雞傳染性法氏囊病病毒VP5 的原核表達(dá)、多抗制備及初步應(yīng)用

韓金澤，牛鑫鑫，王國棟，葛成菲，張玉龍，黃萌萌，許萌萌，于航博，劉潤杭，韓京哲，吳子文，于曉雪，高玉龍，李留安，祁小樂

（1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300392；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，動物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽免疫抑制病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱 150069；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，世界動物衛(wèi)生組織傳染性法氏囊病參考實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069）

傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種主要危害雛雞的急性傳染病。IBDV 的主要靶器官是雞的中樞免疫器官法氏囊，可導(dǎo)致法氏囊的急性損傷和B淋巴細(xì)胞的壞死、崩解，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。IBDV 屬于雙RNA 病毒科（Birnaviridae）禽雙RNA 病毒屬（Avibirnavirus），其基因組由A 和B 兩個(gè)雙股RNA 節(jié)段組成，其中A 節(jié)段編碼VP2、VP3、VP4、VP5 蛋白，B 節(jié)段編碼VPl 蛋白[3-4]。

在IBDV 編碼的5 個(gè)蛋白中，VP5 是最后一個(gè)被鑒定的蛋白，它是由病毒基因組A 節(jié)段的一個(gè)獨(dú)立讀碼框編碼的，分子質(zhì)量大小約17 kDa，屬于病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白[5]。VP5 蛋白也是一個(gè)毒力因子，其在病毒復(fù)制早期抑制細(xì)胞凋亡，而在病毒復(fù)制晚期促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6-8]。研究[9-12]還發(fā)現(xiàn)，VP5 是病毒復(fù)制非必需蛋白，因此利用反向遺傳操作技術(shù)可拯救出VP5基因缺失的IBDV。作為一個(gè)多功能蛋白，VP5 的更多生物學(xué)功能尚待鑒定，其分子機(jī)制尚待挖掘。本試驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了IBDV 超強(qiáng)毒株（vvIBDV）中的優(yōu)勢流行毒株VP5 蛋白，用鎳柱純化了呈可溶性表達(dá)形態(tài)的重組VP5 蛋白，用BALB/c 小鼠制備了鼠源VP5 多抗，并進(jìn)行了初步應(yīng)用，為深入探究VP5 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體和細(xì)胞 IBDV rHLJ0504-HT株及其VP5基因缺失株rHLJ0504-HT-KOVP5，由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病團(tuán)隊(duì)（簡稱本實(shí)驗(yàn)室）制備。原核表達(dá)載體pCold-I、真核表達(dá)載體pCAGGS、重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HLJ0504-VP5（將IBDVVP5基因克隆入pCAGGS 中）、DF-1 細(xì)胞，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。E.coliBL21（DE3）工程菌，購自于寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRI 和XhoI，為TaKaRa 公司產(chǎn)品；His 標(biāo)簽蛋白純化樹脂Ni瓊脂糖凝膠，購自Cytiva 公司；抗β-actin 標(biāo)簽的抗體、HRP 標(biāo)記的兔抗鼠IgG、FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體、弗氏佐劑、脫脂奶粉、IPTG，為Sigma 公司產(chǎn)品；山羊抗小鼠IgG（IRDye800CW標(biāo)記），為LiCor Bio-Sciences 公司產(chǎn)品；His 標(biāo)簽抗體為上海仝元生物科技有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化氫酶DAB 顯色試劑盒（超敏型）為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；PageRuler 預(yù)染蛋白Marker 26616，為Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；DNA Marker（DL 2000）、DNA 聚合酶Mix、同源重組試劑盒，為諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；IBDV VP1 蛋白單克隆抗體，由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存；膠回收試劑盒，為Omega 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒中提試劑盒，為 QIAGEN 公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑TransIT-X2?Dynamic Delivery System，為Mirusbio公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)染色液，為索來寶公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜、臺式低溫高速離心機(jī)，為Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；PCR 儀，為TaKaRa 公司產(chǎn)品；組織研磨儀，為Retsch 公司產(chǎn)品；超微量分光光度計(jì)，為Implen 公司產(chǎn)品；凝膠電泳儀，為北京六一儀器廠產(chǎn)品；Odyssey 紅外掃描儀，為Licor 公司產(chǎn)品；ELISA 酶標(biāo)板，為Costar 公司產(chǎn)品；全自動酶標(biāo)儀，為BioTek 公司產(chǎn)品；超聲細(xì)胞破碎儀，為SONICS 公司產(chǎn)品。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物 6 周齡雌性BALB/c 小鼠，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1VP5基因擴(kuò)增和原核表達(dá)載體構(gòu)建參 考IBDV HLJ0504 株 基 因 組（GenBank 號GQ451330），設(shè)計(jì)VP5基因特異性引物（上游引物pCold 1-VP5-F：5'-atggagctcggtaccctcgagGTTAGTAGAGATCAGACAAACGATCGC-3'；下游引物pCold 1-VP5-R：5'-caggtcgacaagcttgaattcTCACTCAGGCTTCCTTGGAAGG-3'），送睿博興科生物技術(shù)（哈爾濱）有限公司合成。以rHLJ0504-HT株為模板，通過RT-PCR 進(jìn)行VP5基因擴(kuò)增。按常規(guī)方法提取病毒RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：DNA 聚合酶Mix 25 μL、cDNA 1 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的片段回收。以EcoRI和XhoI 為酶切位點(diǎn)線性化pCold I 載體，將膠回收的目的片段與pCold I 空載體，在37 ℃利用同源同組試劑盒進(jìn)行同源重組。將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21（DE3），12 h 后從LB 固體培養(yǎng)基（氨芐抗性）上挑取單克隆菌落，通過菌液PCR 篩選陽性克隆，并將陽性克隆送睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將鑒定正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pCold-HLJ-VP5。

