動物疫病活載體疫苗研究進(jìn)展

周凱鈺太，潘俊慧，王素春，禹蘭平，楊文靜，梁晚楓，孫福亮，王楷宬

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 延邊大學(xué)，吉林延吉 133000；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風(fēng)險預(yù)警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032）

人類日益增長的動物產(chǎn)品需求，致使畜禽疫病防控方式更為嚴(yán)苛。疫苗接種是預(yù)防和控制畜禽疫病最為有效且經(jīng)濟(jì)的方法。畜禽接種的疫苗主要包括滅活疫苗和弱毒疫苗，但二者分別存在保護(hù)效力弱和毒力返強的問題。隨著DNA 重組技術(shù)以及反向遺傳及基因編輯等技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究人員的研究重點開始偏向于基因工程疫苗。其中，活載體疫苗（live vector vaccine，LVV）因生產(chǎn)成本低、保護(hù)力強、安全性能佳，可在載體上插入多個外源基因等優(yōu)點，受到了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。本文分別對病毒和細(xì)菌活載體疫苗進(jìn)行綜述。

1 病毒活載體疫苗

病毒活載體疫苗，是指將目的基因插入到病毒載體的非必需區(qū)，構(gòu)建能表達(dá)相應(yīng)抗原的重組病毒。目前用于構(gòu)建病毒活載體疫苗的載體分為兩大類：一是DNA 病毒，如腺病毒（adeno virus，Adv）、 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）和痘病毒等[1]；二是RNA 病毒，如新城疫病毒（NDV）、流感病毒等[2]。通過敲除病毒載體的非必需基因、突變編碼毒力基因等手段，可以增加病毒載體可插入片段的容量，保證其自身的生長特性、免疫原性及安全性。

1.1 腺病毒載體疫苗

第一代腺病毒載體是將復(fù)制基因E1或E3敲除，但在使用時需對其進(jìn)行純化，否則將誘導(dǎo)機體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥及免疫反應(yīng)；第二代腺病毒載體是將表達(dá)DNA 結(jié)合蛋白的E2基因進(jìn)行突變，使其在不適宜溫度范圍內(nèi)不表達(dá)基因產(chǎn)物，但該方法可使病毒滴度急劇下降，不適用于動物疫病免疫；第三代腺病毒載體需要有輔助病毒和互補細(xì)胞系來包裝產(chǎn)生病毒顆粒，其僅保留約500 bp 的順式作用元件。根據(jù)能否復(fù)制，腺病毒載體還可分為復(fù)制型腺病毒和復(fù)制缺陷型腺病毒。復(fù)制型腺病毒的表達(dá)效率和免疫原性較高，而復(fù)制缺陷型腺病毒的安全性更高，因此復(fù)制缺陷型腺病毒應(yīng)用范圍較廣。目前已有商品化載體及包裝系統(tǒng)可供選擇，如Ad-Easy 和Ad-Max 包裝系統(tǒng)。也可將流行腺病毒作為載體，將外源基因插入，進(jìn)行多價苗制備，或在腺病毒載體上融合表達(dá)佐劑基因，提高疫苗免疫原性。近年來腺病毒載體疫苗部分相關(guān)研究進(jìn)展情況見表1。

表1 腺病毒載體疫苗研究進(jìn)展情況

腺病毒能在哺乳動物機體內(nèi)誘導(dǎo)較強的體液免疫反應(yīng)。腺病毒載體疫苗在豬病防控方向應(yīng)用研究較多，如非洲豬瘟（ASF）、豬流行性腹瀉（PED）和豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）等。研究學(xué)者將表達(dá)非洲豬瘟病毒（ASFV）的B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L、MGF505-5R基因的重組腺病毒載體和重組牛痘病毒載體注射至豬體內(nèi)，攻毒后，與對照組相比，重組腺病毒載體免疫組的胃、肝淋巴結(jié)病毒載量降低至1/1 000，而重組牛痘病毒載體免疫組的胃、肝淋巴結(jié)病毒載量降低至1/100[13]。研究學(xué)者使用Ad-Easy 包裝系統(tǒng)來表達(dá)ASFV p72 蛋白的重組腺病毒載體，試驗結(jié)果表明Ad5-ASFV-p72 復(fù)制缺陷型腺病毒可以有效表達(dá)P72 蛋白[14]。上述結(jié)果均表明，腺病毒載體具有開發(fā)商業(yè)化ASFV 疫苗的潛力。腺病毒載體在禽類疫病防控方面應(yīng)用較少，多為AIV 方向的應(yīng)用。研究早期多將AIV 的HA基因與腺病毒載體連接，進(jìn)行病毒包裝?，F(xiàn)多將AIV相對保守的表位融合構(gòu)建至腺病毒載體上。研究學(xué)者選擇AIV 相對保守的表位、M2 胞外結(jié)構(gòu)域及部分HA 基因進(jìn)行融合構(gòu)建至腺病毒載體上[15]。關(guān)于反芻動物的腺病毒載體疫苗報道較為少見。在腺病毒載體上表達(dá)了口蹄疫病毒（FMDV）P1、3C 和VP2 蛋白，動物試驗結(jié)果顯示該重組腺病毒載體對口蹄疫具有廣泛保護(hù)作用[16]。研究人員利用重組腺病毒載體共表達(dá)鼠傷寒沙門氏桿菌鞭毛蛋白及狂犬病病毒的糖蛋白，進(jìn)一步提高了對狂犬病病毒的保護(hù)效果[17]。

