3 種方法檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒人工感染雞胚孵化雛雞的帶毒比較

徐鳳霞，孫萬(wàn)里，張亞文，常 爽，王一新，趙 鵬

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病（reticuloendotheliosis，RE） 是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）感染引起的一種病毒性腫瘤病和免疫抑制性疾病，臨床主要表現(xiàn)為免疫抑制、致死性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤以及生成慢性腫瘤等[1]。REV 的自然宿主有雞、火雞、鴨、鵝等禽類(lèi)，其中火雞最易感染，實(shí)驗(yàn)室常用雞作為研究宿主[2]。REV 極易引起低日齡禽類(lèi)患病，導(dǎo)致患禽抵抗力下降，繼發(fā)其他細(xì)菌病或者病毒病。而成年禽類(lèi)對(duì)REV 抵抗能力強(qiáng)，感染后一般不出現(xiàn)癥狀或僅出現(xiàn)一過(guò)性病毒血癥[3]。從REV 抗體陽(yáng)性雞的肝脾組織中分離得到REV-C45 株后，我國(guó)研究學(xué)者在國(guó)內(nèi)各個(gè)地區(qū)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果在多個(gè)地區(qū)檢測(cè)到REV[4-9]。目前，尚未有商品化生物制品或藥物來(lái)有效防控RE，同禽白血病等垂直傳播性疾病一樣，可考慮實(shí)施種源凈化等措施來(lái)控制該病。

REV 感染禽主要表現(xiàn)非特征性臨床癥狀，即便剖檢后肝臟、胸腺或法氏囊等器官出現(xiàn)特征性病變，仍然難以與其他免疫抑制病區(qū)分[10]，因此僅通過(guò)臨床表現(xiàn)及剖檢實(shí)現(xiàn)對(duì)REV 感染的鑒別診斷難度較大，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)加以確診。垂直傳播是REV 最重要的傳播方式，通過(guò)特定時(shí)間和特定檢測(cè)技術(shù)及時(shí)發(fā)現(xiàn)并淘汰垂直傳播感染雞是開(kāi)展REV 凈化的關(guān)鍵步驟。為此，本研究通過(guò)雞胚卵黃囊接種，人工構(gòu)建了REV 垂直傳播感染SPF 雛雞模型，分別采集出殼后雞的胎糞/泄殖腔棉拭子和血液，比較病毒分離、RT-PCR 和熒光定量RTPCR 這3 種常用病原檢測(cè)技術(shù)在不同檢測(cè)節(jié)點(diǎn)的REV 陽(yáng)性檢出率，以期為實(shí)施REV 種源凈化提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

REV 野毒株LN1201 株，為2012 年山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室從某父母代種雞場(chǎng)疑似患禽腫瘤病的雞血漿中分離得到，已完成全基因組測(cè)序（GenBank登錄號(hào)KU641115.1）。SPF 雞胚，購(gòu)自山東濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。接種REV 的雞胚孵化至21 日胚齡后，雞出殼飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。

1.2 抗體與檢測(cè)試劑盒

REV 特異性單克隆抗體小鼠純化腹水11b118，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病和免疫抑制病研究室制備和保存，其效價(jià)為1:8 000；FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體（批號(hào)Q10328），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；病毒RNA 提取試劑盒（批號(hào)R68740200000I26V003），購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司；Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)A4A2926）和SYBR Green ProTaqHS 預(yù)混型qPCR 試劑盒II（批號(hào)A4A3047），購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取50 枚SPF 雞胚，待孵化至6 胚齡時(shí)，經(jīng)卵黃囊接種LN1201 株病毒液，接種劑量為1 500 TCID50/枚，作為卵黃囊感染組，代表REV 經(jīng)雞胚垂直傳播感染；另取同胚齡SPF 雞胚10 枚接種等體積生理鹽水，正常孵化后作為空白對(duì)照組。孵化出殼后采集雛雞胎糞/泄殖腔棉拭子和抗凝血，接種DF-1 細(xì)胞進(jìn)行病毒分離或提取核酸進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.4 不同日齡雞胎糞/泄殖腔棉拭子及血液樣品的REV 分離

