改良QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留

彭 婕，穆迎春，喻亞麗，陳建武，劉 婷，何 力,3,*，甘金華,3,*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（武漢），湖北 武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141）

撲草凈是一種選擇內(nèi)吸傳導(dǎo)型均三氮苯類除草劑，在中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛[1]，它具有類似苯環(huán)的結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，是一種持久性有機(jī)污染物[2]。20世紀(jì)70年代，撲草凈開始被用于池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖中清除雜草和青苔[3]，后續(xù)又用于去除蝦類、海參、貝類等養(yǎng)殖中的大型藻類[4]。種植業(yè)和漁業(yè)使用的撲草凈大部分隨著地表徑流和雨水沖刷等途徑進(jìn)入水體環(huán)境[5]，它在水中有較高的溶解度，難以降解，經(jīng)過自然界的水循環(huán)作用被帶入江河湖海，從而導(dǎo)致國內(nèi)外不同水域中均能檢測到撲草凈殘留[6-10]。撲草凈通過水體環(huán)境在生物體內(nèi)富集，沿食物鏈傳遞，危害人類健康[11]，它會(huì)引起生物機(jī)體的內(nèi)分泌紊亂、腫瘤產(chǎn)生等不良危害[12-13]，因此，美國和歐盟等已將其列入內(nèi)分泌干擾物名單[14]，中國也于2010年在中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1435號中將其列入《獸藥試行標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》[15]。近年來我國水產(chǎn)品中多次檢出撲草凈殘留[16-17]，甚至突發(fā)使用撲草凈清除蝦池中的青苔，導(dǎo)致克氏原螯蝦全部死亡的事故，2021年撲草凈被正式納入“國家產(chǎn)地水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃”主要檢測指標(biāo)，可見水產(chǎn)品中撲草凈殘留問題已引起廣泛的關(guān)注和重視。撲草凈在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)降解代謝轉(zhuǎn)化途徑產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)多樣的代謝中間產(chǎn)物[18]，其中主要包含通過N-脫烷基化反應(yīng)形成的化合物去異丙基撲草凈（desisopropyl prometryn，DIP）和雙去異丙基撲草凈（dideisopropyl prometryn，DDIP），硫氧化形成的化合物撲草凈亞砜，以及羥基取代甲硫基形成的化合物2-羥基-撲滅津等[19]。目前諸多研究都只針對水產(chǎn)品中撲草凈殘留分析，缺乏有效的水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝產(chǎn)物殘留測定方法，無法準(zhǔn)確評估水產(chǎn)品中撲草凈殘留風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要開發(fā)水產(chǎn)品中撲草凈及其主要代謝產(chǎn)物DIP、DDIP、撲草凈亞砜和2-羥基-撲滅津快速準(zhǔn)確的分析方法，進(jìn)一步提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測水平。

由于水產(chǎn)品基質(zhì)具有組分復(fù)雜、干擾物質(zhì)多以及目標(biāo)物含量低等特點(diǎn)，因此，準(zhǔn)確評估水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物的殘留水平需要優(yōu)良的前處理方法和精準(zhǔn)的分析技術(shù)。目前報(bào)道的撲草凈殘留測定方法主要有氣相色譜法[1]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-21]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[22]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23-24]。對比4 類分析方法，氣相色譜法靈敏度不高，準(zhǔn)確定性能力較弱；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在精準(zhǔn)定性能力方面有所提升，但檢測靈敏度仍不具備顯著優(yōu)勢；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于其靈敏度高、選擇性好，成為分析復(fù)雜基質(zhì)中撲草凈殘留的首選方法。當(dāng)前，水產(chǎn)品中撲草凈殘留分析多采用固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）凈化[25-27]，此類方法往往需先活化SPE柱，再上樣、淋洗、洗脫，不僅過程耗時(shí)，還需消耗大量溶劑，既不經(jīng)濟(jì)也不環(huán)保。近年來，QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）作為一種快速、簡單、廉價(jià)、高效、安全的前處理技術(shù)，在動(dòng)物性食品農(nóng)獸藥殘留檢測中應(yīng)用較為廣泛[28-30]。

本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，采用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除吸附劑（enhanced matrix removal of lipids，EMR-Lipid）與Cleanert LipoNo混合物作為凈化吸附劑，基于改良的QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、同位素內(nèi)標(biāo)定量，建立了一種同時(shí)測定水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留的分析方法。該方法操作簡便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，以期為水產(chǎn)品中新型持久性有機(jī)污染物殘留來源和質(zhì)量安全評價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹樣品來源于本地農(nóng)貿(mào)市場。

撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 號7287-19-6、分子式C10H19N5S，純度≥99%）、DDIP標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號5397-01-3、分子式C4H7N5S，純度為99.7%）、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號7374-53-0、分子式C9H17N5O，純度為99.9%）天津阿爾塔科技有限公司；DIP標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號4147-57-3、分子式C7H13N5S，純度≥99%）美國TLC公司；撲草凈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號55702-48-2、分子式C10H19N5OS，純度≥99%）美國Panphy公司；撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號1705649-52-0、分子式C10H13D6N5S，純度≥98%）美國Dr.Ehrenstorfer公司；撲草凈原藥（純度＞97%）浙江中山化工集團(tuán)有限公司。

乙腈、乙酸乙酯（均為色譜純）美國J.T.Baker公司；甲醇、乙腈（均為質(zhì)譜級）德國Meker公司；甲酸（質(zhì)譜級）美國Fisher公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純）上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EMR-Lipid 安捷倫科技（中國）有限公司；Cleanert LipoNo 天津博納艾杰爾科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀、TSQ Quantiva 三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI））美國Thermo Fisher Scientific公司；VORTEX 2渦旋混勻儀 德國IKA公司；R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；Avanti JXN-26高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)品各5.00 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量甲醇充分溶解后，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量甲醇充分溶解后，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈及其代謝混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）：分別準(zhǔn)確移取1 mL撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：移取5 mL撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/mL）：移取1 mL撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用20%乙腈-甲酸溶液配制系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均含有撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津混合外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6。每份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為20 ng/mL，外標(biāo)系列質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10、50、200、500 ng/mL。

1.3.3 前處理方法

1.3.3.1 樣品制備

草魚去鱗，帶皮沿背脊取肌肉部分；克氏原螯蝦去頭、殼、腸腺，取肌肉部分；試樣切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm小塊后均質(zhì)、混勻。中華絨螯蟹去殼、鰓后，將所有可食部分全部取出并絞碎混勻。所有待測樣品密封標(biāo)記后置于-20 ℃冷凍保存，備用。

1.3.3.2 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.01 g）均質(zhì)的肉糜樣品，置于50 mL離心管中，加入200 μL撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/mL），混勻后靜置10 min，加入10 mL乙腈和3 顆玻璃珠均質(zhì)子渦旋混勻30 s，隨后依次加入2 g氯化鈉和1 g無水硫酸鎂，渦旋混合2 min后超聲提取5 min，5000 r/min離心5 min，取上清液至雞心瓶中，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取1 次，合并提取液，40 ℃減壓蒸干。

向雞心瓶中加入2 mL 20%甲醇溶液，渦旋混合至瓶內(nèi)殘留物全部溶解，將上述復(fù)溶液置于10 mL離心管中，加入0.20 g EMR-Lipid與0.05 g Cleanert LipoNo混合凈化劑，渦旋振蕩1 min，10000 r/min冷凍離心10 min，取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm聚砜醚濾膜過濾后，待測。

1.3.4 液相色譜條件

Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫條件：0～1.0 min，20% A、80% B；1.0～6.0 min，20%～80% A、80%～20% B；6.0～8.0 min，80% A、20% B；8.0～8.1 min，80%～20% A、20%～80% B；8.1～10.0 min，20% A、80% B。

1.3.5 質(zhì)譜條件

加熱大氣壓ESI；正離子模式掃描；掃描模式為選擇反應(yīng)監(jiān)測模式；噴霧電壓為3500 V；蒸發(fā)溫度為350 ℃；離子傳輸毛細(xì)管溫度為330 ℃；鞘氣和輔助氣均為氮?dú)猓魉俜謩e為40 L/min和10 L/min；碰撞氣（氬氣，純度≥99.999%）；碰撞氣壓力2.0 mTorr。撲草凈及其代謝物的質(zhì)譜檢測參數(shù)如表1所示。

表1 撲草凈及其代謝物質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for prometryn and its metabolites

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）評估

水產(chǎn)品中含量較高的蛋白質(zhì)、磷脂等內(nèi)源性物質(zhì)會(huì)因與待測物離子競爭液-液表面，從而產(chǎn)生基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，有關(guān)研究表明基質(zhì)種類、基質(zhì)質(zhì)量和待測物質(zhì)量濃度對ME均有一定影響[31]，因此為評估建立方法的準(zhǔn)確度，應(yīng)考慮ME對檢測結(jié)果的影響，本研究采用提取凈化后添加標(biāo)樣法，按照下式計(jì)算ME：

