豬肺炎支原體SYBR Green I 實時熒光定量PCR 檢測方法的建立與應(yīng)用

閆 微，楊 柳，龍云志，宋文博，李倩倩，余道兵，周明光，徐高原，黃 超，湯細(xì)彪

（武漢科前生物股份有限公司，湖北武漢 430070）

豬支原體肺炎又稱豬喘氣病或豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）引起的一種接觸性慢性呼吸系統(tǒng)傳染病[1]。豬支原體肺炎病豬常見的臨床癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、食欲減退、飼料轉(zhuǎn)化率低等。Mhp通常不引起豬死亡，但一旦感染豬群，就很難被徹底清除，將持續(xù)影響豬的生長發(fā)育[2]。此外，Mhp常與其他病毒或細(xì)菌發(fā)生混合感染引起豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（porcine respiration disease complex，PRDC），嚴(yán)重影響豬群出欄率[3]。目前，Mhp 在豬場呈普遍流行趨勢，給生豬養(yǎng)殖帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。據(jù)報道[5]，全世界家豬群中的Mhp 平均感染率為30%～80%，發(fā)病率在40%以上[6]。宋志強等[7]對我國26 個省份2016—2019 年的35 995頭肥豬進(jìn)行屠宰檢查，發(fā)現(xiàn)Mhp 平均陽性率為67%，并估算出我國養(yǎng)豬業(yè)在這4 年間因豬支原體肺炎產(chǎn)生的損失年均高達(dá)82.8 億元。

目前，預(yù)防和控制豬支原體肺炎的主要措施是接種疫苗，在我國主要使用滅活疫苗[8]。然而，近些年來，隨著Mhp 流行株的逐漸變異，臨床上經(jīng)常出現(xiàn)疫苗免疫效果不佳的情況。此外，滅活疫苗也存在一些缺點。比如：不同批次間的有效抗原含量相差較大，質(zhì)控檢驗困難；不同流行株間的同源性差異較大，對同源性較低流行株的保護(hù)效果不理想[9]。

滅活疫苗中的抗原含量是決定Mhp 疫苗質(zhì)量和免疫效力的關(guān)鍵因素之一。而對于Mhp 抗原含量測定，通常采用顏色改變單位（color changing units，CCU）法[10]。但傳統(tǒng)的CCU 法測定過程漫長且繁瑣，不適用于滅活疫苗生產(chǎn)及成品疫苗中的有效抗原含量測定。然而，在實際生產(chǎn)中，常常只有知道培養(yǎng)的Mhp CCU 才能確定其是否能用于疫苗制備及后續(xù)研究[11-12]。為了更快捷準(zhǔn)確獲得或快速檢測試驗生產(chǎn)及市售疫苗中Mhp 的CCU，本研究建立了一種快速高效獲取支原體CCU 的方法——SYBR Green I 熒光定量PCR 方法，為實際生產(chǎn)及臨床應(yīng)用都提供了很大便利。

1 材料和方法

1.1 菌株與病毒

Mhp ES-2 株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2018570。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、副豬嗜血桿菌4 型（HPS4）及鏈球菌2 型（SS2），均由武漢科前生物股份有限公司臨床豬病研究室分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑

2×EasyTaqPCR Super Mix（-dye）， 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；電泳使用的所有Marker、載體PMD18-T、限制性內(nèi)切酶及連接酶，均購自Takara 生物技術(shù)有限公司；凝膠電泳涉及的瓊脂糖，購自Biowest 公司；新型核酸染料Gelred、50×TAE 緩沖液，均購自Biosharp 公司；DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；支原體全基因組提取試劑盒，購自Biomiga 公司；SYBR Green Master Mix，購自諾唯贊生物科技股份技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

普通PCR 儀及熒光定量PCR 儀，均購自Bio-RAD 公司；電熱恒溫養(yǎng)箱，購自廣東泰宏君儀器有限公司。

1.4 引物及序列

本研究使用的所有引物均通過Primer 5 軟件設(shè)計，由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 最佳引物篩選