1.2.2 VP5 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 首先將重組質(zhì)粒pCold-HLJ-VP5 轉(zhuǎn)化工程菌E.coliBL21（DE3），12 h 后挑單菌落接種到5 mL 氨芐抗性的LB 培養(yǎng)液中，于200 r/min 37 ℃過夜培養(yǎng)；次日，將過夜培養(yǎng)的菌種以1:100 接種于1 L 氨芐抗性的LB 中，200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)；待OD 值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，150 r/min 20 ℃振蕩培養(yǎng)，22 h 后、10 000g/min 室溫離心10 min 收集菌體，并用超聲細(xì)胞破碎儀破碎菌體，12 000g/min 室溫離心10 min。離心后分離回收沉淀和上清，進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）。

1.2.3 VP5 蛋白純化和鑒定 將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行裂解，用His 標(biāo)簽蛋白純化樹脂Ni 瓊脂糖凝膠作為填料，純化目的蛋白。通過考馬斯亮藍(lán)染色法檢驗(yàn)洗脫液洗脫效率，選用50、100、150、200、250、300 mmol/L 咪唑進(jìn)行蛋白洗脫的最佳條件摸索。利用摸索得到的最佳洗脫條件洗脫目的蛋白，最后使用超微量分光光度計(jì)檢測純化后蛋白濃度。將純化的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定，然后用His 標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western Blot 鑒定。Western Blot 鑒定過程：將轉(zhuǎn)印有VP5 的硝酸纖維素膜（NC 膜）用5%的脫脂乳于4 ℃封閉過夜，用PBST 緩沖液洗滌3 次，5 min/次；加入按1:1 000 稀釋的His 標(biāo)簽抗體，室溫孵育1.5 h；用PBST 洗滌3 次，5 min/次；加入1:20 000 稀釋的抗鼠熒光二抗，于室溫孵育50 min；用PBST 洗滌3 次，5 min/ 次；最后在Odyssey 紅外掃描儀下鑒定表達(dá)情況。