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取均質(zhì)的陰性草魚、克氏原螯蝦和中華絨螯蟹肌肉組織樣品，不加內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6，其余步驟按照1.3.3.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理，制備得到不同水產(chǎn)品空白基質(zhì)溶液。用不同水產(chǎn)品空白基質(zhì)溶液配制系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6質(zhì)量濃度為20 ng/mL，撲草凈及其代謝物混合外標(biāo)質(zhì)量濃度依次為1.0、5.0、10、50、200、500 ng/mL，以此建立基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留測定

選取體質(zhì)量為（26.94±6.78）g的鮮活克氏原螯蝦，按9.6 μg/mL的質(zhì)量濃度藥浴撲草凈溶液，藥浴36 h后換干凈爆氣水繼續(xù)暫養(yǎng)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)箱每只克氏原螯蝦用隔板隔開。給藥后在0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、48、72、96、120、144 h和168 h采集克氏原螯蝦肌肉組織?？耸显r肌肉組織均質(zhì)后于-18 ℃冷凍保存，待分析。分析前將克氏原螯蝦肌肉樣品解凍，前處理步驟及儀器分析方法同1.3.3～1.3.5節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Trace Finder 3.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）對樣品中的撲草凈及其代謝物進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)采集和處理，采用Origin 2023進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

撲草凈及其代謝物均為含氨基的三嗪類化合物，質(zhì)譜分析時(shí)宜選擇ESI正離子模式測定，在流動(dòng)相中加入一定量的甲酸，不僅能夠提高目標(biāo)物的離子化效率，還能改善色譜峰峰形，提高色譜峰的分離度。取質(zhì)量濃度為1 μg/mL的撲草凈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蠕動(dòng)泵將其隨流動(dòng)相一同注入質(zhì)譜儀中，在ESI+模式下進(jìn)行母離子全掃描，手動(dòng)調(diào)試質(zhì)譜參數(shù)（噴霧電壓、蒸發(fā)溫度、離子傳輸毛細(xì)管溫度、鞘氣和輔助氣流速等）使目標(biāo)物的質(zhì)譜強(qiáng)度和穩(wěn)定性達(dá)到最佳狀態(tài)，然后儀器自動(dòng)對目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。優(yōu)化后的相關(guān)參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本研究對比Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）對撲草凈及其代謝物的分離效果，結(jié)果顯示，粒徑更小的色譜柱在峰形、分辨率、保留時(shí)間等方面表現(xiàn)更佳。流動(dòng)相的組成直接影響分析物的分離效果和檢測靈敏度[32]，甲醇和乙腈是農(nóng)獸藥殘留分析時(shí)常用的流動(dòng)相[33-34]，本研究考察了水相為0.1%甲酸溶液，有機(jī)相分別選用甲醇和乙腈時(shí)目標(biāo)物的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度。如圖1所示，采用甲醇時(shí)，代謝物2-羥基-撲滅津與DIP無法徹底分離，撲草凈亞砜和撲草凈色譜峰不僅重疊在一起，而且出峰時(shí)間位于高有機(jī)相沖洗色譜柱階段，極易受到樣品中強(qiáng)極性雜質(zhì)干擾；采用乙腈時(shí)，雖然撲草凈及其代謝物質(zhì)譜強(qiáng)度稍有降低，但所有分析物的保留時(shí)間均提前至線性梯度洗脫階段，并且5 個(gè)目標(biāo)物的色譜峰分離度顯著提升，因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

圖1 撲草凈及其代謝物總離子流圖（50 ng/mL）Fig.1 Total ion current chromatograms of prometryn and its metabolites (50 ng/mL)

