β-受體激動(dòng)劑類藥物人工抗原合成方法研究進(jìn)展

孫曉亮，王曉茵，方漢卿，宋翠平，趙思俊，曹旭敏，李木子

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

β-受體激動(dòng)劑是一類化學(xué)合成的具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)的藥物，可促進(jìn)蛋白同化，提高瘦肉率，個(gè)別不法分子將其用于畜禽養(yǎng)殖，以達(dá)到非法牟利的目的。長(zhǎng)期或大劑量使用β-受體激動(dòng)劑類藥物能引發(fā)畜禽生理系統(tǒng)中毒，導(dǎo)致心臟顫動(dòng)、心動(dòng)過(guò)速、神經(jīng)過(guò)敏、肌肉顫動(dòng)、意識(shí)模糊，甚至中毒[1-4]。因此，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都禁止克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等β-受體激動(dòng)劑用于食品動(dòng)物養(yǎng)殖。

為了加強(qiáng)β-受體激動(dòng)劑類藥物的殘留監(jiān)管，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該類藥物的檢測(cè)方法開展了廣泛而深入的研究。目前對(duì)β-受體激動(dòng)劑類藥物進(jìn)行殘留檢測(cè)的方法有液相色譜法[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等定量確證檢測(cè)方法，以及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[8]、膠體金試紙法[9]等免疫快速檢測(cè)方法。其中，免疫分析方法主要基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，具有操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于大批量畜禽產(chǎn)品的快速篩查工作。

抗體是開展免疫檢測(cè)的核心成分，獲得特異性好、親和力強(qiáng)的抗體已成為科研工作者追求的目標(biāo)，而合成高效的人工抗原是獲得高質(zhì)量抗體的前提[10]。β-受體激動(dòng)劑類藥物屬于小分子化合物，不具有免疫原性，只有將其與載體蛋白偶聯(lián)后制備成完全抗原，才可刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，用于免疫分析。在大多數(shù)情況下，半抗原的活性基團(tuán)不能直接與載體蛋白偶聯(lián)，需要交聯(lián)劑對(duì)其反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行活化，只有這樣才能在溫和條件下與載體偶聯(lián)。根據(jù)半抗原活性基團(tuán)的不同，選擇適當(dāng)?shù)呐悸?lián)方法，得到偶聯(lián)率均一、穩(wěn)定的人工抗原，是合成方法的關(guān)鍵。本文基于常見的β-受體激動(dòng)劑類藥物不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，對(duì)其人工抗原的合成和鑒定方法進(jìn)行了綜述，以期為小分子化合物免疫分析工作研究提供理論參考。

1 β-受體激動(dòng)劑人工抗原合成

根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，常見的β-受體激動(dòng)劑類藥物可分為苯酚型和苯胺型2 種，含有的活性基團(tuán)分別為羥基（-OH）和氨基（-NH2），可直接利用該活性基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)合成反應(yīng)，也可以在羥基位引入含羧基（-COOH）的側(cè)鏈，或?qū)⑾趸?NO2）通過(guò)還原反應(yīng)得到氨基（-NH2），再與載體蛋白偶聯(lián)。

1.1 苯酚型β-受體激動(dòng)劑人工抗原合成

1.1.1 碳二亞胺法 碳二亞胺法通常以碳二亞胺為脫水劑，將分子中的羧基和氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵。該偶聯(lián)條件溫和、操作簡(jiǎn)便，但由于碳二亞胺沒有選擇性，為減少載體蛋白的羧基與氨基發(fā)生縮合，而導(dǎo)致載體蛋白之間偶聯(lián)，一般是先將含羧基的半抗原與碳二亞胺活化，再加入載體蛋白反應(yīng)，形成完全抗原。栗慧等[11]采用該方法制備特布他林人工抗原，獲得了高靈敏度和特異性的特布他林多克隆抗體，血清效價(jià)達(dá)1:32 000 以上。

