副豬嗜血桿菌AfuA-ELISA 抗體檢測方法的建立與應(yīng)用

李真亞，趙曉康，楊紅玉，李 允，孔嫄嫄，賈榮玲，李生濤

（南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南南陽 473000）

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）是屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的一種革蘭氏陰性菌，是豬呼吸道疾病的一種病原體[1-2]。它能定殖于健康豬的上呼吸道，是豬常見的呼吸道共生菌[3-4]。在發(fā)病情況下，HPS 可導(dǎo)致以多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎為特征的豬Glasser's 病[5-7]。該病主要發(fā)生于5～8 周齡仔豬。目前，副豬嗜血桿菌病已在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。

豬副豬嗜血桿菌病傳統(tǒng)的診斷方法主要包括病死豬尸體剖解和細(xì)菌分離鑒定。然而，由于HPS生長高度依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）且對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，其體外培養(yǎng)非常困難。HPS 分離過程易受其他細(xì)菌污染[10-11]，故從臨床病料中成功分離該菌的概率很低。HPS的表型容易發(fā)生變異，傳統(tǒng)的診斷方法常常導(dǎo)致分型錯誤[12]。上述因素限制了傳統(tǒng)診斷方法的臨床應(yīng)用，為此許多基于血清學(xué)的新型診斷方法相繼被建立。臨床試驗(yàn)[11，13]表明，基于HPS 全菌蛋白建立的血清學(xué)方法存在靈敏度和特異性較差等缺點(diǎn)。此外，目前市場上暫無針對該病的國產(chǎn)商業(yè)化ELISA 試劑盒，而進(jìn)口試劑盒價格昂貴，無法滿足大批量檢測需求。因此，亟需建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高且能大規(guī)模應(yīng)用的血清學(xué)診斷方法[13-15]。

HbpA、AfuA 是HPS 具有免疫原性的2 個蛋白[16-17]。目前，基于HbpA、AfuA 蛋白建立的ELISA 診斷方法未見報道。本研究擬克隆相關(guān)基因并表達(dá)HbpA、AfuA 重組蛋白，以這兩種蛋白分別作為ELISA 包被抗原，篩選建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的HPS ELISA 診斷方法，以期用于HPS 抗體檢測和疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、血清 HPS SH0165 菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)載體pET-28a 以及克隆菌株E.coilDH5α 和BL21，購自TaKaRa 公司；從豬場采集的臨床血清以及HPS 陽性、陰性血清，均由本實(shí)驗(yàn)室采集制備；豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬鏈球菌（SS）、豬傳染性胸膜肺炎桿菌（APP）、豬肺炎支原體（Mhp）陽性血清，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春課題組贈送。

1.1.2 主要試劑及儀器 常用的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、IPTG、瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液、SDS-PAGE 蛋白膠Marker、DNA 電泳Marker、Probest DNA 聚合酶等，均購自TaKaRa公司；DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠快速回收試劑盒，購自O(shè)MEGA 公司；羊抗豬二抗、顯色液及終止液，均來自武漢科前生物股份有限公司；進(jìn)口HPS 間接ELISA 試劑盒（簡稱商業(yè)化試劑盒），購自加拿大Biovet 公司；過硫酸銨、TEMED、聚丙烯酰胺，購自BIOSHARP公司。

1.1.3 引物 以HPS SH0165 菌株（GenBank 登錄號CP001321.1）為參考菌株，從NCBI 上獲取其HbpA、AfuA基因序列，運(yùn)用Primer 5.0 軟件對其全長基因進(jìn)行引物設(shè)計，引物均由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 PCR 擴(kuò)增所用引物序列

1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

以SH0165 株基因組為模板，對HbpA、AfuA基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)28 次；最后72 ℃延伸10 min。對回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-28a 載體進(jìn)行雙酶切，以T4 DNA 連接酶連接酶切產(chǎn)物，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，然后均勻涂布于含有卡那霉素（50 ng/μL）的LB平板，最后以PCR 和酶切分別鑒定重組質(zhì)粒，將陽性克隆送測序。