2.3 前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑優(yōu)化結(jié)果

以撲草凈及其代謝物均未檢出的陰性草魚為基質(zhì)，添加質(zhì)量濃度為10 ng/mL的撲草凈及其代謝物混標(biāo)溶液，分別以甲醇、乙酸乙酯、乙腈和1%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑，參照1.3.3.2節(jié)進(jìn)行前處理，考察不同提取溶劑對5 種目標(biāo)物的萃取回收率。圖2表明，當(dāng)選擇甲醇作為提取溶劑時(shí)，代謝物DIP和撲草凈亞砜加標(biāo)回收率超過120%，而代謝物DDIP和2-羥基-撲滅津回收率僅為60%～70%，由于甲醇與水互溶導(dǎo)致樣品濃縮時(shí)不容易蒸干，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；當(dāng)選擇乙酸乙酯提取目標(biāo)物時(shí)，加標(biāo)回收率可達(dá)90%～130%之間，但平行樣測定結(jié)果偏差較大，結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，同時(shí)乙酸乙酯容易溶解水產(chǎn)品中的大量脂肪，提取液顏色深且后續(xù)凈化復(fù)雜；使用1%甲酸-乙腈提取時(shí)，撲草凈亞砜回收率低于20%，說明撲草凈亞砜在酸性環(huán)境中的萃取效率較低，從而導(dǎo)致加標(biāo)回收率偏低；采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，5 種目標(biāo)物加標(biāo)回收率達(dá)75%～105%，乙腈具有沉淀蛋白等作用，提取液顏色較淺且各目標(biāo)物回收率均滿足分析要求，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對撲草凈及其代謝物回收率的影響（n＝3）Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of prometryn and its metabolites (n=3)

2.3.2 凈化試劑優(yōu)化結(jié)果

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析水產(chǎn)品藥物殘留時(shí)，與水產(chǎn)品共萃出的脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會(huì)影響目標(biāo)物的電離能力，造成目標(biāo)物信號強(qiáng)度的改變，因此在前處理中應(yīng)盡量提高凈化效果，去除雜質(zhì)，避免干擾檢測，污染或損害檢測儀器。本研究對比凈化劑Cleanert LipoNo、EMR-Lipid、Cleanert LipoNo與EMRLipid混合物對撲草凈及其代謝物的凈化效果，圖3表明，3 組試劑凈化時(shí)撲草凈及其代謝物的加標(biāo)回收率均可達(dá)80%～120%，Cleanert LipoNo作為一種新型除脂材料，其填料表面修飾了許多長的碳鏈，可針對性地吸附脂肪，使用該凈化試劑時(shí)僅需混合后靜置分層，無需離心，操作方便，但DIP、DDIP和撲草凈亞砜回收率高于117%，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)顯著。EMR-Lipid結(jié)合了體積排阻和疏水作用，可選擇性去除樣品中的主要脂類和大分子雜質(zhì)，選用該試劑凈化時(shí)，除撲草凈亞砜加標(biāo)回收率高于120%之外，其余目標(biāo)物回收率均小于110%，其測量準(zhǔn)確性能夠滿足檢測需求，但平行樣間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relation standard deviation，RSD）大于11%，結(jié)果的重復(fù)性較差。將兩種凈化試劑組合用于樣品凈化時(shí)，5 種目標(biāo)物加標(biāo)回收率為85%～106%，平行樣間的RSD小于6%，說明其去除基質(zhì)干擾的能力最佳。因此，選用Cleanert LipoNo與EMR-Lipid混合物作為樣品前處理的凈化試劑。

圖3 不同凈化試劑對撲草凈及其代謝物回收率的影響（n＝3）Fig.3 Effects of different cleanup sorbents on the recoveries of prometryn and its metabolites (n=3)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍與靈敏度

按照1.3.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中撲草凈及其代謝物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，系列質(zhì)量濃度下?lián)洳輧艏捌浯x物的定量子離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物撲草凈-D6子離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，撲草凈及其代謝物在1.0～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，確定系數(shù)R2均大于0.992。在空白樣品中加入系列低質(zhì)量濃度撲草凈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)峰不小于3 倍信噪比（RSN≥3）確定方法的檢出限（limits of detection，LOD），以不小于10 倍信噪比（RSN≥10）確定方法的定量限（limits of quantification，LOQ），得出水產(chǎn)品基質(zhì)中撲草凈及其代謝物的LOD為0.20 μg/kg，LOQ為0.50 μg/kg，方法靈敏度較高，結(jié)果見表2。

表2 撲草凈及其代謝物線性范圍、線性方程、確定系數(shù)、LOD和LOQTable 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of prometryn and its metabolites

2.4.2 回收率與精密度結(jié)果

取陰性草魚、克氏原螯蝦和中華絨螯蟹肌肉組織樣品，依據(jù)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F[35]的技術(shù)要求，選取LOQ、中間濃度、常見限量值3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，撲草凈及其代謝物3 個(gè)添加量分別為0.5、10、50 μg/kg，每個(gè)添加量進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算方法的加標(biāo)回收率和RSD。如表3所示，草魚、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹等不同水產(chǎn)品基質(zhì)中撲草凈及其代謝物的加標(biāo)回收率為74.4%～113.7%，RSD為3.17%～11.47%，均有良好的準(zhǔn)確度與精密度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