1.2 痘病毒載體疫苗

重組痘病毒是最早用于商品化的獸用活載體疫苗。痘病毒基因組大小為180～300 kb，由于其基因組過大且不具備感染性，無法通過反向遺傳的方式來進(jìn)行重組病毒構(gòu)建，目前主要通過同源重組的方式構(gòu)建病毒載體，也有使用CRISPR/Cas9 技術(shù)來構(gòu)建重組病毒。痘病毒載體在一些臨床研究中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及自身免疫原性較低，但可通過敲除痘病毒載體抑制宿主免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)基因，如細(xì)胞因子基因和細(xì)胞因子受體基因來解決這一問題。缺失痘苗病毒基因組中的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因F1L、白介素18（IL-18）結(jié)合蛋白基因C12L或者Ⅰ型干擾素信號抑制基因C6L等，均能夠增強疫苗誘導(dǎo)的特異性應(yīng)答水平，提高免疫細(xì)胞的數(shù)量、功能和持續(xù)時間[18]。近年痘病毒載體疫苗部分相關(guān)研究進(jìn)展情況見表2。

表2 痘病毒載體疫苗研究進(jìn)展情況

重組禽痘病毒疫苗的黏膜遞送能力優(yōu)于重組DNA 疫苗或重組牛痘病毒疫苗，在接種后96 h 未檢測到活性病毒基因表達(dá)，且病毒僅感染初始疫苗接種部位，不會被傳播到脾臟或腸道等。目前，重組禽痘病毒多用于禽類疫病的疫苗開發(fā)。如研究人員將IBDVVP2基因插入到重組禽痘病毒載體上，發(fā)現(xiàn)該載體可對SPF 雞產(chǎn)生一定水平的保護(hù)作用[21]。也有研究將反芻動物外源基因插入禽痘病毒載體中，在小鼠和綿羊中評估了單獨表達(dá)VP2或VP2/VP5聯(lián)合表達(dá)的重組禽痘病毒載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的中和抗體[26]。還有研究將增強免疫效果的細(xì)胞因子基因（IL-18、IL-6、IFN II）與抗原基因同時插入載體中進(jìn)行表達(dá)，以增強載體疫苗免疫效力[27-28]。反芻類動物疫苗研究中山羊痘病毒載體也常被應(yīng)用，如利用山羊痘病毒載體特異性表達(dá)O 型FMDVVP1基因、PPRVF基因[29-30]。研究學(xué)者用山羊痘病毒載體表達(dá)布魯氏菌外膜蛋白OMP25，發(fā)現(xiàn)該重組病毒載體可特異性表達(dá)目的基因[31]。豬痘病毒載體也被應(yīng)用于表達(dá)PRRSV 多表位肽、豬鏈球菌2 型保護(hù)性抗原[32-33]。

1.3 皰疹病毒活載體疫苗

皰疹病毒基因組大小約150 kb。皰疹病毒載體可持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生較高水平的保護(hù)性抗體，且可脫離細(xì)胞以凍干形式保存，實現(xiàn)長時間運輸。早期重組皰疹病毒構(gòu)建是采用同源重組技術(shù)，但該技術(shù)不僅基因重組效率低，而且重組毒株和親本毒株難以分離，導(dǎo)致試驗周期長。目前主要通過人工染色體（BAC）感染性克隆構(gòu)建重組皰疹病毒。也有方法通過構(gòu)建病毒基因組Fosmid 文庫，在菌體中對病毒基因組進(jìn)行改造，雖然該方法顯著提高了獲得病毒突變體的效率，但步驟復(fù)雜[34]。也可基于CRISPR/CAS9 系統(tǒng)構(gòu)建重組皰疹病毒載體，從而進(jìn)行特定位點的缺失或替換，但該方法實際操作困難且基因脫靶率高[35]。近年內(nèi)皰疹病毒載體疫苗部分相關(guān)研究進(jìn)展情況見表3。

