納米Cu/多糖復合抗菌膜的制備與表征及其對冬棗黑斑病的防治效果

徐 悅，陳海藝，周夢含，劉藝璇，郭紅蓮,*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津市食品質(zhì)量與健康重點實驗室，天津 300457）

果蔬采后疾病主要是由真菌感染引起，其產(chǎn)生的真菌毒素對人畜均有害，并且由微生物感染果實受損情況占果蔬損失總數(shù)的2%～8%，其果實受損率高達50%，因此果蔬采后疾病成為急迫解決的問題之一[1-2]。冬棗（Ziziphus jujubaMill.cv.Dongzao）易受鏈格孢菌侵染引起冬棗黑斑病，導致棗果產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降，這給我國棗產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)和貯藏造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。因此，新型高效抗真菌材料的研究開發(fā)技術(shù)迫在眉睫。

納米材料因其高反應(yīng)性和高效率而受到科學家們的廣泛關(guān)注。如Ag[4]、ZnO[5]、TiO2[6]和SiO2[7]能有效改善材料的物理化學和功能特性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、生物、食品、化工等領(lǐng)域。然而納米Cu與其他納米材料相比，具有納米粒徑小、比表面積大、價格低廉和良好的熱穩(wěn)定性等優(yōu)點[8]，對食源性病原體具有強大生物殺滅作用，能夠抵抗惡劣加工條件，是食品包裝中使用的最優(yōu)無機納米顆粒之一[9-10]。Shankar等[11]將CuO納米粒子與不同的碳水化合物混合制備多功能生物納米復合薄膜，探究不同基質(zhì)對納米薄膜的影響。Saravanakumar等[12]成功制備纖維素納米晶須-海藻酸鈉-CuO包埋聚合物膜，對病原菌具有較高的抑菌活性以及抗氧化性。大量研究[13-14]表明納米Cu在抗菌應(yīng)用時會釋放Cu2+，可使細胞產(chǎn)生活性氧，并發(fā)生脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化以及DNA降解，進而導致生物量生長受阻。因此存在納米材料從包裝中遷移至食品的可能性。姜紫薇[15]實驗測得Cu2+質(zhì)量濃度達到4.5 μg/mL時，對人體的肝細胞開始具有損傷作用。Khan等[16]研究發(fā)現(xiàn)納米纖維還原法制備的聚乙烯醇/Cu納米復合材料中Cu2+的釋放量為4 μg/mL。甲殼類水蚤與扁虱是預測污染物對生態(tài)系統(tǒng)毒性的良好模型，Heinlaan等[17]實驗測得納米CuO對兩者半致死濃度分別為3.2、2.1 μg/mL。因此要有效監(jiān)控納米復合膜中離子的遷移量。

可食用的薄膜具有生物降解性、相容性、無毒性、可再生性以及優(yōu)良成膜能力，是食品包裝研究的大趨勢[18]。Shankar等[11]實驗發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉與納米銅具有良好的兼容性。并且與明膠復配能夠有效提高海藻酸鈉單一薄膜的力學性能、熱穩(wěn)定性和生物活性等[19]。利用明膠成本低廉、易獲取且有效改善單一薄膜的性能優(yōu)勢，將其與海藻酸鈉復配可制備可降解薄膜。另外，海藻酸鈉/明膠復合膜除了可以作為分散納米材料的基質(zhì)外，還可成為納米粒子的還原劑和穩(wěn)定劑[20]，因此海藻酸鈉/明膠復合膜可作為納米Cu粒子的優(yōu)良載體。

近年來抗菌食品包裝膜的研發(fā)引起眾多研究者們的廣泛關(guān)注，而對抗真菌食品包裝膜的研究甚少。因此，本研究通過綠色方法合成納米Cu，并以明膠/海藻酸鈉為模板制備納米Cu/多糖復合膜。對納米Cu以及納米Cu/多糖復合膜進行結(jié)構(gòu)表征及理化性能的測定，探究復合膜抗真菌活性，將其應(yīng)用到冬棗黑斑病防治中，并測定防治處理后薄膜Cu2+遷移量。研究結(jié)論可為進一步在果蔬病害防治領(lǐng)域利用納米Cu以及制備高效抗真菌多糖復合膜提供理論基礎(chǔ)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬棗（Ziziphus jujubaMill.cv.Dongzao）來自天津濱海新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