1.3 重組蛋白表達(dá)與純化

將經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a-HbpA、pET28a-AfuA分別轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取單個菌落于37 ℃過夜培養(yǎng)；待菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm約為0.6～1.0 時，加入IPTG（0.1 mmol/L）37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3.5～4.0 h；誘導(dǎo)結(jié)束后，10 000 r/min，離心5 min，將菌體沉淀以PBS洗滌3 次，最后用PBS 重懸；以1 000 bar 高壓破碎菌液2～3 次至其澄清明亮，將破碎后的菌液在4 ℃下離心5 min（10 000 r/min），棄上清，獲得包涵體沉淀。

依次使用不同濃度（2、4、6 mol/L）的咪唑?qū)Πw沉淀進(jìn)行重懸，隨后將重懸液4 ℃10 000 r/min，離心5 min，收集上清進(jìn)行SDSPAGE 電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，收集純化后的重組蛋白（rHbpA、rAfuA），使用BCA 試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度，于-80 ℃凍存。

1.4 間接ELISA 抗原選擇

分別以2 μg/mL 的rHbpA 和rAfuA 蛋白包被酶標(biāo)板，對30 份陰陽性參考血清進(jìn)行檢測，選取效果最佳的蛋白。間接ELISA 按照常規(guī)方法操作[13-14]。

1.5 AfuA 間接ELISA（AfuA-ELISA）方法建立

采用矩陣滴定試驗(yàn)方法，優(yōu)化抗原包被質(zhì)量濃度、最佳封閉液、樣品稀釋度、最佳樣品稀釋液、樣品反應(yīng)時間、二抗稀釋液、二抗工作濃度、二抗反應(yīng)時間和底物反應(yīng)時間等，根據(jù)OD 值和P/N值建立間接ELISA 方法。

統(tǒng)計以試制的AfuA-ELISA 抗體檢測試劑盒檢測60 份陰性血清的結(jié)果，采用陰性樣品平均值±3 標(biāo)準(zhǔn)差法（X± 3SD），確定ELISA 抗體檢測方法的陰陽性臨界值。

1.6 特異性與敏感性試驗(yàn)

選擇CSFV、PRRSV、PRV、SS、APP、Mhp陽性血清進(jìn)行間接ELISA 試驗(yàn)，評估本方法的特異性。將HPS 陽性血清按照1:20、1:40、1:80、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 000 等8 個稀釋度進(jìn)行稀釋，以AfuA-ELISA 方法進(jìn)行檢測，評估其敏感性。

1.7 臨床血清檢測及其與商業(yè)化試劑盒比較

以本研究建立的AfuA-ELISA 方法和商業(yè)化試劑盒，分別檢測300 份臨床血清，比較二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

經(jīng)PCR 擴(kuò)增，獲得了與HbpA、AfuA基因預(yù)期大小一致的目的片段，在電泳圖中可見大小分別為1 596、1 041 bp 的目的條帶（圖1-A）。對獲得的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)PET28a-HbpA 質(zhì)粒雙酶切后獲得了約5 000 和1 596 bp 的2 條條帶，PET28a-AfuA 質(zhì)粒酶切后獲得了約5 000 和1 401 bp 的2 條條帶（圖1-B）。

圖1 HbpA、AfuA 基因PCR 擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

2.2 重組蛋白表達(dá)及純化

SDS-PAGE 分析結(jié)果（圖2）顯示，成功表達(dá)出rHbpA、rAfuA 重組蛋白。在37 ℃條件下，以0.8 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)菌液4～5 h 后，2種重組蛋白均以包涵體形式存在于超聲破碎后的沉淀中；經(jīng)純化，獲得了與預(yù)期大小一致的目的蛋白，分別為59、38 kD。

圖2 HbpA、AfuA 重組蛋白表達(dá)及純化結(jié)果

2.3 最優(yōu)包被蛋白確定

分別使用2 μg/mL 的rHbpA、rAfuA 重組蛋白包被酶標(biāo)板，對30 份陰陽性參考血清進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖3）顯示，以rAfuA 作為包被蛋白時，OD630nm檢測值可以明顯區(qū)分出陰陽性血清，而rHbpA 不可以。因此，選擇rAfuA 重組蛋白作為間接ELISA 包被抗原。