表3 皰疹病毒載體疫苗的研究進(jìn)展情況

火雞皰疹病毒（herpesvirus of turkey，HVT）是一種天然的非致病性α 皰疹病毒，其可作為最常用的皰疹活載體疫苗來表達(dá)外源基因及預(yù)防雞馬立克氏病。目前HVT 在禽類疫病方向應(yīng)用較多，如可融合表達(dá)NDVHN、F基因，IBDVVP2、gB、gD基因[44-45]。有研究[46]將IBDV 的VP2基因插入HVT 基因組的4 個不同位點，構(gòu)建出4 株重組病毒來評估不同位點與病毒誘導(dǎo)抗體能力之間的關(guān)系，通過試驗證明rHVT/IBD（UL45-46）具有較低的生長活性，可穩(wěn)定引發(fā)高水平中和抗體，而rHVT/IBD（UL3-4）表現(xiàn)出中等的增殖特性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平抗體。鴨瘟病毒（duck enteritis virus，DEV）常被用作水生家禽疫苗病毒載體。有研究人員通過構(gòu)建DEV 疫苗株的Fosmid 文庫，在病毒感染性克隆的基礎(chǔ)上將DEV-I 型VP0基因和H5 亞型AIV 基因分別插入DEV 基因組中[47]。在豬病方面，研究學(xué)者利用同源重組技術(shù)構(gòu)建共表達(dá)PEDV S 蛋白和豬輪狀病毒VP7 蛋白的PRV 三聯(lián)基因工程疫苗株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組株外源基因穩(wěn)定存在；將ASFVCD2V基因插入基因缺失的PRV基因組中，經(jīng)試驗證明了其遺傳穩(wěn)定性、毒力、免疫原性和保護(hù)能力[48]。

1.4 NDV 載體疫苗

NDV 屬于單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA 病毒，常用弱毒NDV 構(gòu)建重組病毒載體表達(dá)外源基因。NDV 在反向遺傳操作系統(tǒng)中外源基因可插入位點靈活，但研究[49]證明外源基因插入位置越接近病毒基因組的3'末端則外源蛋白表達(dá)量越高，但對病毒復(fù)制的干擾也更強。研究[50]表明，NDVP基因和M基因之間的非編碼區(qū)是外源基因的最佳插入位置。NDV 載體疫苗可以通過飲水、滴鼻或點眼等方式進(jìn)行免疫，與其他種類的病毒活載疫苗相比，免疫方式便利且成本較低。在反向遺傳系統(tǒng)操作中，負(fù)鏈RNA 病毒不同于正鏈RNA 病毒，其自身沒有感染性，因此需要NP 蛋白來幫助轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。目前，構(gòu)建成功的反向遺傳系統(tǒng)NDV 毒株有La Sota、V4-C、Beaudette C、Hitchner B1 等。NDV 載體疫苗部分相關(guān)研究進(jìn)展如表4 所示。

表4 NDV 載體疫苗研究進(jìn)展情況

在我國，2007 年第一個NDV 載體疫苗——禽流感、新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5 株）獲得農(nóng)業(yè)部注冊，并在臨床上得到廣泛應(yīng)用。目前，NDV 載體多被用于禽類疫病防控，大多將AIV 的HA 基因插入NDV 載體上[56]。也有文獻(xiàn)[57]報道，利用NDV 載體表達(dá)IBDV VP2 蛋白和ILTV gD 蛋白，可產(chǎn)生一定的免疫原性。對反芻動物也可應(yīng)用NDV 載體疫苗進(jìn)行免疫。Liu 等[58]構(gòu)建了表達(dá)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）S 蛋白的重組NDV，經(jīng)在小鼠和雙峰駝中進(jìn)行免疫原性評估發(fā)現(xiàn)，該重組病毒可誘導(dǎo)小鼠和駱駝產(chǎn)生MERSCoV 中和抗體。