鏈格孢菌（Alternaria alternata）、鐮刀菌（Fusarium）、灰霉（Botrytis cinerea）由實驗室從冬棗中提??；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、硫酸銅、甘油、二水檸檬酸鈉、VC、氫氧化鈉 天津東天正精細化學試劑廠；海藻酸鈉（分析純，黏度350～550 Pa·s，相對分子質(zhì)量222.00）、明膠（膠強度～250 g Bloom）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FEI-Apreo型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)E-SEM）美國捷克公司；IS50型傅里葉變換紅外光譜（Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 美國尼高利公司；Q50型熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）儀美國TA Instruments Waters LLC公司；UV-3600 Plus型紫外-可見近紅外分光光譜（diffuse reflection spectroscopy，DRS）儀 日本島津公司；ICAPQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）儀 美國Perkin Elmer公司；TA.TOUCH型質(zhì)構(gòu)儀上海保圣實業(yè)發(fā)展有限公司；CH1S 型數(shù)字測微計蘇天瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納米Cu制備

根據(jù)Pariona等[21]方法，稱取2.5 g的二水檸檬酸鈉溶于100 mL的蒸餾水中，加入5 g的硫酸銅，然后加入50 mL的抗壞血酸（0.2 mol/L）充分溶解，加入30 mL的NaOH（1 mol/L）在95 ℃加熱90 min。冷卻至室溫，離心（4000×g、4 ℃）10 min后得到紅棕色粉末，為納米Cu。然后用蒸餾水洗滌3 次，用乙醇洗滌1 次。所得粉末在室溫下干燥48 h。

1.3.2 納米Cu/多糖復合膜的制備

明膠溶液（8%）與海藻酸鈉溶液（2%）以質(zhì)量比6∶4混合均勻，然后添加1.5%（以前面混合溶液質(zhì)量計）甘油混合成基礎(chǔ)膜液。將納米Cu粉末加入基礎(chǔ)膜液中，使其質(zhì)量濃度最終為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L，使用攪拌器中速攪拌1 h，然后采用延流法[22]，將15 mL的納米膜液倒入直徑為90 mm的圓形平皿中，45 ℃干燥5 h，冷卻至室溫揭膜，在相對濕度（55±2）%環(huán)境中平衡72 h備用。

1.3.3 復合膜的表征

1.3.3.1 微觀結(jié)構(gòu)測定

隨機選取完整、表面無劃痕的納米薄膜，切割制成為5 mm×5 mm的正方形，噴金處理后，放置在FE-SEM下進行觀察。

1.3.3.2 紅外光譜、熱穩(wěn)定性測定

使用FT-IR儀測量薄膜紅外光譜以評估薄膜的結(jié)構(gòu)。光譜分辨率為2 cm-1，范圍為450～4000 cm-1。

使用TGA儀評估薄膜的熱穩(wěn)定性能，將制備的材料在惰性氣體（N2）環(huán)境中以10 ℃/min的加熱速率從30 ℃加熱到600 ℃。

1.3.3.3 透光性測定

使用DRS儀測定膜的透光率。

1.3.4 復合膜理化檢測指標測定

1.3.4.1 厚度使用數(shù)字測微計在薄膜樣品上隨機選取10 個位置，測量膜的厚度。

1.3.4.2 水蒸氣透過率（water vapor permeability，WVP）參照李雪[23]的方法測量。首先，在稱重瓶中注入蒸餾水（100%相對濕度），并覆蓋上制備的薄膜。然后將稱量瓶放在干燥器中（75%相對濕度、25 ℃），每24 h對稱量瓶的質(zhì)量進行一次稱質(zhì)量。通過式（1）得到WVP：

式中：Δm為稱量瓶在Δt時間內(nèi)的質(zhì)量變化/g；Δt為測量時間間隔/d；A為薄膜的有效面積/m2；x為薄膜的平均厚度/m；Δp為薄膜兩邊的水蒸氣分壓差/Pa（純水25 ℃時的飽和水蒸氣壓為3.1671 kPa，75%相對濕度水蒸氣壓為2.3753 kPa）。