分別于雛雞出殼后1、7、14、21、28、35、42、49、56、63 及70 日齡時(shí)，對(duì)雞胚卵黃囊感染組和空白對(duì)照組無(wú)菌采集抗凝血及胎糞/泄殖腔棉拭子，對(duì)抗凝血3 000 ×g離心2 min 分離血漿，對(duì)胎糞/泄殖腔棉拭子渦旋混勻后取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾器過(guò)濾；將上述血漿及濾液無(wú)菌操作接種于DF-1細(xì)胞，維持7 d后以細(xì)胞固定液固定細(xì)胞，以REV 特異性單克隆抗體11b118 作為第一抗體，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 作為第二抗體，通過(guò)間接免疫熒光法（IFA）檢測(cè)各組的REV 病毒血癥及胎糞/泄殖腔棉拭子REV 分離率，觀察試驗(yàn)結(jié)果并記錄陽(yáng)性率。

1.5 不同方法檢測(cè)各節(jié)點(diǎn)REV 核酸

根據(jù)GenBank 上已發(fā)表的REV 全基因組序列，使用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)針對(duì)REVpol基因的引物用于檢測(cè)樣品的RNA，引物序列見(jiàn)表1。參照OMEGA viral RNA 提取試劑盒使用說(shuō)明，從胎糞/泄殖腔棉拭子和抗凝血樣品中提取核酸后進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。熒光定量RT-PCR 檢測(cè)，按照艾科瑞生物工程有限公司SYBR Green ProTaqHS 預(yù)混型qPCR 試劑盒II 說(shuō)明書(shū)，用優(yōu)化好的反應(yīng)條件，在羅氏熒光定量PCR 儀上進(jìn)行SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。

表1 用于檢測(cè)REV 的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法檢測(cè)1 日齡雛雞血漿及胎糞REV 陽(yáng)性檢出率比較

接種REV 的雞胚共孵出雛雞25 只，另外25只雞胚孵化期間出現(xiàn)死胚或雞胚破殼力不足致小雞不出殼且剝開(kāi)有血，死亡時(shí)間集中在17～20 胚齡。如表2 所示，對(duì)卵黃囊感染組1 日齡出殼的SPF雞血漿進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)熒光定量RT-PCR 檢出率最高（100%，25/25），其他依次為病毒分離（96%，24/25）、RT-PCR（36%，9/25）；對(duì)卵黃囊感染組1 日齡出殼的SPF 雞胎糞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3 種方法的陽(yáng)性檢出率均低于血漿?？梢钥闯?，對(duì)于1日齡雛雞血漿，熒光定量RT-PCR 和病毒分離用于凈化時(shí)檢測(cè)REV 垂直傳播的效果俱佳。

表2 1 日齡雛雞血漿及胎糞抗原檢測(cè)與病毒分離結(jié)果

2.2 不同方法對(duì)不同日齡雞血漿的REV 動(dòng)態(tài)檢測(cè)

各組于7～70 日齡每隔1 周無(wú)菌采集抗凝血，分別采用細(xì)胞病毒分離、RT-PCR 以及熒光定量RT-PCR 檢測(cè)REV，比較不同方法的陽(yáng)性檢出率。如表3 所示：不管采用何種檢測(cè)方法，空白對(duì)照組血液中始終未分離到REV 或檢測(cè)到REV 核酸，表明空白對(duì)照組SPF 雞始終保持REV 陰性，并且各檢測(cè)方法特異性良好。卵黃囊感染組血液的病毒分離陽(yáng)性檢出率從7 日齡時(shí)的89%很快升至100%，并且在隨后的監(jiān)測(cè)周期內(nèi)基本保持100%，表明REV 通過(guò)垂直傳播容易形成持續(xù)性病毒血癥；熒光定量RT-PCR 的陽(yáng)性檢出率在監(jiān)測(cè)周期內(nèi)始終保持100%；普通RT-PCR 的陽(yáng)性檢出率顯著較低，最高時(shí)僅為67%，可能造成漏檢。上述結(jié)果與1日齡雛雞血漿及胎糞REV 的檢測(cè)總體一致。