1.2.4 VP5 鼠源多抗制備 將純化的重組VP5 蛋白與等體積弗氏佐劑混勻乳化（首次免疫用弗氏完全佐劑，此后均用弗氏不完全佐劑）。首次免疫以200 μg/只的劑量通過腹腔注射方式免疫小鼠，間隔14 d 進(jìn)行下一次免疫，共免疫5 次。每次免疫后7 d，使用間接ELISA 方法測定血清抗體效價(jià)，在效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后采集小鼠血液并分離血清，作為VP5 蛋白的多克隆抗體（多抗）血清。間接ELISA 檢測過程：用碳酸鹽包被液稀釋VP5 蛋白至質(zhì)量濃度1.3 μg/mL 時(shí)包被ELISA 板，4 ℃過夜孵育，PBST 洗板5 次；每孔加入200 μL 5%脫脂乳封閉液，37 ℃下孵育1 h，PBST 洗板5 次；每孔加入100 μL 稀釋的待檢血清樣品，37 ℃下孵育30 min，PBST 洗板5 次；每孔加入100 μL 稀釋的HRP-兔抗雞抗體IgG，37 ℃下孵育30 min，PBST 洗板5 次；每孔加入100 μL TMB 底物顯色液，作用15 min；每孔加入100 μL 終止液終止反應(yīng)，用全自動酶標(biāo)儀測定吸光值OD450。

1.2.5 VP5 多抗鑒定

1.2.5.1 VP5 多抗的間接免疫熒光法（IFA）檢測 將DF-1 細(xì)胞培養(yǎng)于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，在TransIT-X2 轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HLJ0504-VP5 和空質(zhì)粒pCAGGS，均1 μg/孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30 h；棄掉培養(yǎng)液，用PBS 洗滌3 次；加入4%的多聚甲醛，于4 ℃固定細(xì)胞30 min；PBS 洗滌3 次后用5%的脫脂乳于37 ℃溫箱封閉1 h；將1:200 稀釋的VP5多抗加入細(xì)胞單層，于37 ℃濕盒孵育1 h；PBS 洗滌3 次，加入1:200 稀釋的FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體，37 ℃孵育1 h；PBS 洗滌3 次，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5.2 VP5 多抗Western Blot 鑒定 將重組蛋白VP5 進(jìn)行SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)印至NC 膜上，用VP5 多抗通過Western Blot 進(jìn)行檢測。

1.2.6 VP5 多抗初步應(yīng)用 通過IFA 和Western Blot 檢測，用VP5 多抗對rHLJ0504-HT 株及其VP5基因缺失株rHLJ0504-HT-KOVP5 進(jìn)行鑒別檢測。

1.2.6.1 IFA 檢測 將r H L J 0 5 0 4-H T 株和rHLJ0504-HT-KOVP5 株分別感染飼養(yǎng)于12 孔板的70%匯合度的DF-1 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對照細(xì)胞。病毒感染后24 h，用VP5 多抗進(jìn)行IFA 檢測。

1.2.6.2 Western Blot 檢測 將1.2.6.1 收集的細(xì)胞樣品用VP5 多抗進(jìn)行Western Blot 檢測。同時(shí)，采用β-actin 抗體、IBDV VP1 單抗對樣品進(jìn)行Western Blot 檢測。

2 結(jié)果

2.1 VP5 基因擴(kuò)增及原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

通過RT-PCR 擴(kuò)增獲得了IBDV HLJ054 株的VP5基因，擴(kuò)增片段長435 bp（圖1）。測序結(jié)果顯示，克隆有IBDV HLJ0504 株VP5基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pCold-HLJ-VP5 構(gòu)建正確。

圖1 IBDV VP5 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 VP5 重組蛋白表達(dá)

SDS-PAGE 鑒定結(jié)果顯示，VP5 蛋白主要以上清形式可溶性表達(dá)（分子質(zhì)量約17 kDa），在菌體沉淀（包涵體形式）中量較少（圖2）。