1.3.4.3 吸濕性與含水量

參照李雪[23]的方法，對膜吸濕前后和干燥前后進行質(zhì)量變化的測定，進而計算出吸濕性和含水量。

1.3.4.4 機械性能測定

使用質(zhì)構(gòu)儀對薄膜樣品（20 mm×60 mm的長方形）進行拉伸強度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（elongation break，EB）的測定。初始抓取分離距離為30 mm，十字頭速率為1mm/s。TS和EB分別通過式（2）、（3）得到：

式中：F為薄膜破裂時的最大拉力/N；L為薄膜的寬度/mm；d為薄膜的厚度/mm。

式中：L0為薄膜的原始長度/mm；L1為薄膜斷裂時的長度/mm。

1.3.5 納米Cu/多糖復合膜抗真菌活性的測定

1.3.5.1 復合膜液對真菌菌絲的影響

使用藥平板方法測定納米材料對真菌菌絲的抑制效果。分別吸取1 mL質(zhì)量濃度為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L的納米Cu/多糖復合膜液涂布PDA表面，待含藥平板干燥后，向平板中央分別接入鏈格孢菌、鐮刀孢菌、灰霉菌片，共設(shè)置3 組不同種抗菌實驗，每組3 個平行，實驗重復3 次。于27 ℃放置7 d，并進行記錄與觀察。

1.3.5.2 復合膜液對真菌生物量的影響

分別吸取10 mL質(zhì)量濃度為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L的納米Cu/多糖復合膜液加入90 mL的PDB培養(yǎng)基中，然后向液體培養(yǎng)基中分別接入一個鏈格孢菌、鐮刀孢菌、灰霉菌片，共設(shè)置3 組不同種抗菌實驗，每組3 個平行，實驗重復3 次。于27 ℃放置7 d，離心得到菌絲體，烘干直至質(zhì)量無變化，觀察錐形瓶中真菌生物量生長狀況及稱量菌絲體的質(zhì)量。

1.3.6 納米Cu/多糖復合膜對感染真菌冬棗的防治

1.3.6.1 菌懸液的制備

用接種環(huán)刮去平板上的鏈格孢菌，轉(zhuǎn)移到無菌水中，加入玻璃珠，徹底搖勻溶液。溶液經(jīng)6 層無菌紗布過濾，得到鏈格孢子懸浮液。使用血球計數(shù)板調(diào)整孢子懸浮液濃度至1×105spores/mL，現(xiàn)用現(xiàn)制備。

1.3.6.2 納米Cu/多糖復合膜對有傷接種冬棗的防治效果測定

首先對冬棗進行預處理，用清水浸泡2 min，流水沖洗2 min，晾干備用。用無菌接種環(huán)在赤道位置打小孔直徑為2 mm（盡量減小果實創(chuàng)傷），注入濃度為1×105spores/mL的鏈格孢菌懸液10 μL。待菌液吸收后將基礎(chǔ)膜、納米Cu/多糖復合膜緊貼于果實表面進行包裹，以覆蓋膜的為實驗組，無膜處理的為對照組（感染無處理組），只進行微小打孔的為空白組（自然組）。每種防治方式處理30 個果實，并設(shè)置3 個平行，實驗重復3 次。將冬棗置于在室溫下、相對濕度85%的泡沫箱中，避光存放，每天觀察記錄發(fā)病情況、測量病斑直徑，并根據(jù)式（4）、（5）計算發(fā)病率及防治效果：

1.3.7 納米Cu/多糖復合膜中Cu2+向果實遷移量的測定

1.3.7.1 Cu系列標準溶液配制

精確移取1000 μg/mL Cu標準溶液5 mL，用質(zhì)量分數(shù)5%的HNO3溶液定容至100 mL容量瓶中，制得Cu標準儲備液（50 μg/mL）。分別移取一定量的Cu標準儲備液于50 mL容量瓶中，用5% HNO3溶液定容得到Cu系列標準溶液。