以ES-2 株全基因組為模板，用Mhp 標(biāo)準(zhǔn)引物構(gòu)建內(nèi)參質(zhì)粒。對內(nèi)參質(zhì)粒進(jìn)行10 倍倍比稀釋（做9 個稀釋度）將其作為熒光定量PCR 篩選最佳引物的模板，其中最大拷貝數(shù)濃度為4.9×109copies/μL，最小為4.9×101copies/μL，并以ddH2O 作為陰性對照。擴(kuò)增體系及程序：2×AceQ qPCR SYBR Green master mix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA模板2.0 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，最后用無菌ddH2O 補至20.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，40 個循環(huán)。溶解曲線分析從60 ℃到95 ℃。觀察并比較4種引物（SX1、SX2、SX3 和SX4）的qPCR 最低檢出模板濃度，并以此為標(biāo)準(zhǔn)篩選出最佳引物對。

1.6 引物特異性檢測

對篩選出的最佳引物分別進(jìn)行Mhp 和其他病毒（PPV、CV2 和PRV）及細(xì)菌（HPS4、SS2）的熒光定量PCR 檢測，以確定引物特異性。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將支原體按1:10 比例接種于含5 mL 液體培養(yǎng)基的西林瓶內(nèi)，靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至平臺初期；在超凈工作臺吸取100 μL 接種于含900 μL 培養(yǎng)基的西林瓶內(nèi)，進(jìn)行10 倍倍比稀釋，共計稀釋10～12 份，同時用支原體空白培養(yǎng)基作為陰性對照；在37 ℃溫箱中靜置培養(yǎng)14～21 d，肉眼觀察西林瓶變色的最大稀釋度即為支原體的CCU。將含量為1.0×108CCU/mL 的培養(yǎng)至平臺期的支原體進(jìn)行10 倍倍比稀釋，選取6 個稀釋度（10-4～10-9），每個梯度分別取200 μL 提取基因組，以此為模板并以支原體培養(yǎng)基為陰性對照，分別進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，以支原體CCU 的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的Ct 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 建立方法穩(wěn)定性檢測

選取3 份已知不同CCU 含量的樣本進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個樣本稀釋10 份，最后一管出現(xiàn)顏色改變定為1 CCU/mL，推導(dǎo)出原支原體菌液的CCU。每份支原體樣本取200 μL 提取基因組，以此基因組為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，將所得Ct 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算出對應(yīng)的CCU。比較檢測出的CCU 與計算出的CCU 之間的差異，驗證建立方法的穩(wěn)定性。

1.9 滅活與未滅活支原體Ct 值比較

對支原體使用0.01%的硫柳汞在2～8 ℃條件下滅活16 h，將滅活與未滅活的支原體分別提取基因組DNA 進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，得到Ct 值后進(jìn)行比較。

1.10 疫苗生產(chǎn)中抗原含量檢測和市售疫苗CCU測定

吸取兩份疫苗生產(chǎn)中的支原體菌液各200 μL，一份提取基因組進(jìn)行熒光定量PCR，將檢測所得Ct 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出對應(yīng)的CCU，另一份使用倍比稀釋法測定其中的CCU，然后比較兩種方法所得結(jié)果。

分別吸取4 種市售Mhp 滅活疫苗250 μL（體積比，抗原:佐劑 = 4:1）提取基因組作為實驗組，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，將檢測所得Ct 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算支原體對應(yīng)的CCU，驗證疫苗中的CCU。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳引物篩選

以ES-2 株全基因組為模板，用引物MHP-F和MHP-R 構(gòu)建內(nèi)參質(zhì)粒，對單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果見圖1。將內(nèi)參質(zhì)粒10 倍倍比稀釋9 個梯度（4.9×109～4.9×101copies/μL），并以ddH2O作為陰性對照，依據(jù)靈敏度和曲線擬合度，篩選出最佳引物，發(fā)現(xiàn)引物SX4 效果最佳，其靈敏度為4.9×101copies/μL，R2= 0.990 1（圖2）。