1.1.2 活潑酯法 活潑酯法是在碳二亞胺法的基礎(chǔ)上優(yōu)化的方法。通常在避光條件下，N-羥基丁二酰亞胺中的羥胺鍵與半抗原分子中的羧基反應(yīng)，得到活性中間體，再與載體蛋白偶聯(lián)，形成酰胺鍵；半抗原的羧基被活化后，更有利于與蛋白的氨基偶聯(lián)形成新的酰胺鍵，避免了碳二亞胺對(duì)載體蛋白的直接作用，從而降低載體蛋白間的偶聯(lián)，該方法在人工抗原的合成中應(yīng)用廣泛。陳觀銀等[12]采用該方法合成沙丁胺醇人工抗原，制備的抗體對(duì)沙丁胺醇的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.746 ng/mL，與其他同類結(jié)構(gòu)藥物的交叉反應(yīng)率均小于0.015%，篩選出的雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中抗體效價(jià)達(dá)1:128 000，小鼠腹水中抗體效價(jià)達(dá)1:2 560 000，具體合成路線如圖1 所示。郭東光等[13]采用該方法合成齊帕特羅人工抗原，制備了特異性強(qiáng)、靈敏度高的齊帕特羅抗體，血清效價(jià)在1:6 400 以上，與克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、溴布特羅、西馬特羅和特布他林等均無(wú)交叉反應(yīng)。

圖1 活潑酯法合成沙丁胺醇人工抗原技術(shù)路線圖

1.1.3 混合酸酐法 混合酸酐法是在胺的作用下，分子中的羧基與氯甲酸異丁酯反應(yīng)，生成混合酸酐活性中間體，再與載體蛋白偶聯(lián)，得到相應(yīng)的人工抗原，其操作過(guò)程簡(jiǎn)單，應(yīng)用較為廣泛。于洪俠等[14]采用該方法制備萊克多巴胺人工抗原，利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法檢測(cè)到抗血清效價(jià)高于1:6 000，IC50為10 ng/mL，與克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林的交叉反應(yīng)率均小于0.01%，具體合成路線見圖2。崔芳微等[15]采用該方法成功合成了沙丁胺醇人工抗原。沙丁胺醇與載體蛋白BSA 的偶聯(lián)比為17:1，免疫后兔血清抗體效價(jià)為1:102 400，IC50為24.84 μg/L；特異性鑒定結(jié)果顯示，沙丁胺醇多抗血清與側(cè)鏈上含有叔丁基官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)類似物具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，但是與其他同類分子（如齊帕特羅、西馬特羅、萊克多巴胺和多巴胺等）不存在交叉反應(yīng)。Liang 等[16]采用該方法合成了沙丁胺醇人工抗原，通過(guò)動(dòng)物免疫及單抗制備，獲得了靈敏度高、交叉反應(yīng)性強(qiáng)的沙丁胺醇單抗，IC50為0.27 ng/mL，可以同時(shí)識(shí)別特布他林、西布特羅、克倫特羅和溴布特羅等38 種β-受體激動(dòng)劑。

圖2 混合酸酐法合成萊克多巴胺人工抗原技術(shù)路線圖

1.1.4 琥珀酸酐法 琥珀酸酐法是將分子中游離的-OH 與琥珀酸酐反應(yīng)，引入一個(gè)琥珀酸酐碳連接臂，生成含有活性-COOH 的半抗原，再與蛋白反應(yīng)，得到暴露出母核結(jié)構(gòu)的人工抗原。Wu 等[17]采用該方法得到沙丁胺醇人工抗原，制備的抗體靈敏度高，IC50為0.028 μg/L，與克倫特羅（139.6%）和溴布特羅（225%）具有高度交叉反應(yīng)性，具體合成路線見圖3。

圖3 琥珀酸酐法合成沙丁胺醇人工抗原技術(shù)路線圖

1.1.5 羰基二咪唑法 羰基二咪唑法基于化合物的羥基與羰基二咪唑反應(yīng)，得到咪唑甲酸酯，然后載體蛋白中的N-親核試劑進(jìn)攻羰基，形成肽鍵，得到完全抗原。曹碧云[18]采用該方法合成了沙丁胺醇人工抗原，具體合成路線見圖4。