1.3.7.2 樣品處理方法

使用ICP-MS儀評估食品復合膜中Cu2+的遷移量[24]，用來進行風險評估。取1.3.6.2節(jié)中貯藏期間（5 d和10 d）冬棗果實，將揭膜后不清洗的和揭膜后經(jīng)3 min流水清洗過的第5、10天冬棗設(shè)置為實驗組，共4 組，感染無處理組為空白對照組。對待測樣品進行烘干粉碎，準確稱取0.5 g樣品至50 mL消解容器中，加入5%硝酸5 mL、雙氧水1 mL，放入石墨加熱板150 ℃消解90 min，中途不間斷加上述酸至樣品消解完全，趕酸，冷卻后過濾，定容至10 mL容量瓶中，同法做3 次平行，上機測試。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 納米Cu/多糖復合膜的微觀結(jié)構(gòu)分析

用FE-SEM對納米Cu及納米Cu/多糖復合膜的形貌進行表征。如圖1A所示，合成的納米Cu粒子為規(guī)則的球形，大小均一，粒徑約44 nm。從圖1B可以看出，基礎(chǔ)膜表面光滑緊致、連續(xù)無孔隙，說明明膠與海藻酸鈉結(jié)合良好。圖1C為0.25 g/L質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復合膜，顯示復合膜的表面相比基礎(chǔ)膜稍有粗糙，而納米Cu粒子在膜中均勻而不連續(xù)地分散，與多糖膜液具有良好相容性，略微出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。圖1D中為高質(zhì)量濃度納米復合膜，團聚程度顯著加重。說明納米Cu在薄膜中團聚現(xiàn)象會隨著質(zhì)量濃度遞增而加重。以上結(jié)果表明適量質(zhì)量濃度的納米Cu的加入不會導致薄膜表面出現(xiàn)不均勻的裂紋，所以明膠/海藻酸膜可作為納米Cu粒子的優(yōu)良載體。

圖1 納米Cu/多糖復合膜的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of nano-Cu/polysaccharide composite films

2.2 納米Cu/多糖復合膜紅外光譜與熱穩(wěn)定性分析

紅外光譜分析是研究膜物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效手段，通過觀測吸收峰的變化，可分析納米Cu與基礎(chǔ)膜分子間的相互作用。如圖2A所示，3042～3600 cm-1之間存在一個寬頻帶，這與自由—OH基團的分子內(nèi)和分子間拉伸或與氫鍵有關(guān)。在2930 cm-1處的特征峰與葡萄糖環(huán)中甲基氫原子的C—H拉伸有關(guān)。在1630 cm-1處的峰是由水分子的—OH拉伸引起。在1540 cm-1處的峰是由羧基的不對稱伸縮振動引起。在1185～1011 cm-1處的條帶歸因于C—O、C—C、O—H和C—O—C糖苷鍵的拉伸和彎曲。然而發(fā)現(xiàn)隨著納米Cu質(zhì)量濃度的增加，并沒有出現(xiàn)的新的峰，說明納米Cu只是吸附在基礎(chǔ)膜液中，沒有化學結(jié)構(gòu)的改變。但是在相同波長下，摻有納米Cu的多糖復合膜吸收峰的強度增強，推測納米Cu的加入加強了明膠與海藻酸鈉之間的相互作用力，導致膜結(jié)構(gòu)更加緊密，更具有韌性[25]。

圖2 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復合膜的紅外光譜與TGA曲線Fig.2 FT-IR spectra and TGA curves of composite films with different concentrations of nano-Cu

在熱分解實驗中，用TGA儀對復合膜熱穩(wěn)定性進行評價。從膜的熱重曲線圖（圖2B）可以看出，在100 ℃的降解過程中，質(zhì)量損失是由于水分的蒸發(fā)造成的，由圖2C可知，基礎(chǔ)膜（0.00 g/L）與含納米Cu的復合膜在100 ℃內(nèi)發(fā)生水分蒸發(fā)，這與表1中含水量的測定結(jié)果相似，且不同質(zhì)量濃度薄膜之間存在略微差異。在100～300 ℃之間膜發(fā)生顯著熱分解，在0.00、0.10、0.25、0.50 g/L的膜熱分解最高峰溫度在165～182 ℃之間，0.75 g/L膜趨于182～227 ℃之間，而1.00 g/L膜的熱分解最高峰溫度在227 ℃，說明納米Cu的加入使基礎(chǔ)膜熱分解向更高溫度轉(zhuǎn)移。推測納米Cu與基礎(chǔ)膜之間存在更高的鍵能，這與FT-IR分析結(jié)果一致。綜上所述，納米Cu的加入略微降低了基礎(chǔ)膜的熱分解行為，這對包裝材料的高溫滅菌具有重要意義。

