微流控芯片環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測3 種豬圓環(huán)病毒

石艷萍，鄧 飛，周麗媛，李 麗，邵 靚，陳 斌，張孟思，邱明雙，陳弟詩

（四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV） 屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，目前已發(fā)現(xiàn)了PCV1、PCV2、PCV3、PCV4 共4 種基因型。通常認為，PCV1 不具有致病性，PCV2 可引起多種臨床疾病，給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失，引起各國養(yǎng)豬業(yè)的高度重視。近年來，美國學者Phan 等[1]和Palinski 等[2]發(fā)現(xiàn)繁殖障礙母豬、皮炎腎炎綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）豬、心肌炎豬和多系統(tǒng)炎癥病變豬組織中存在一種新的PCV，其Cap 基因序列與PCV2 的相似性僅為24%～26%，將其命名為PCV3。我國學者采用PCR 方法從臨床發(fā)病豬肺和淋巴結(jié)組織樣品中也檢出了PCV3，證明我國也存在該病毒[3-4]。2019 年，在我國又發(fā)現(xiàn)一種新型PCV——PCV4[5]。PCV4 對仔豬也具有致病性，對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成極大的威脅。目前PCV 檢測主要依靠免疫學和分子學檢測技術(shù)，但是免疫學技術(shù)敏感性和特異性較差，分子學檢測常用的PCR 方法也存在抑制問題，加之PCV2 和PCV3 感染能導(dǎo)致相似的臨床癥狀，PCV4 也沒有快速有效的檢測方法，因此十分有必要建立一種快速、高效、敏感、特異的檢測方法來區(qū)分這3 種具有致病性的PCV。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）， 由日本學者Notomi 等[6]發(fā)明，是一種核酸恒溫擴增技術(shù)，其依賴于BstDNA 聚合酶大片段的置換活性，利用4條特異性引物在60～65 ℃、1～2 h 條件下完成對目標片段序列的等溫擴增，具有經(jīng)濟實用、高效、快速和簡便等特點，已被用于多種豬病原的檢測，如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒等。微流控芯片技術(shù)是通過生物學、化學、醫(yī)學以及電子、材料、機械等多學科交叉，將分子生物學、化學分析、醫(yī)學等領(lǐng)域所涉及的樣品前處理、分離及檢測等過程集成到幾平方厘米的芯片上，從而實現(xiàn)分析技術(shù)的微型化、自動化、集成化和便攜化，具有樣品消耗少、檢測速度快、操作簡便、多功能集成、體積小和便于攜帶等優(yōu)點，已在多個領(lǐng)域得到應(yīng)用[7-8]。此外，微流控芯片體積小巧、操作簡單，極大拓展了現(xiàn)場診斷的應(yīng)用空間[9]，與LAMP 相結(jié)合更是得到了許多研究者的青睞[10]。本研究分析了微流控芯片LAMP 法在3 種PCV 核酸快速檢測中的性能和應(yīng)用性，并與商品化PCV熒光定量檢測試劑盒檢測結(jié)果進行比較分析，以期為PCV 的鑒別檢測及該病防控提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒和豬細小病毒陽性樣品，均來自四川省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室；3 種分別含有PCV2、PCV3、PCV4 目標序列的質(zhì)粒，購自生工生物工程上海股份有限公司，分別依次10 倍稀釋至106～101copies/μL；36 份實際樣本核酸，采自四川省多個豬場。

1.2 主要試劑

3 種PCV（PCV2、PCV3、PCV4）熒光定量PCR 檢測試劑盒，微流控芯片和反應(yīng)液，磁珠法核酸提取試劑盒，均購自寧波愛基因科技有限公司。PCV2、PCV3 和PCV4 芯片檢測孔均包埋了對應(yīng)引物，PCV 混合芯片檢測孔依次包埋了PCV2、PCV3、PCV4 共3 種病毒引物。引物，購自生工生物工程上海股份有限公司。PCV2、PCV3、PCV4對應(yīng)的檢測孔包埋引物用量分別為，90 μmol/L 的PCV-F3 和PCV-B3 引物各0.5 μL，180 μmol/L 的PCV-FIP 和PCV-BIP 引物各2.0 μL。

1.3 主要儀器

PCR 儀，購自杭州博日公司；微流控芯片檢測儀（型號MA2000），購自寧波愛基因科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計

通過NCBI GenBank 尋找目標序列，并針對目標序列設(shè)計引物。

表1 PCV 恒溫擴增引物

1.5 核酸提取

采用磁珠法核酸提取試劑盒，按試劑盒說明書操作。

1.6 核酸擴增程序

將18 μL 反應(yīng)液與32 μL 模板核酸混合，加入到芯片加樣孔，再將加樣孔用封口膜封住，上機。反應(yīng)條件：溫度設(shè)定為63.5 ℃，時間設(shè)定為30 min；運行程序：低轉(zhuǎn)速1 600 r/min 離心10 s，高轉(zhuǎn)速4 600 r/min 離心30 s。