圖2 重組VP5 蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果

2.3 VP5 重組蛋白純化

SDS-PAGE 鑒定結(jié)果顯示，表達(dá)的重組VP5蛋白在200 mmol/L 咪唑洗脫條件下獲得了良好純化（圖2）。經(jīng)測定，該蛋白的質(zhì)量濃度為850 ng/μL。

2.4 VP5 重組蛋白鑒定

對純化后的表達(dá)蛋白進(jìn)行Western Blot 鑒定。結(jié)果（圖3）顯示，在約17 kDa 處出現(xiàn)清晰的特異條帶，說明所表達(dá)和純化的VP5 重組蛋白與His標(biāo)簽抗體可以發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖3 His 標(biāo)簽抗體介導(dǎo)的重組VP5 蛋白Western Blot 鑒定結(jié)果

2.5 VP5 多抗制備

用包被VP5 的ELISA 檢測VP5 多抗效價(jià)，將多抗樣品孔OD450與陰性對照孔比值（P/N）＞2.1 時(shí)的多抗樣品最高稀釋度作為VP5 多抗效價(jià)。結(jié)果（圖4）顯示，VP5 多抗效價(jià)可達(dá)1:64 000。

圖4 免疫小鼠血清中VP5 多抗效價(jià)ELISA 測定結(jié)果

2.6 VP5 多抗鑒定

2.6.1 IFA 檢測 檢測結(jié)果（圖5）顯示，重組真核表達(dá)載體pCAGGS-HLJ0504-VP5 轉(zhuǎn)染組的DF-1細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的紅色熒光，而pCAGGS 空載體對照組細(xì)胞沒有熒光，說明所制備的VP5 多抗能夠通過IFA 特異性識別IBDV 的VP5 蛋白。

圖5 IBDV VP5 多抗的IFA 鑒定結(jié)果

2.6.2 Western Blot 檢測 檢測結(jié)果（圖6）顯示，重組真核表達(dá)載體pCAGGS-HLJ0504-VP5 轉(zhuǎn)染組可見約17 kDa 的條帶，而pCAGGS 空載體對照組無該條帶，且兩組樣品均可檢測到細(xì)胞β-actin，說明所制備的VP5 多抗能夠通過Western Blot 特異性識別IBDV 的VP5 蛋白。

圖6 IBDV VP5 多抗的Western Blot 鑒定結(jié)果

2.7 VP5 多抗初步應(yīng)用

2.7.1 IFA 檢測 對分別感染rHLJ0504-HT 株和rHLJ0504-HT-KOVP5 株的DF-1 細(xì)胞用VP5 多抗進(jìn)行IFA 檢測。結(jié)果（圖7）顯示，rHLJ0504-HT感染組呈現(xiàn)特異性的紅色熒光，而不表達(dá)VP5 的rHLJ0504-HT-KOVP5 感染組以及空白細(xì)胞對照組沒有熒光，說明本研究所制備的VP5 多抗可用于通過IFA 鑒別IBDV 及其VP5基因缺失毒株。

圖7 VP5 多抗對IBDV 不同毒株的IFA 檢測結(jié)果

2.7.2 Western Blot 檢測 對分別感染rHLJ0504-HT 株和rHLJ0504-HT-KOVP5 株的DF-1 細(xì)胞進(jìn)行Western Blot 檢測。如圖8 所示：基于β-actin 抗體的Western Blot 結(jié)果顯示，2 個(gè)IBDV 感染組和空白細(xì)胞對照組均能檢測到約43 kDa 的β-actin，說明3 個(gè)組均有細(xì)胞樣品?；贗BDV VP1 單抗的Western Blot 結(jié)果顯示，2 個(gè)IBDV 感染組均能檢測到約97 kDa 的VP1 蛋白，說明2 個(gè)感染組均成功感染了IBDV?；赩P5 多抗的Western Blot 結(jié)果顯示，rHLJ0504-HT 感染組可檢測到約17 kDa 的VP5 條帶，而不表達(dá)VP5 的rHLJ0504-HT-KOVP5 感染組以及空白細(xì)胞對照組無VP5 條帶，說明本研究所制備的VP5 多抗可用于通過Western Blot 鑒別IBDV 及其VP5基因缺失毒株。