表1 復合膜的厚度、WVP、吸濕性、含水量及機械性能Table 1 Thickness,water vapor permeability,hygroscopicity,moisture content and mechanical properties of composite films

2.3 膜的透光性分析

薄膜的透光性影響消費者對食品的感官評價，使用DRS儀對不同水平的納米Cu/多糖膜的透光性進行表征，結(jié)果如圖3所示?；A(chǔ)膜具有較高的透明度，摻有納米Cu材料的復合膜呈現(xiàn)淡綠色，隨納米Cu含量的增加，膜的顏色逐漸加深，所以復合膜的透明度逐漸降低。圖3B為不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復合膜的透光率，基礎(chǔ)薄膜在可見光下透過率最高，0.75 g/L與1.00 g/L膜的透光性大體一致?？傮w隨著納米Cu添加量的增加，透光率呈降低狀態(tài)，這與復合膜的外觀形態(tài)表述一致。

圖3 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復合膜的外觀（A）與透光率（B）Fig.3 Appearance (A) and transmittance (B) of composite films with different concentrations of nano-Cu

2.4 納米Cu/多糖復合膜的理化性能分析

薄膜的厚度直接影響膜的理化、光學性能，并對膜的TS、EB與WVP也有直接影響。如表1所示，基礎(chǔ)膜與復合膜厚度差異顯著（P＜0.05），而隨著納米Cu質(zhì)量濃度的增加，多糖復合膜厚度隨之增加，存在略微差異。

WVP是水通過可食用薄膜的質(zhì)量轉(zhuǎn)移機制。具有較低WVP的薄膜有助于減少或避免食物與外界環(huán)境之間的水分交換，防止食品變質(zhì)[26]。如表1所示，摻有納米Cu的多糖膜的WVP顯著低于基礎(chǔ)膜（P＜0.05），1.00 g/L的膜WVP最低（5.5394×10-5g·m/（m2·Pa·d））。推測納米Cu材料加入到多糖膜網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)中，減少了膜內(nèi)空間結(jié)構(gòu)的自由體積，增強了基質(zhì)中的分子間相互作用[27]。因此復合膜形成致密結(jié)構(gòu)，減少了水蒸氣的透過性。還有研究[28]發(fā)現(xiàn)，小分子基質(zhì)的摻入為水分子通過聚合物屏障創(chuàng)造復雜的途徑。所以納米Cu的加入顯著降低了基礎(chǔ)薄膜的WVP。

膜的吸濕性越大，其阻隔性越低[23]。復合膜的吸濕性結(jié)果見表1，基礎(chǔ)膜的吸濕性最大（（38.8211±0.8112）%），阻隔性能最差。而1.00 g/L 的納米C u/多糖復合膜的吸濕性最小（（28.2573±0.8163）%），與基礎(chǔ)膜相比降低了10.56%，表現(xiàn)出最好的阻隔性能。所以隨著納米Cu的添加量增加，膜的吸濕性逐漸降低，說明納米Cu的加入顯著降低膜的吸濕性（P＜0.05）。已知納米Cu含量越高，復合膜的WVP越低，推測是由于納米Cu粒子占據(jù)多糖膜網(wǎng)絡(luò)空間孔隙結(jié)構(gòu)。由此可知，隨著納米材料的增加，含水量亦逐漸降低，這與表1描述一致。

食品包裝膜具有可拉伸特征，利于保持膜的完整性和機械強度，能夠承受食品加工、處理和儲存過程中的外部壓力[29]。利用質(zhì)構(gòu)儀對復合膜進行了薄膜機械性能的測定。如表1所示，0.50 g/L至1.00 g/L的膜TS遠大于0.00、0.10 g/L和0.25 g/L膜。說明納米Cu的加入顯著提高基礎(chǔ)膜的TS，降低EB。推測納米Cu填充多糖復合膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強基礎(chǔ)膜與納米Cu之間的界面相互作用，導致復合膜結(jié)構(gòu)緊密，增強了TS，機械性能優(yōu)異。