圖1 內(nèi)參質(zhì)粒陽性克隆鑒定結(jié)果

圖2 4 對引物的熒光定量PCR 結(jié)果及擬合曲線

2.2 引物特異性檢測

利用SX4 引物分別對Mhp、PPV、PCV2、PRV、HPS4 及SS2 進(jìn)行引物特異性檢測，結(jié)果除Mhp 外其他病原均無擴(kuò)增（圖3），說明該引物特異性良好。

圖3 引物特異性檢測結(jié)果

2.3 支原體CCU 和熒光定量Ct 值之間的相關(guān)性

提取滅活前與滅活后支原體的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，結(jié)果滅活前的Ct 值為18.23，滅活后為18.31（圖4）。由此可知，支原體在滅活前后的Ct 值基本不變，故此方法可用于市售滅活疫苗的支原體含量檢測。

圖4 滅活前后的支原體Ct 值

將抗原含量為108CCU/mL 的支原體10 倍倍比稀釋9 個梯度，選取10-4～10-9稀釋度，分別取200 μL 提取基因組，用引物SX4 進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，對每個稀釋度基因組做3 個重復(fù)，且做陰性對照，所得結(jié)果以支原體CCU 的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的Ct 平均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y= -3.658x+ 47.012，式中y為Ct 值，x為支原體CCU 的對數(shù)值，R2=0.997 2（圖5），表明標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct 值和支原體CCU 間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖5 不同CCU 支原體的熒光定量擴(kuò)增及所得Ct 值與支原體CCU 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析結(jié)果

2.4 引物穩(wěn)定性試驗

用上述建立的熒光定量PCR 方法檢測3 份（樣本A、B、C）已知CCU 的Mhp 原液（經(jīng)倍比稀釋法測定），判斷建立方法的準(zhǔn)確性。已知樣本A、B、C 的支原體抗原含量分別為108、107、106CCU/mL（圖6）。取樣本A、B、C 各200 μL 提取基因組，以此基因組為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，測定其Ct 平均值為分別為17.80、21.44、25.10（圖7），將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計算所得對應(yīng)支原體抗原含量分別為9.68×107、9.79×106、9.77×105CCU/mL（表2）。檢測結(jié)果與實際含量的變異系數(shù)分別0.016 3、0.010 6、0.011 6，說明運用該方法的Ct 值能準(zhǔn)確得出對應(yīng)Mhp 的CCU。

圖6 3 種已知樣本的抗原含量

圖7 不同CCU 支原體樣本的兩次熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.5 該方法測定工藝生產(chǎn)和市售Mhp 疫苗抗原含量

將疫苗工藝生產(chǎn)中的Mhp 菌液提取基因組DNA 進(jìn)行熒光定量檢測，結(jié)果Ct 值為14.22（圖8），將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，可得Mhp 抗原含量為9.12×108CCU/mL。采用倍比稀釋法測定抗原含量為1.0×109CCU/mL（圖9）。兩種方法所得結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線成立，可更快捷地得出對應(yīng)的CCU。

圖8 疫苗生產(chǎn)中的CCU 熒光定量測定結(jié)果

圖9 疫苗生產(chǎn)中的CCU 倍比稀釋法測定結(jié)果

選擇4 種市售Mhp 滅活疫苗，分別標(biāo)注為1～4，其疫苗瓶上標(biāo)注菌量分別為8.0×107、2.5×108、2.5×108、8.0×107CCU/mL。 通過本研究的熒光定量方法測定250 μL（體積比，抗原:佐劑 = 4:1）相應(yīng)疫苗的菌量分別為6.43×107、9.04×107、7.87×107和5.56×107CCU/mL（圖10、表3）。此方法檢測所得菌量與市售疫苗標(biāo)注菌量差異小于1 個數(shù)量級，而實際生產(chǎn)應(yīng)用中的菌量測定通常采用CCU 法，肉眼觀察誤差可達(dá)1 個數(shù)量級，因此該方法可用于實際生產(chǎn)中的菌量檢測。