1.7 靈敏度測試

將10 倍倍比稀釋的標準質(zhì)粒作為模板分別進行恒溫擴增，確定出最低拷貝濃度，試驗設(shè)空白對照。

1.8 重復(fù)性測試

使用104copies/μL 的標準質(zhì)粒DNA 為模板進行試驗，重復(fù)8 次，計算變異系數(shù)（CV），評價其重復(fù)性。

1.9 交叉特異性測試

以104copies/μL 的PCV2、PCV3、PCV4 標準質(zhì)粒DNA 為模板，分別使用PCV2、PCV3、PCV4 引物測試標準質(zhì)粒，評估引物的交叉特異性。

1.10 特異性測試

以非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒和豬細小病毒基因組DNA 為模板，使用已包埋PCV 引物的芯片進行擴增，分析其特異性。試驗設(shè)無核酸水陰性對照。

1.11 應(yīng)用實際樣本測試PCV 聯(lián)檢芯片靈敏度及符合率

分別將PCV2、PCV3、PCV4 質(zhì)粒倍比稀釋至106～101copies/μL；先將充分混勻的核酸樣本和熒光預(yù)混液全部加進加樣孔，然后利用離心力來定向驅(qū)動樣本混合液流動，使其均勻分配到4 個反應(yīng)孔，經(jīng)恒溫擴增并實時熒光讀取，信號輸出，呈現(xiàn)結(jié)果，最后與熒光定量PCR 對比靈敏度。選取36 份實際樣本核酸，分別進行微流控芯片LAMP 擴增和熒光定量PCR 擴增，然后對比結(jié)果。

1.12 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

用PCV 微流控芯片快速檢測芯片配套的微流控恒溫擴增儀自動分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，對照試劑盒的擴增結(jié)果用熒光定量PCR 儀自動分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度測試

將PCV2、PCV3、PCV4 質(zhì)粒倍比稀釋至106～101copies/μL，發(fā)現(xiàn)PCV2、PCV3 和PCV4 的最低檢測限均可達到102copies/μL（圖1）。

圖1 靈敏度擴增結(jié)果

2.2 重復(fù)性測試

選取濃度為104copies/μL 的3 種PCV 標準質(zhì)粒DNA 為模板，重復(fù)擴增8 次。擴增結(jié)果見圖2，各濃度的擴增Ct 值以及重復(fù)性測試CV 值見表2。該方法測出重復(fù)性CV 值均小于2%，說明本研究所建立的微流控芯片LAMP法具有良好的重復(fù)性。

圖2 重復(fù)性擴增結(jié)果

表2 3 種PCV 重復(fù)性測試結(jié)果（Ct 值）

2.3 交叉特異性測試

選取濃度為104copies/μL 的3 種PCV 標準質(zhì)粒DNA 為模板，分別用PCV2、PCV3、PCV4 引物擴增標準質(zhì)粒（圖3），結(jié)果各引物只能擴增出相應(yīng)的質(zhì)粒，說明該方法具有良好的交叉特異性。

圖3 交叉特異性擴增結(jié)果

2.4 PCV 特異性擴增

采用非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒和豬細小病毒陽性樣本，對PCV 微流控芯片LAMP 法分別進行特異性分析（圖4），除陽性樣本3 種PCV 出現(xiàn)明顯“S”形擴增曲線外，其他樣本檢測結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)，說明該方法對3 種類型PCV 特異性良好。

圖4 特異性擴增結(jié)果

2.5 3 種PCV 聯(lián)檢芯片的靈敏度和符合率實際樣本測試

微流控芯片具有A—H 共8 個扇區(qū)，每個扇區(qū)有8 套反應(yīng)系統(tǒng)，每套反應(yīng)系統(tǒng)具有加樣孔、分液孔、排氣孔、毛細管道、反應(yīng)孔等結(jié)構(gòu)。圖5 所示，A1/B1/C1/D1/E1/F1/G1/H1 是PCV2 檢測孔，A2/B2/C2/D2/E2/F2/G2/H2 是PCV3 檢測孔，A3/B3/C3/D3/E3/F3/G3/H3 是PCV4 檢測孔，A4/B4/C4/D4/E4/F4/G4/H4 是對照檢測孔。

圖5 檢測芯片孔位

本試驗通過梯度稀釋混合陽性樣本，分析微流控芯片LAMP 法的敏感性。結(jié)果如表3 所示：實際樣本中，PCV2、PCV3、PCV4 微流控芯片LAMP 法的檢出限分別是103、104、103copies/μL，其中PCV2 微流控芯片LAMP 法的檢測靈敏度高于熒光定量PCR 1 個梯度，PCV3 和PCV4 微流控芯片LAMP 法則與熒光定量PCR 的靈敏度一致。