1.5 其他動物病毒載體疫苗

有研究[59]構(gòu)建了IBV 疫苗株反向遺傳系統(tǒng)，將相同血清型致病株M41、beaur 的S基因置換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組疫苗株能同時保護(hù)M41、beaur 株對被攻毒動物的攻擊。有研究[60]構(gòu)建了PRRSV反向遺傳系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)所得重組病毒的毒性與親本毒株相似，并可同時表達(dá)豬瘟病毒C 株E2基因和PCV-2 ORF2 基因。有研究[61]構(gòu)建了水泡性口炎病毒反向遺傳系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上將AIV 的HA基因和艾滋病病毒（HIV）的Gag和Env基因插入該載體中獲得重組病毒，發(fā)現(xiàn)該重組病毒能特異性表達(dá)目的基因，且表達(dá)水平較高。除此之外，麻疹病毒、彈狀病毒、黃病毒等具有在宿主中高效復(fù)制的特點，因此在病毒載體疫苗領(lǐng)域中也受到了相應(yīng)關(guān)注。

2 細(xì)菌活載體疫苗

細(xì)菌活載體是指利用基因編輯方法將細(xì)菌的毒力基因致弱或敲除，并將病原體的抗原基因整合到細(xì)菌基因組或插入到質(zhì)粒中，獲得能表達(dá)目的基因的重組菌株。根據(jù)細(xì)菌載體的特性，將細(xì)菌載體分為減毒致病菌與非致病菌兩類。細(xì)菌活載體疫苗具有保護(hù)外源DNA 不被降解、操作流程簡單、培養(yǎng)方便、成本低、可誘導(dǎo)更高水平黏膜免疫等優(yōu)點，同時也存在免疫效率不足和免疫抗原耐受的問題。用于細(xì)菌活載體疫苗的載體包括乳酸菌（Lactic acidbacteria）、沙門氏菌（Salmonella）等[62]。

2.1 乳酸菌活載體疫苗

乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，相比減毒疫苗和滅活疫苗，重組乳酸菌疫苗能夠遞呈抗原并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，同時能夠在人體腸道中持續(xù)定殖，長期釋放特異性抗原蛋白引起機體免疫反應(yīng)[63]。研究[64]構(gòu)建的pValac 質(zhì)粒，提高了乳酸菌向宿主細(xì)胞內(nèi)部傳遞的效率，并能將其傳遞到豬腎細(xì)胞系內(nèi)部。乳酸菌表達(dá)外源抗原主要有胞內(nèi)、分泌和錨定3 種形式，多數(shù)研究認(rèn)為錨定型重組菌能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更高水平的抗體。重組乳酸菌載體疫苗可以充當(dāng)黏膜佐劑及抗原遞呈劑，可在呈遞目的基因的同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IL-2 和IL-6，可提高重組載體黏膜給藥能力。但乳酸菌活載體疫苗也存在在機體存活時間短、抗原表達(dá)水平有限等問題。乳酸菌活載體疫苗部分相關(guān)研究進(jìn)展見表5。

表5 乳酸菌載體疫苗研究進(jìn)展情況

目前，乳酸菌載體在動物疫病防控中的應(yīng)用較多。在豬病方面，有研究[70-71]構(gòu)建了可特異性表達(dá)PEDV 抗原基因的重組乳酸菌載體，并利用蛋白錨定技術(shù)將蛋白錨定在菌體表面。大多數(shù)傳統(tǒng)的質(zhì)粒遞送載體使用抗生素基因作為選擇性標(biāo)記，這容易導(dǎo)致抗生素積累和基因污染。有研究[72]利用丙氨酸消旋酶基因代替抗生素基因進(jìn)行篩選，并構(gòu)建了表達(dá)PEDV 中和表位抗原基因的重組乳酸菌，將其注射至小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)IgG 水平升高。Shonela 等[73]構(gòu)建了一株可特異性表達(dá)豬輪狀病毒VP7 抗原的重組乳酸菌，將其注射至小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)高水平滴度的抗體。有研究[74]構(gòu)建了可特異性表達(dá)鵝細(xì)小病毒VP7基因的重組乳酸菌載體，將其注射至小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可使機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在禽病防控方面，乳酸菌更多作為佐劑來增強疫苗效果。有研究[68]構(gòu)建了可特異性表達(dá)雞IL-17B 基因的重組乳酸菌載體，經(jīng)動物試驗發(fā)現(xiàn)，實驗組病毒載量明顯低于對照組。目前，重組乳酸菌載體在反芻動物疫病防控方面的研究較少，可能是由于反芻動物消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能復(fù)雜導(dǎo)致重組乳酸菌載體在機體上表達(dá)的目的蛋白水平較低。有研究[75]構(gòu)建了可特異性表達(dá)牛流行性腹瀉病毒抗原基因的重組乳酸菌，將其經(jīng)口遞送至小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的免疫反應(yīng)。但這兩項研究均未涉及牛的動物實驗，所以未知其實際保護(hù)效力。