圖3 最優(yōu)包被抗原篩選結(jié)果

2.4 AfuA-ELISA 方法建立

以rAfuA 蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行條件優(yōu)化，根據(jù)OD630nm和P/N值確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度為5 μg/mL，最佳封閉液為5%脫脂乳溶液，最佳樣品稀釋液為2% BSA 溶液，最佳樣品孵育時間為30 min，最佳樣品稀釋度為1:25，最佳酶標(biāo)二抗稀釋度為1:20 000，最佳酶標(biāo)二抗孵育時間為30 min，最佳底物孵育時間為10 min。

根據(jù)已優(yōu)化的條件，對60 份陰性血清進(jìn)行檢測。陰性樣品的X± 3SD 計算為0.35，選擇該OD 值作為臨界值，即當(dāng)OD630nm≥0.35 時，判定為HPS 抗體陽性，當(dāng)OD630nm＜0.35 時，判定為HPS 抗體陰性。

2.5 特異性、敏感性試驗(yàn)

以CSFV、PRRSV、PRV、SS、APP、Mhp 陽性血清作為待檢血清，使用AfuA-ELISA 方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)6 種血清均被檢測為HPS 陰性（圖4），提示該方法特異性良好。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清以1:400稀釋時，仍可被檢測為陽性，表明本試劑盒敏感性較高。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床血清檢測

使用本研究建立的AfuA-ELISA 方法與商業(yè)化試劑盒，分別對300 份臨床樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果（表2）顯示，AfuA-ELISA 方法檢出陽性血清177 份，商業(yè)化試劑盒檢出陽性血清180 份，陽性符合率為90.0%（162/180）；AfuA-ELISA 方法檢出陰性血清123 份，商業(yè)化試劑盒檢出陰性血清120 份，陰性符合率為87.5%（105/120），二者總體符合率為89.0%（267/300）。

表2 AfuA-ELISA 方法與商業(yè)化試劑盒符合率比較結(jié)果單位：份

3 討論

3.1 HPS 血清學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

基于抗體和抗原相結(jié)合的血清學(xué)診斷方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，能高通量操作的優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷方面扮演著重要角色。目前，針對HPS的血清學(xué)診斷方法主要包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT），間接血凝試驗(yàn)（IHA）和ELISA。采用CFT 方法，HPS 感染抗體在急性期（1 周內(nèi)）可以被檢測到，但是其在HPS 多種血清型之間具有交叉反應(yīng)[18]。Takahashi 等[19]運(yùn)用CFT 評估疫苗免疫后血清抗體的效價情況，但沒有評估其交叉反應(yīng)性。IHA 中，以HPS 菌體超聲破碎后的上清或者煮沸裂解的菌體作為包被抗原，吸附于綿羊紅細(xì)胞上檢測特異性抗體。但是利用該方法檢測豬免疫抗體時，仍然出現(xiàn)陰性結(jié)果，因此其不能作為豬免疫抗體的檢測方法[20]。傳統(tǒng)的HPS ELISA 方法主要以細(xì)菌莢膜、多糖以及破碎的全菌菌體作為包被抗原。劉娜等[21]報道稱莢膜和脂多糖是細(xì)菌中最為保守的成分，但是傳統(tǒng)HPS ELISA 方法大多面臨特異性低的問題，其在臨床檢測中假陽性很高。隨著對HPS病原學(xué)研究的不斷深入，許多新的、關(guān)鍵的保守毒力因子被發(fā)現(xiàn)?；谶@些毒力因子衍生出兩個研究方向：一是構(gòu)建HPS 弱毒疫苗，二是建立基于這些毒力基因的診斷方法。例如：陳善真等[22]建立了基于Omp5 蛋白的ELISA 方法；朱曉凱[23]運(yùn)用雙向電泳的方法對HPS 外膜蛋白進(jìn)行篩選，獲得了特異性強(qiáng)的D15 蛋白，并建立了基于D15 蛋白的ELISA 方法，其具有良好的特異性和靈敏度，與臨床陽性樣本的總體符合率達(dá)到88.3%；朱曉明等[24]建立了基于超氧化物歧化酶蛋白（MSD）的ELISA 方法；王雷[25]建立了基于Omp5、CDTA、CDTB、CDTC 4 種混合蛋白的ELISA 方法。然而，這些已經(jīng)報道建立的ELISA方法還未商業(yè)化應(yīng)用，不能滿足HPS 檢測的臨床需求。