圖8 VP5 多抗對IBDV 不同毒株的Western Blot 檢測結(jié)果

3 討論

IBDV VP5 雖然是一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，但它在IBDV 的生命過程中發(fā)揮著重要作用，其分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步被揭示。IBDV 不同毒力毒株由于使用不同的起始密碼子而編碼出的VP5 蛋白長度不同，這是否影響病毒的生物學(xué)功能，也需要更深入地探索。另外，VP5基因是IBDV 唯一可以缺失的基因，因而IBDV 反向遺傳研究系統(tǒng)的建立也使得IBDVVP5基因缺失毒株的拯救成為可能[9，13]。與親本毒株相比，VP5缺失毒株雖然復(fù)制有延遲，但其致病力也顯著下降，所以非結(jié)構(gòu)蛋白VP5 的缺失是IBDV 新型疫苗研究的一個(gè)重要思路[9-12]。VP5缺失毒株不會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生VP5 抗體，如果這種疫苗與VP5 抗體ELISA 檢測試劑盒相配合，將能夠?qū)崿F(xiàn)疫苗免疫與野毒感染的鑒別檢測，具有重要意義。

正是基于以上考慮，本試驗(yàn)開展了vvIBDV 優(yōu)勢流行毒株VP5 蛋白表達(dá)及VP5 多抗制備的研究。本研究利用大腸桿菌BL21 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化了融合了His 標(biāo)簽的vvIBDV 優(yōu)勢流行毒株的VP5蛋白。本研究最初曾嘗試使用pGEX 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBDV VP5 蛋白，但獲得的可溶性VP5 蛋白量很低。后經(jīng)過摸索，最終應(yīng)用pCold 表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了VP5 蛋白，試驗(yàn)過程中對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等表達(dá)條件對重組蛋白表達(dá)量的影響進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)采用20 ℃、IPTG 終濃度為1 mmol/L 的條件誘導(dǎo)22 h 后，所獲得的蛋白表達(dá)量最高。對菌體超聲波裂解物的SDS-PAGE 分析表明，VP5蛋白大部分表達(dá)于超聲破碎的菌體上清，在菌體沉淀中表達(dá)量極低，說明重組VP5 蛋白大部分以可溶性狀態(tài)表達(dá)，僅有少量蛋白以包涵體形式存在。包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)形成的一種由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒。當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)速度過快時(shí)，沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對，從而導(dǎo)致過多的蛋白間非特異性結(jié)合，進(jìn)而造成蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度，而以包涵體形式存在。包涵體蛋白不可溶，不利于后期的蛋白純化和應(yīng)用。重組蛋白的可溶性表達(dá)有利于蛋白天然構(gòu)象的維持，而且也利于后續(xù)的純化和高通量制備。應(yīng)用鎳柱，使用50 mmol/L 咪唑作為洗雜液最大程度洗脫雜質(zhì)，再經(jīng)200 mmol/L咪唑洗脫的重組VP5 蛋白純度可達(dá)90%以上。用BALB/c 小鼠制備的鼠源VP5 多抗的ELISA 效價(jià)可達(dá)1:64 000，說明本試驗(yàn)應(yīng)用pCold-I 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組VP5 蛋白具有良好的免疫原性，免疫BALB/c 小鼠后產(chǎn)生了高滴度抗體。IFA 和Western Blot 結(jié)果顯示，本研究制備的VP5 多抗不僅可特異性地識別VP5 蛋白，而且可對IBDV 及其VP5缺失毒株進(jìn)行鑒別檢測。

綜上，本研究建立了一種基于原核表達(dá)系統(tǒng)的IBDV VP5 蛋白可溶性表達(dá)和制備的方法，并制備了特異性良好的鼠源VP5 多抗；制備的VP5 蛋白可用于進(jìn)一步研制IBDV VP5 抗體ELISA 檢測方法；制備的VP5 多抗為IBDV 基因功能和新型疫苗研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。