表3 不同水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物回收率和RSD（n＝6）Table 3 Recoveries and RSD of prometryn and its metabolites in different aquatic samples (n=6)

2.4.3 ME評估結(jié)果

采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，評價(jià)ME的影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)于單點(diǎn)或者多點(diǎn)單獨(dú)評價(jià)ME，更具有統(tǒng)計(jì)意義和代表性。當(dāng)ME＜0.85時(shí)，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME為0.85～1.15時(shí)，ME不明顯；當(dāng)ME＞1.15時(shí)，存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[36]。不同基質(zhì)中撲草凈及其代謝物ME結(jié)果如表4所示，結(jié)果顯示，通過內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正后，5 種撲草凈及其代謝物在不同水產(chǎn)品中的ME不明顯，ME均位于0.85～1.15之間，這一結(jié)果證實(shí)了內(nèi)標(biāo)法可以消除ME造成的定量結(jié)果偏差，提高檢測方法的穩(wěn)定性和精準(zhǔn)性。因此本研究采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量分析5 種撲草凈及其代謝物含量。

表4 不同水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物的METable 4 Matrix effects of prometryn and its metabolites in different aquatic samples

2.5 克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留分析

應(yīng)用建立的方法分析藥浴撲草凈后的克氏原螯蝦陽性樣品，以此評價(jià)方法的適用性?？耸显r樣品按照1.3.7節(jié)處理后，將檢出目標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比確認(rèn)，結(jié)果顯示藥浴撲草凈后的克氏原螯蝦肌肉樣品中主要檢測出3 種目標(biāo)物殘留，其中包括撲草凈及其代謝物DIP和撲草凈亞砜（圖4），對殘留物質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)定性后，再利用建立方法準(zhǔn)確評估撲草凈及其代謝產(chǎn)物DIP和撲草凈亞砜在克氏原螯蝦肌肉組織中的殘留水平?？耸显r肌肉組織中撲草凈及其代謝產(chǎn)物藥-時(shí)曲線詳見圖5?？梢钥闯觯c菲律賓蛤仔對撲草凈的富集規(guī)律類似[37]，藥浴撲草凈后，克氏原螯蝦肌肉中的撲草凈殘留量隨時(shí)間大幅波動(dòng)，先后出現(xiàn)2 個(gè)較為明顯峰，不同的是菲律賓蛤仔體內(nèi)撲草凈殘留量在24 h達(dá)到峰值，而克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留量在12 h達(dá)到峰值，說明克氏原螯蝦對撲草凈具有快速富集效應(yīng)，但對比圖5中撲草凈原藥和代謝物殘留量變化趨勢可以看出，在短時(shí)間內(nèi)撲草凈的富集效率遠(yuǎn)高于代謝效率。藥浴撲草凈36 h后將克氏原螯蝦轉(zhuǎn)移至潔凈水中，其肌肉中撲草凈殘留量迅速下降，該結(jié)果與菲律賓蛤仔[37]和海參[38]體內(nèi)的撲草凈消除實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本一致，說明撲草凈在水中消除較快。

圖4 克氏原螯蝦肌肉組織中撲草凈及其代謝物選擇反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.4 SRM chromatograms of prometryn and its metabolites in muscle tissue of crayfish

圖5 克氏原螯蝦肌肉組織中撲草凈及其代謝物藥-時(shí)曲線（n＝5）Fig.5 Drug-time curves of prometryn and its metabolites in muscle tissue of crayfish (n=5)

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，樣品經(jīng)乙腈提取，EMR-Lipid與Cleanert LipoNo組合凈化，甲醇溶液定容后超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，內(nèi)標(biāo)法定量。撲草凈及其代謝物在1.0～500 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，確定系數(shù)R2大于0.992。5 種除草劑LOD為0.20 μg/kg，LOQ為0.50 μg/kg。撲草凈及其代謝物在3 種水產(chǎn)品基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為74.4%～113.7%，RSD為3.17%～11.47%。該方法操作簡單快速、基質(zhì)干擾少、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中撲草凈及其代謝物殘留的精準(zhǔn)識別和準(zhǔn)確定量，為撲草凈在水產(chǎn)動(dòng)物中的藥代動(dòng)力學(xué)和殘留消除規(guī)律研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。