表3 不同檢測(cè)方法對(duì)7～70 日齡雞血漿的REV 動(dòng)態(tài)陽(yáng)性檢出率 單位：%

2.3 不同方法對(duì)不同日齡雞泄殖腔棉拭子的REV動(dòng)態(tài)檢測(cè)

如表4 所示：與雛雞血液的動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果總體一致，空白對(duì)照組泄殖腔棉拭子始終未分離到REV 或檢測(cè)到REV 核酸，表明空白對(duì)照組雞群始終保持陰性，且檢測(cè)方法特異性較好。整個(gè)試驗(yàn)期間，卵黃囊感染組試驗(yàn)雞均持續(xù)不斷通過(guò)糞便向外排毒，7 日齡時(shí)，病毒分離、RT-PCR 以及熒光定量RT-PCR 均能從泄殖腔棉拭子中檢測(cè)到REV，但不同時(shí)期3 種檢測(cè)技術(shù)對(duì)泄殖腔棉拭子的陽(yáng)性檢出率動(dòng)態(tài)規(guī)律與血液并非完全一致。有時(shí)泄殖腔棉拭子REV 陽(yáng)性檢出率低于同時(shí)期血液，如7 日齡時(shí)泄殖腔棉拭子和血液經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)陽(yáng)性檢出率分別為21%和32%；有時(shí)高于同時(shí)期血液，如70日齡時(shí)分別為100%和40%。但結(jié)合病毒分離及熒光定量RT-PCR 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)血液中的REV 陽(yáng)性檢出率總體上高于糞便。由此表明，REV 在血液和糞便中的帶毒排毒并非完全一致，因此為提高凈化檢測(cè)效率，在進(jìn)行實(shí)際病原監(jiān)測(cè)時(shí)不能只依賴(lài)一種檢測(cè)方法或樣本。

表4 不同檢測(cè)方法7～70 日齡雞泄殖腔拭子的REV 動(dòng)態(tài)陽(yáng)性檢出率 單位：%

3 討論

REV 是雞群中一種常見(jiàn)的垂直傳播性免疫抑制病毒，可引發(fā)腫瘤和免疫抑制，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)[11-12]。REV 與禽白血病病毒（avian Leukosis virus，ALV）有很多相似性，它們同屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒、免疫抑制性病毒，均可以垂直傳播。目前，對(duì)于禽白血病，主要實(shí)施種源凈化加以控制。種源禽白血病凈化依賴(lài)于摸清ALV 排毒規(guī)律，需要通過(guò)研究和比較可靠的檢測(cè)樣品和方法實(shí)施凈化淘汰[13-15]。