2.2 沙門氏菌活載體疫苗

沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌。突變型傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌自身無法產(chǎn)生毒素且可在宿主腸道內(nèi)長時間存活，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高的免疫水平[76]?？诜抽T氏菌減毒活疫苗除可以誘導(dǎo)腸道上皮的局部免疫外，還可誘導(dǎo)全身體液免疫和細(xì)胞免疫，同時可減少有害物產(chǎn)生。但在研制口服沙門氏菌減毒活疫苗過程中，必須考慮其在機體中的停留時間，毒力過弱可能導(dǎo)致其在機體定殖時間過短，無法引發(fā)免疫反應(yīng)，故現(xiàn)構(gòu)建減毒沙門氏菌載體時，更傾向于構(gòu)建自毀減毒沙門氏菌。乳酸菌活載體疫苗部分相關(guān)研究進(jìn)展見表6。

表6 沙門氏菌載體疫苗研究進(jìn)展情況

最早通過化學(xué)和紫外線照射方式使沙門氏菌毒力基因發(fā)生突變從而達(dá)到減毒效果，后來發(fā)現(xiàn)帶saoA基因的重組減毒腸炎沙門氏菌rSC0016 和rSC0012 株能夠引起機體較強的免疫反應(yīng)，近幾年通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)ptsI和crr基因突變菌株在誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)方面非常有效[81]。減毒沙門氏菌載體多用于動物細(xì)菌病防控。有研究[82]構(gòu)建了重組減毒沙門氏菌載體，使其表達(dá)豬鏈球菌特異性抗原或在沙門氏菌內(nèi)包裝病毒顆粒，以起到對該病原的保護(hù)作用。利用重組減毒沙門氏菌載體向小鼠體內(nèi)遞送豬肺炎支原體P42 和P97 抗原，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子水平升高，并能抵御毒株攻擊[83]。有研究[84]構(gòu)建了表達(dá)布魯氏菌抗原（SodC、Omp19、BLS 和PrpA）的重組減毒沙門氏菌載體，發(fā)現(xiàn)其可抵御小鼠和山羊免于布魯氏菌的攻擊。利用減毒沙門氏菌載體表達(dá)銅綠假單胞菌外膜蛋白F1I2，將其經(jīng)皮下接種和口服給藥后，發(fā)現(xiàn)皮下注射實現(xiàn)了更高的血清IgG 滴度和IgA 滴度[85]。減毒沙門氏菌載體在病毒病防控方向應(yīng)用較少。利用重組減毒沙門氏菌載體向仔豬體內(nèi)遞送豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和PEDVS基因，可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答反應(yīng)[86]。

2.3 其他細(xì)菌活載體疫苗

大腸桿菌（Escherichiacoli）屬于革蘭氏陰性菌，其生長周期短，且重組質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳。如今已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有多個種類，部分大腸桿菌菌株對機體具有一定的益生效果，同時大腸桿菌能夠在機體腸道中定殖，進(jìn)而刺激機體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)[62]。近年來，有研究[87]構(gòu)建了一株可特異性表達(dá)新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）抗原的重組大腸桿菌，可作為SARS-CoV-2 的候選疫苗株。Zhong等[88]證明重組枯草芽孢桿菌可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生局部的黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可用于豬肺炎支原體感染的預(yù)防。

3 活載體疫苗抗原呈遞策略

活載體疫苗的載體種類和抗原呈遞方式會決定其外源蛋白的表達(dá)水平、安全性和免疫效果。抗原呈遞的途徑主要有MHC Ⅰ類和MHC Ⅱ類限制性抗原呈遞途徑。內(nèi)抗原蛋白與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合，并與MHC Ⅰ/Ⅱ分子結(jié)合，展示于抗原呈遞細(xì)胞表面，誘導(dǎo)機體發(fā)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)[89]。抗原呈遞細(xì)胞包括B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞?；钶d體疫苗常用的抗原呈遞策略有載體-宿主平衡致死系統(tǒng)、微生物表面展示系統(tǒng)等。