圖10 用本研究方法檢驗疫苗樣品中的抗原含量結(jié)果

表3 4 種商業(yè)疫苗試驗所得菌含量與瓶標(biāo)菌量比較結(jié)果

3 討論

疫苗的免疫效果受菌（毒）株、佐劑類型等因素影響，然而病原含量即抗原含量是影響疫苗效價的關(guān)鍵因素[13-14]。疫苗的CCU 是評判疫苗質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，但是目前臨床上對市售疫苗抗原量的評估存在難點，如注射疫苗后豬體內(nèi)的Mhp 抗體含量與疫苗菌量沒有相關(guān)性，并且臨床所認(rèn)可的血清學(xué)檢測方法無法區(qū)分Mhp 抗體是來自自然感染還是疫苗免疫，不適用于個體動物的診斷，因此根據(jù)個體動物免疫后Mhp 抗體水平評定疫苗是否合格并不十分可靠[15-17]。而熒光定量PCR 檢測技術(shù)因其高敏感性和特異性在Mhp 檢測中發(fā)展迅速[18]。目前，熒光定量PCR 方法進(jìn)行Mhp 檢測的靶基因主要包括16S rRNA、P110、P97和P46[19]。丁敏[20]應(yīng)用CCU 檢測法、濁度法和熒光定量PCR 檢測方法，對Mhp 的生長曲線進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在Mhp 培養(yǎng)過程中，熒光定量PCR 檢測法與濁度法檢測結(jié)果一直高度相關(guān)，培養(yǎng)54 h 內(nèi)，熒光定量PCR 檢測法與CCU 法結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Marois 等[21]建立了以P46、P97和P102為靶基因的三重實時熒光定量PCR 方法，將其用于檢測誘發(fā)SPF 豬支原體肺炎的Mhp 最小菌量。本研究建立了一種熒光定量檢測Mhp 菌量的方法，可通過熒光定量檢測Ct 值計算出抗原含量，與現(xiàn)有評估手段相比簡化了試驗流程[22]，有助于提高生產(chǎn)中的檢測效率。

本研究首先利用Mhp 國標(biāo)引物MHP-F 和MHP-R（GB/T 35909—2018），以提取的支原體全基因組為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將回收的PCR 產(chǎn)物與T 載體（PMD18-T）直接連接，轉(zhuǎn)化至DH5α后涂于相應(yīng)抗性平板，篩選陽性克隆后將測序正確的質(zhì)粒作為內(nèi)參質(zhì)粒。根據(jù)支原體國標(biāo)引物所擴(kuò)片段序列設(shè)計4 對熒光定量特異性引物，通過靈敏度和擴(kuò)增曲線擬合度篩查出引物SX4 敏感性最佳，為4.9×101copies/μL。通過特異性檢測，發(fā)現(xiàn)引物SX4 對PPV、PCV2、PRV、HPS4 及SS2 都沒有擴(kuò)增，說明引物SX4 特異性良好。繪制該引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct 值和支原體CCU 間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。通過檢測培養(yǎng)至不同狀態(tài)的Mhp 含量發(fā)現(xiàn)，該方法與傳統(tǒng)CCU 方法相比較，其CCU 數(shù)值是一致的，也驗證了本研究建立方法的可行性與準(zhǔn)確性。

基于Mhp 疫苗生產(chǎn)和臨床使用實際，本研究利用該方法檢測Mhp 疫苗生產(chǎn)過程及市售疫苗中的菌量，證實此方法可以作為疫苗生產(chǎn)過程中的菌量檢測方法，并可節(jié)省人力、物力和時間成本。在市售疫苗菌量檢測中，該方法測得數(shù)據(jù)與說明書標(biāo)注數(shù)據(jù)差異均小于1 個數(shù)量級，但其中一份市售疫苗的檢測菌量與標(biāo)注菌量相差較大（較標(biāo)注菌量低約2.2倍），除懷疑該疫苗的標(biāo)注菌量與實際不符外，也說明在后續(xù)研究中需對該檢測方法進(jìn)一步優(yōu)化。