在實(shí)施禽白血病凈化檢測(cè)時(shí)，出殼雛雞的胎糞檢測(cè)是實(shí)施凈化的重要步驟，目前最簡(jiǎn)單快速的初篩方法就是采集出殼雛雞胎糞進(jìn)行ALV 群特異性衣殼蛋白27（p27）抗原檢測(cè)，以此首先檢測(cè)出經(jīng)垂直傳播感染帶毒的雛雞，這一檢測(cè)步驟對(duì)于盡可能早地檢出和淘汰ALV 陽(yáng)性雛雞，最大程度降低垂直傳播及其帶來(lái)的早期水平傳播極為重要[16-17]。參照這一重要步驟，本研究通過(guò)雞胚卵黃囊接種人工構(gòu)建了REV 垂直傳播感染雛雞模型，待雞出殼后分別采集胎糞/泄殖腔棉拭子和血液，使用病毒分離、RT-PCR 和熒光定量RT-PCR 這3 種病原學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不管是檢測(cè)胎糞/泄殖腔棉拭子還是血液，3 種方法檢測(cè)結(jié)果均可很好地顯示出REV 垂直傳播感染的特性，但不同樣品和不同方法陽(yáng)性檢出率有差異。如：熒光定量RT-PCR檢測(cè)1 日齡雛雞血液REV 陽(yáng)性檢出率達(dá)到100%，檢出率最高；細(xì)胞病毒分離的陽(yáng)性檢出率始終較高，不管是胎糞/泄殖腔棉拭子還是血液，檢出率與熒光定量RT-PCR 檢測(cè)基本接近。

不管是REV 還是ALV，通過(guò)雞胚垂直傳播時(shí)容易形成持續(xù)性病毒血癥。7～70 日齡連續(xù)的抗凝血檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，熒光定量RTPCR 檢測(cè)REV 陽(yáng)性檢出率始終為100%，多數(shù)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞病毒分離的REV 陽(yáng)性檢出率也為100%。通過(guò)兩種檢測(cè)方法檢出率對(duì)比，發(fā)現(xiàn)各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的胎糞/泄殖腔棉拭子REV 檢出規(guī)律與雛雞血液總體一致，熒光定量RT-PCR 和病毒分離對(duì)胎糞/泄殖腔棉拭子的REV 檢出率始終不高于血液，特別是在前三周齡內(nèi)。在實(shí)施REV 凈化時(shí)，熒光定量RT-PCR 比病毒分離具有更為明顯優(yōu)勢(shì)：首先，在試驗(yàn)人員的操作要求方面，病毒分離試驗(yàn)中涉及的細(xì)胞培養(yǎng)、血漿分離、血漿接種細(xì)胞等均需無(wú)菌操作，而熒光定量RT-PCR 操作相對(duì)簡(jiǎn)便，能夠使雞場(chǎng)及時(shí)發(fā)現(xiàn)隱性感染雞，盡早淘汰患病母雞，從而減少經(jīng)濟(jì)損失；其次，由于REV 接種DF-1 細(xì)胞并不能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，因此需要結(jié)合IFA才能完成對(duì)REV 的檢測(cè)，導(dǎo)致傳統(tǒng)的病毒分離方法容易受到IFA 試驗(yàn)中單抗及二抗質(zhì)量的影響，而熒光定量RT-PCR 只需通過(guò)特定引物或探針對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，可明確檢出結(jié)果，避免漏檢；最后，熒光定量RT-PCR 可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，極大提高了檢測(cè)效率。

試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，對(duì)糞便進(jìn)行REV 核酸檢測(cè)雖然可以簡(jiǎn)便而有效檢出感染和攜帶REV的雞，但檢出率低于血液，造成糞便檢出率較低的原因一部分可能是由于血漿從分離到接種一直是無(wú)菌操作，而糞便樣本相比于血漿成分復(fù)雜，必須使用濾器過(guò)濾后才可接種細(xì)胞，且溫度對(duì)REV 的影響較大，糞便樣本無(wú)菌處理極有可能導(dǎo)致部分病毒死亡，因此在實(shí)施凈化時(shí)要結(jié)合血液檢測(cè)才能更好地全面檢出所有感染的雛雞。

綜上，本研究在構(gòu)建了REV 垂直傳播感染模型基礎(chǔ)上，比較了病毒分離、RT-PCR 和熒光定量RT-PCR 對(duì)各時(shí)間點(diǎn)血液和胎糞/泄殖腔棉拭子樣品的REV 陽(yáng)性檢出率，這些規(guī)律為未來(lái)制定科學(xué)的種雞REV 凈化程序奠定了基礎(chǔ)。