表3 3 種PCV 恒溫擴增與熒光定量PCR 靈敏度對比結(jié)果

分別使用微流控芯片LAMP 法與熒光定量PCR 法，對36 份實際樣本以及模擬樣本進行檢測。擴增結(jié)果（表4）顯示：PCV2 使用微流控芯片LAMP 法檢出陽性11 份，陽性率為30.5%；PCV3使用微流控芯片LAMP 法檢出陽性7 份，陽性率為19.4%；PCV4 使用微流控芯片LAMP 法檢出陽性5 份，陽性率為13.9%。PCV2、PCV3 和PCV4的熒光定量PCR 檢測結(jié)果均與微流控芯片LAMP法檢測結(jié)果相同，符合率均為100%。

3 討論

PCV 目前包括4 個基因型——PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4。PCV1 與PCV2 具有極為相似的基因組結(jié)構(gòu)與組成，大小均為1.76 kb 左右，兩者的核苷酸同源性達76%以上，且它們的大多數(shù)核苷酸序列區(qū)域具有高度一致性，故在設(shè)計PCV2 引物時需要特別注意，否則所設(shè)計引物很可能對PCV2 的特異性不足，易于混淆檢出PCV1。2003 年以前PCV2a 為主要流行毒株，而近年來PCV2b 感染較為普遍[11]。2016 年10 月，從流產(chǎn)胎豬中檢測到高拷貝的PCV3 基因組。國外報道PCV3 感染可能與豬皮炎和母豬繁殖障礙相關(guān)，但其致病性還不十分清楚。同樣，PCV4 作為一種新出現(xiàn)的基因型，其相關(guān)報道也不多，其流行情況、致病性、傳染性也不明確。這些病毒的檢測方法主要有PCR、熒光定量PCR 和核酸探針[12]。我國學者采用PCR 方法進行了大量樣品檢測，但需要價格昂貴的PCR 檢測儀器。熒光定量PCR 及核酸探針方法條件要求更高，很難普及推廣。而LAMP不需要昂貴的儀器設(shè)備，在等溫條件下就能快速完成反應(yīng)。目前該項技術(shù)已被廣泛用于細菌、病毒、寄生蟲檢測和動物胚胎鑒定等領(lǐng)域[13]。

本研究采用微流控芯片LAMP 法和熒光定量PCR 法對3 種PCV 樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)微流控芯片LAMP 法方法的靈敏度、重復(fù)性和特異性等性能均不低于熒光定量PCR 法，符合對3 種PCV 的檢測要求。

實際操作中，在分析3 種PCV 的特定核苷酸序列區(qū)域差異后設(shè)計引物，在試劑中加入納米金材料，吸附ssDNA 和蛋白酶，抑制升溫過程中的非特異性反應(yīng)，達到熱啟動的目的，避免在升溫過程中的非特異性反應(yīng)，且對PCV 以外的其他常見豬源病毒均無擴增現(xiàn)象，顯示出高特異性。重復(fù)性試驗的CV 值均低于2%，顯示出很好的可重復(fù)性。熒光定量PCR 檢測時間較長，一般在1 h 以上，加樣量復(fù)雜，對儀器要求高，而微流控芯片快速檢測時間僅需要30 min，檢測時間節(jié)約了1/2。在敏感性測試上，本研究的微流控芯片LAMP 法靈敏度不低于熒光定量PCR 法。另外，本研究建立的針對PCV 的微流控芯片LAMP 法，操作過程中加樣孔采用封口膜密封，杜絕了污染造成的假陽性風險。同時將反應(yīng)試劑預(yù)埋于微流控芯片上，用戶只需加入樣品，操作簡便，儀器配備鋰電池，便于現(xiàn)場快檢。本方法也可以實現(xiàn)同一樣品多個不同指標聯(lián)檢的目的。

隨著豬病毒混合感染情況越來越嚴重，在進行豬病診斷過程中，常規(guī)PCR 和熒光定量PCR 技術(shù)雖然準確性和靈敏度較高，但是要消耗大量的檢測試劑，需要足夠多的儀器設(shè)備以及大量的重復(fù)工作，這些問題給實驗室造成了巨大壓力[14]。本研究建立的3 種PCV 聯(lián)檢方法，只需1 次反應(yīng)，就能檢測3 種病毒，節(jié)約了一半的檢測成本，整個檢測時間只需30 min，能夠滿足臨床快速檢測的需求，可用于豬病毒混合感染的臨床檢測。

本研究僅對3 種PCV 一次配置的試劑及對應(yīng)的熒光定量PCR 檢測試劑盒某一批號的檢測結(jié)果做了簡要比較分析，樣本量有限，結(jié)果并不能代表各試劑的整體檢測性能。陽性樣本數(shù)量亦有限，如有條件，需擴大臨床樣本量，進一步對不同試劑的核酸提取質(zhì)量等指標進行有效評價，以驗證PCV微流控芯片快速聯(lián)檢試劑的各項性能，為不同類型的豬相關(guān)病原檢測及監(jiān)控提供有力工具。同時，隨著微流控和基因芯片等新技術(shù)不斷應(yīng)用于動物疫病檢測領(lǐng)域[15-16]，未來PCV 的病原學檢測將更加快速、準確及自動化，必會進一步為豬病防控提供有效支持。