3.2 AfuA-ELISA 檢測方法的建立

目前已建立的ELISA 方法多采用細(xì)菌脂多糖和外膜蛋白作為包被抗原，但是試驗(yàn)證明脂多糖和外膜蛋白均易與其他細(xì)菌血清發(fā)生交叉反應(yīng)。OppA 蛋白作為ABC 傳輸器家族的主要成員，是具有免疫原性的保守蛋白[26-29]。車勇良等[30]建立了基于OppA 蛋白的ELISA 方法，其具有良好的靈敏度和特異性。本試驗(yàn)前期克隆表達(dá)了OppA蛋白，在進(jìn)行最優(yōu)蛋白篩選時，發(fā)現(xiàn)其免疫原性略低于細(xì)胞毒性膨脹蛋白B（CdtB），因此其作為ELISA 診斷靶標(biāo)的成熟性還需要進(jìn)一步研究。CdtB 也是HPS 重要的免疫原性蛋白和毒力因子，劉雙紅[31]、Elwell 等[32]建立了基于CdtB 蛋白的ELISA 方法。然而，本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，CdtB-ELISA 法對大腸桿菌的檢測結(jié)果為陽性，推測可能是該方法以大腸桿菌作為CdtB 蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，CdtB 蛋白中混有大腸桿菌成分。因此當(dāng)選擇大腸桿菌作為蛋白表達(dá)系統(tǒng)時，CdtB 不是最優(yōu)包被蛋白。

HbpA、AfuA 作為HPS 2 個具有免疫原性的蛋白，目前還沒有基于二者建立ELISA 方法的報道。HbpA 蛋白可以結(jié)合宿主體內(nèi)各種形式的血紅蛋白從而攝取鐵離子，維持HPS 自身存活。文心田等[17]構(gòu)建了基于HbpA 的HPS 重組亞單位疫苗，免疫后豬能產(chǎn)生高水平的HbpA 特異性抗體。張鵬云等[15]基于HbpA 建立了間接ELISA 方法，其對陰陽性血清不具有明顯的區(qū)分度，故在篩選最優(yōu)包被蛋白時將HbpA 排除，這與本研究結(jié)果一致。本研究中，分別使用2 μg/mL 的rHbpA、rAfuA 蛋白包被酶標(biāo)板，檢測30 份陰陽性參考血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rAfuA 蛋白檢測的OD630nm可明顯區(qū)分陰陽性血清，而rHbpA 不明顯，故選擇rAfuA 作為最優(yōu)包被蛋白。AfuA 作為ABC 傳輸器家族的重要成員，在維持HPS 對鐵離子的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)方面起著重要作用，是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫原性蛋白。免疫AfuA蛋白后產(chǎn)生的抗體對小鼠感染HPS 能提供有效保護(hù)[16]。以rAfuA 重組蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行條件優(yōu)化，根據(jù)OD 和P/N值確定了各項最佳反應(yīng)參數(shù)。隨后，對所建立方法的靈敏度進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋至1:400，仍可被檢測為陽性，表明其具有很高的靈敏度。在臨床應(yīng)用研究中，以AfuA-ELISA 方法對300 份臨床血清樣本進(jìn)行檢測，分別檢出陽性、陰性血清177、123 份，與商業(yè)化試劑盒陽性、陰性符合率分別為90.0%、87.5%，總體符合率為89.0%。并且，該方法對豬其他常見病原的陽性血清檢測結(jié)果也均為陰性，提示其具有較強(qiáng)的特異性。

4 結(jié)論與展望

本研究重組表達(dá)了HPS 2 個具有免疫原性的蛋白，即HbpA 和AfuA。通過對二者進(jìn)行初篩，確定將AfuA 作為最佳包被蛋白并優(yōu)化了反應(yīng)條件，建立了間接AfuA-ELISA 檢測方法。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，與商業(yè)化試劑盒符合率高，可用于臨床HPS 抗體檢測。下一步，將選擇合作豬場對試制的試劑盒進(jìn)行試用，收集臨床數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步申報新獸藥奠定基礎(chǔ)。