2.5 納米Cu/多糖復合膜的抗真菌活性

2.5.1 納米Cu/多糖復合膜液對真菌的抑制活性

抑菌食品包裝膜的研究近年來成為廣泛重點關(guān)注問題，而抗真菌食品包裝膜一方面可作為防止真菌入侵的堅固物理屏障，另一方面也是抗真菌的抑菌劑，延長果蔬保質(zhì)期。本實驗使用瓊脂平板擴散法探究納米Cu/多糖膜液對不同真菌的抑菌活性。探究不同質(zhì)量濃度（0.00、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L）納米Cu/多糖復合膜材料在PDA板上對鏈格孢菌、鐮刀孢菌及灰霉的菌絲體的抑制作用，結(jié)果如圖4A所示。不同質(zhì)量濃度的納米Cu/多糖復合膜材料對不同真菌表現(xiàn)出不同程度的抗真菌活性，如圖4B所示，納米Cu/多糖復合膜對鏈格孢菌、鐮刀孢菌及灰霉的抑制率與納米Cu質(zhì)量濃度呈正比，在0.10 g/L時對鐮刀孢菌（10.93%）與灰霉（12.90%）的抑制效果相似，對鏈格孢菌的抑制效果最顯著，可達32.69%。在0.25、0.50 g/L時復合膜液對鐮刀孢菌的抑制性能較低，而在0.75 g/L時抑菌活性上升。納米Cu/多糖復合膜對鏈格孢菌、鐮刀孢菌及灰霉最高抑菌率分別為87.80%、77.73%、81.96%，因此抑制效果為鏈格孢菌＞灰霉＞鐮刀孢菌。

圖4 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復合膜對真菌抑制效果Fig.4 Antifungal effects of composite films with different concentrations of nano-Cu

2.5.2 納米Cu/多糖復合膜液對真菌生物量的影響

基于不同質(zhì)量濃度的納米Cu/多糖復合膜對不同真菌菌絲生長抑制的比較并不意味著最佳的抗真菌能力，因此要考慮生物量等綜合因素。圖5顯示在未加入納米材料的膜液（0.00 g/L）中，鏈格孢菌的生長繁殖能力遠大于鐮刀孢菌及灰霉，而在相同濃度納米材料下，對鐮刀孢菌和灰霉的抑制效果更佳，這與表2所示抑菌效果相似。在相同真菌條件下，質(zhì)量濃度與真菌生物量呈反比，說明質(zhì)量濃度越高，對真菌菌絲體、孢子以及真菌毒素的抑制作用越強。并且納米Cu質(zhì)量濃度為0.25 g/L時，對鏈格孢菌抑制率為55.80%，可稱為該真菌的半抑制濃度。但是據(jù)圖4可知，在相同質(zhì)量濃度的納米材料下，鏈格孢菌的菌絲菌落直徑遠小于鐮刀孢菌、灰霉，而在圖5中顯示鏈格孢菌的生物量遠大于鐮刀孢菌、灰霉。因此可推測納米Cu對不同真菌產(chǎn)孢量影響存在差異，對產(chǎn)孢量抑制效果為鐮刀孢菌＞灰霉＞鏈格孢菌。綜上結(jié)果，推測納米Cu具有破壞真菌細胞膜結(jié)構(gòu)的作用[30]，對真菌生物量起著抑制生長作用，根據(jù)表2可知，納米Cu對真菌生物量的抑制效率為鐮刀孢菌＞灰霉＞鏈格孢菌。

表2 納米Cu/多糖復合膜對真菌生物量的影響Table 2 Effect of nano-Cu/polysaccharide composite films on fungal biomass

圖5 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復合膜對真菌生物量作用效果Fig.5 Effects of composite films with different concentrations of nano-Cu on fungal biomass