3.1 載體-宿主平衡致死系統(tǒng)

構(gòu)建載體-宿主平衡致死系統(tǒng)，首先要將編碼細(xì)菌生長繁殖的必需基因敲除，使細(xì)菌只能在特定添加某種營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中生存?？赏ㄟ^將含必需基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)繁殖缺陷菌的方式，使其能夠在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上正常繁殖，也可通過使用生長繁殖所需的必需基因代替抗生素基因，以有效避免抗生素污染，使重組細(xì)菌載體疫苗在機體中穩(wěn)定繁殖并產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。通常對減毒細(xì)菌載體進(jìn)行改造或敲除的基因為表達(dá)必須營養(yǎng)物質(zhì)基因部分片段。目前，該系統(tǒng)已被應(yīng)用于開發(fā)乳酸菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌等多價疫苗中。

3.2 微生物表面展示系統(tǒng)

微生物表面展示系統(tǒng)是將重組蛋白錨定到細(xì)菌表面，使外源抗原展示在微生物表面。利用該方法可使抗原呈遞水平比細(xì)胞質(zhì)抗原呈遞水平更高[90]。在疫苗研究領(lǐng)域，應(yīng)用的微生物表面展示系統(tǒng)主要包括細(xì)菌表面展示系統(tǒng)與桿狀病毒表面展示系統(tǒng)。

3.2.1 細(xì)菌表面展示系統(tǒng) 細(xì)菌表面展示系統(tǒng)是在原核表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用跨膜結(jié)構(gòu)域、脂蛋白錨定、共價連接或非共價連接方式等將外源蛋白與細(xì)菌表面蛋白錨定連接[90]。革蘭氏陽性菌的抗原呈遞方式不同于革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚，存在的膜蛋白較少，外源蛋白錨定困難，因此不能直接采用表面呈現(xiàn)方法進(jìn)行外源蛋白呈遞，而需要通過構(gòu)建佐劑的方式使革蘭氏陽性菌能夠成功在其表面呈遞抗原。有研究[91]通過處理乳酸菌得到了細(xì)菌形狀的肽聚糖聚合體，它也被稱為革蘭氏陽性增強子基質(zhì)（GEM），該結(jié)構(gòu)缺乏細(xì)菌細(xì)胞壁成分和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)，抗原可通過肽聚糖結(jié)合附著在GEM 顆粒表面。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁較薄，膜蛋白容易表露在其表面。目前已有研究[92]構(gòu)建了一株減毒沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)其外源蛋白可與自身轉(zhuǎn)運蛋白MisL 融合，因而提高了T 細(xì)胞對其免疫性的應(yīng)答能力。

3.2.2 桿狀病毒表面展示系統(tǒng) 以細(xì)菌為載體的表面展示系統(tǒng)采用的是原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)難以表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物蛋白。而桿狀病毒表面展示系統(tǒng)屬于真核生物展示系統(tǒng)。該系統(tǒng)允許大片段外源基因插入，因而能有效地在病毒粒子表面展示外源蛋白，而且可以對外源蛋白進(jìn)行糖基化加工和折疊等翻譯后修飾，尤其適合需進(jìn)行特異的翻譯后加工才能有效折疊和具有生物活性的高等真核生物細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白的展示。在該系統(tǒng)中，桿狀病毒表面膜蛋白gp64 與外源蛋白融合，并在信號肽作用下轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜從而引起免疫反應(yīng)[93]。

4 展望

目前，細(xì)菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗作為主要的活載體疫苗種類，在預(yù)防疾病方面均有不同的優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇最優(yōu)最適合的活載體疫苗種類，將其免疫效果發(fā)揮至最佳水平。同時，活載體疫苗抗體呈遞方式的進(jìn)步，提高了目的抗原在機體中的呈遞效率，使其保護(hù)效力增強。盡管活載體疫苗在預(yù)防和控制動物疾病方面具有潛力，但仍需要進(jìn)一步完善相關(guān)研究。通過對微生物載體基因組和遺傳特征的深入研究，可以開發(fā)出更安全、穩(wěn)定和高效的活載體疫苗。此外，對抗原呈遞機制的深入研究非常重要。了解活載體疫苗如何誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，以及如何與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，將有助于優(yōu)化其設(shè)計，改進(jìn)其效力。通過持續(xù)和完善的研究，不斷改進(jìn)活載體疫苗的設(shè)計和應(yīng)用，可更有效地預(yù)防和控制各種疾病。