚、硫化氫、蛋白胨水、甲基紅試驗(yàn)、苯丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)為陰性（表2）。分離株的生化特性結(jié)果同《臨床常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的肺炎克雷伯氏菌的生化特性相符合。根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果，初步判定分離菌為肺炎克雷伯氏菌。

圖3 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)

表2 分離株生化試驗(yàn)結(jié)果圖

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)

感染組小鼠腹腔注射菌液后，在24 h 內(nèi)陸續(xù)死亡，死亡前被毛凌亂、呼吸加重、精神萎靡、食欲不振，還有部分全身顫抖、眼睛緊閉。剖解死亡的感染組小鼠，發(fā)現(xiàn)其腹腔出現(xiàn)大量粘連液體，成膠凍狀，肝臟、肺臟出現(xiàn)大量出血點(diǎn)、壞死，脾臟腫大。取其心血，肺臟、肝臟研磨液，使用LB 肉湯繼續(xù)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，通過(guò)革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示，該分離株與病羊肺臟、肝臟組織中分離到的細(xì)菌相同，且對(duì)照組無(wú)異常反應(yīng)。

2.5 PCR 檢測(cè)結(jié)果

使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌DNA 作為模板，進(jìn)行特異性PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖核酸電泳，結(jié)果如圖3 所示，目的條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致。瓊脂糖凝膠經(jīng)回收后送到青島擎科生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 分析比對(duì)，該菌株部分基因序列與肺炎克雷伯氏菌同源性達(dá)99%，確定該菌為羊源肺炎克雷伯氏菌。

圖3 PCR 鑒定結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗(yàn)說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明，判斷各種藥物的抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)羊源的分離菌KpY1、KpY2對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)等大多數(shù)藥物均為敏感，對(duì)磺胺間甲氧和阿莫西林表現(xiàn)耐藥（表3）。

3 討論與結(jié)論

目前，肺炎克雷伯氏菌已經(jīng)與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌一樣，對(duì)人類(lèi)健康以及畜牧業(yè)構(gòu)成威脅的常見(jiàn)的細(xì)菌病原體之一[5]。在我國(guó)的畜牧生產(chǎn)中，養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)逐漸形成了一種完整的產(chǎn)業(yè)鏈，對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著十分重要的作用，嚴(yán)格控制養(yǎng)羊場(chǎng)各種疫病的發(fā)生以及病原的感染與傳播對(duì)養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要[6]。羊源肺炎克雷伯氏菌作為一種危害性強(qiáng)的條件致病菌，當(dāng)符合發(fā)病條件時(shí)，會(huì)對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體和健康造成嚴(yán)重的影響。羊源肺炎克雷伯氏菌感染后主要引起呼吸困難、肺炎、腦膜炎、全身敗血癥以及一定的神經(jīng)癥狀，最終使病羊因呼吸系統(tǒng)衰竭而死亡[7]。因此，對(duì)于羊源肺炎克雷伯氏菌需要建立有效的預(yù)防措施，為養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展起到有效的保護(hù)作用。肺炎克雷伯氏菌作為在臨床上僅次于大腸桿菌與沙門(mén)氏菌的條件致病菌，與預(yù)防和治療有著密不可分的聯(lián)系，抗生素的濫用導(dǎo)致了多重耐藥性菌株的出現(xiàn)。本次試驗(yàn)分離到肺炎克雷伯氏菌致病性強(qiáng)，耐藥性弱，對(duì)多種藥物敏感，為臨床藥物的研究提供了支持與依據(jù)[8]。同時(shí)本次病料檢測(cè)時(shí)還發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌的存在，表明肺炎克雷伯氏菌易與其他細(xì)菌混合感染，造成治療難度增加，提示相關(guān)從業(yè)人員與政府部分應(yīng)提高警惕，做好對(duì)混合發(fā)病感染的預(yù)防和研究，一旦暴發(fā)疾病，迅速根據(jù)其發(fā)病規(guī)律，制定科學(xué)合理的治療手段。

本研究是將由羊肺臟、肝臟中分離到的菌株通過(guò)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察、動(dòng)物致病性試驗(yàn)、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)等方法，從多個(gè)方面鑒定并確定了分離菌株為有較高致病性的肺炎克雷伯氏菌。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果顯示，羊源的肺炎克雷伯氏菌對(duì)大多數(shù)抗生素類(lèi)藥物敏感，只對(duì)阿莫西林和磺胺間甲氧表現(xiàn)為耐藥，表明目前從萊蕪黑山羊病料中分離到的肺炎克雷伯氏菌的耐藥性不強(qiáng)，沒(méi)有出現(xiàn)多重耐藥性，說(shuō)明還具有一定的預(yù)防價(jià)值，并且對(duì)于下一步檢測(cè)方法的研究具有重大意義，早發(fā)現(xiàn)早治療，能夠起到預(yù)防肺炎克雷伯氏菌多重耐藥性發(fā)生的作用。同時(shí)本試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)以及相關(guān)耐藥性分析的結(jié)果為動(dòng)物源肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)方法的建立提供了數(shù)據(jù)支持。