2.6 納米Cu/多糖復合膜對感染黑斑病冬棗的防治效果

冬棗的真菌感染防治在貯藏、運輸和銷售過程中是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此，本研究以冬棗為代表性果實，檢測納米Cu/多糖復合膜的生物防治效果。使用0.25 g/L的納米復合膜進行果實生物防治。圖6A為10 d貯藏期的膜處理有傷接種鏈格孢菌冬棗的防治效果圖，圖6B顯示，冬棗果實發(fā)病率隨著貯藏時間的延長均呈上升趨勢，納米Cu/多糖復合膜組發(fā)病率顯著低于感染無處理組、基礎(chǔ)膜組（P＜0.05）。感染無處理組果實在第2天開始發(fā)病，而基礎(chǔ)膜和復合膜處理的果實均在第4天開始發(fā)病。第10天時感染無處理組發(fā)病率高達94.44%，而納米復合膜組僅為44.24%，發(fā)病率降低53.16%，兩者差異顯著（P＜0.05）。圖6C、D是貯藏期為10 d防治效果，納米復合膜組病斑直徑顯著低于基礎(chǔ)膜與感染無處理組（P＜0.05），對果實的防治效果最高達52.53%，說明納米Cu/多糖復合膜能有效延遲感染真菌果實的發(fā)病時間并抑制發(fā)病速率及病斑直徑擴展范圍，延長感染黑斑病冬棗的保質(zhì)期。

圖6 納米Cu/多糖復合膜對有傷接種冬棗防治效果Fig.6 Control effect of nano-Cu/polysaccharide composite films on black spot disease of winter jujube

2.7 納米Cu/多糖復合膜中Cu2+向果實的遷移分析

以0.25 g/L納米Cu/多糖復合膜為研究對象，當復合膜與食品接觸時，Cu2+會從膜中向果實遷移，少量的Cu2+進入果實表面或是內(nèi)部，可以抑制果實中致病菌繁殖，從而延長果實保質(zhì)期。實驗測得Cu標準曲線為Y＝1177.71X+24.33，決定系數(shù)R2為0.9998，說明該方法的線性相關(guān)性高，滿足樣品檢測要求。如圖7所示，冬棗在0 d時Cu含量為0.9581 mg/kg，在5 d未清洗時為1.2471 mg/kg，清洗后可去除0.0388 mg/kg，Cu2+遷移量為0.2890 mg/kg（0.0145 μg/mL）。在10 d未清洗時Cu含量為1.3321 mg/kg，清洗可去除0.0885 mg/kg，Cu2+遷移量為0.3740 mg/kg（0.0187 μg/mL）。發(fā)現(xiàn)隨時間變化，復合膜中的Cu2+遷移量增加，并且5 d和10 d清洗后的果實中Cu含量差異較小，而對未清洗果實，10 d時的Cu含量顯著高于5 d（P＜0.05），說明復合膜中的Cu2+僅存在于果皮表面，不會進入果實內(nèi)部。姜紫薇[15]實驗發(fā)現(xiàn)當Cu2+質(zhì)量濃度達到4.5 μg/mL時，對人體的肝細胞開始具有損傷作用。而納米Cu/多糖復合膜在10 d時Cu2+遷移量（0.0187 μg/mL）遠小于4.5 μg/mL，所以該納米Cu/多糖復合膜在果蔬包裝領(lǐng)域應(yīng)用存在危害健康風險較低，可放心使用。

圖7 納米Cu/多糖復合膜對冬棗Cu含量的影響Fig.7 Migration of Cu2+ from nano-Cu/polysaccharide composite films to winter jujube

3 結(jié)論

本研究通過綠色合成納米Cu材料，與明膠/海藻酸鈉膜液共混制備納米Cu/多糖復合膜，測定合成的納米Cu為規(guī)則的球形，大小均一，粒徑約44 nm。并且納米Cu粒子的摻入影響膜的外觀形態(tài)，多糖膜可作為納米Cu的優(yōu)良載體。綠色合成納米Cu的摻入有效降低多糖膜的WVP、吸濕性及含水量，使復合膜具有良好的機械性能。進而探究了納米Cu/多糖復合膜對鏈格孢菌、鐮刀孢菌、灰霉的最高抗真菌活性分別為87.80%、77.73%、81.96%。使用0.25 g/L的納米Cu/多糖復合膜對感染黑斑病的冬棗進行10 d的防治，發(fā)病率有效降低53.16%，防治效果達52.53%，在10 d時Cu2+遷移量為0.0187 μg/mL。根據(jù)以上結(jié)果，納米Cu摻入明膠/海藻酸鈉多糖膜可以有效降低感染真菌果實的腐爛率，延長冬棗果實的保質(zhì)期，可作為一種新型的食品專用抗真菌包裝材料。