圖4 羰基二咪唑法合成沙丁胺醇人工抗原技術(shù)路線圖

1.2 苯胺型β-受體激動(dòng)劑人工抗原合成

克倫特羅、西馬特羅等藥物由于苯環(huán)具有伯氨基，屬于苯胺型β-受體激動(dòng)劑。氨基作為活性化學(xué)基團(tuán)，常用的偶聯(lián)方法有戊二醛法、重氮化法、異氰酸酯法、曼尼希反應(yīng)法等。

1.2.1 重氮化法 重氮化法是含氨基藥物人工抗原合成最常用的方法。在低溫條件下，胺與亞硝酸鹽在過(guò)量酸（比如鹽酸）的作用下反應(yīng)，生成重氮鹽；再與蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基鄰位反應(yīng)，得到人工抗原。Cao 等[19]采用該方法合成苯乙醇胺A 人工抗原，制備的抗體具有較高靈敏度，IC50低于0.48 ng/mL，與克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺等9 種該類藥物的交叉反應(yīng)率小于0.39%，具體合成路線見圖5。職愛民等[20]采用該方法合成西馬特羅人工抗原，經(jīng)免疫試驗(yàn)證實(shí)，獲得了高滴度的西馬特羅抗體，抗血清效價(jià)均達(dá)1:1 000 以上，IC50為86.9 ng/mL。Wang 等[21]也采用該方法合成克倫特羅人工抗原，利用該抗原獲得了具有廣譜性的克倫特羅單抗，可識(shí)別23 種β-受體激動(dòng)劑及其類似物，并建立了競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫吸附分析方法。

圖5 重氮化法合成苯乙醇胺A 衍生物人工抗原技術(shù)路線圖

1.2.2 戊二醛法 戊二醛法反應(yīng)條件溫和，將含有氨基的半抗原、載體蛋白和戊二醛以五碳橋連接，形成半抗原-戊二亞胺-BSA 人工抗原。但該方法選擇性差，容易造成載體間的偶聯(lián)。王耀等[22]采用該方法將戊二醛分子中的兩個(gè)醛基分別與鹽酸阿可樂(lè)定和BSA 的氨基反應(yīng)形成席夫堿，一步合成可樂(lè)定人工抗原，得到的人工抗原有較好的免疫效果，小鼠多抗血清效價(jià)達(dá)1:12 800 以上，IC50為82.75 ng/mL，具體合成路線見圖6。

圖6 戊二醛法合成可樂(lè)定人工抗原技術(shù)路線圖

1.3 苯胺型和苯酚型β-受體激動(dòng)劑二聚體人工抗原合成

大多數(shù)的人工抗原是一種半抗原偶聯(lián)一種載體蛋白，只針對(duì)一類β-受體激動(dòng)劑，檢測(cè)目標(biāo)也僅限于某一特定類型。多分析物免疫具有高通量、高效率和低樣品消耗等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)多重識(shí)別特性的廣譜抗體引起學(xué)者的關(guān)注。Liu 等[23]通過(guò)重氮化將克倫特羅（苯胺型β-受體激動(dòng)劑）和萊克多巴胺（苯酚型β-受體激動(dòng)劑）兩種半抗原偶聯(lián)到同一載體蛋白上，制備二聚體人工抗原，達(dá)到一次試驗(yàn)同時(shí)測(cè)定兩類β-受體激動(dòng)劑的效果，具體合成路線見圖7。間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定的滴度結(jié)果顯示，2 只免疫新西蘭兔產(chǎn)生的抗血清滴度均超過(guò)1:128 000，并將多克隆抗體與銪納米顆粒結(jié)合形成探針，建立了基于銪納米顆粒的熒光側(cè)向流動(dòng)免疫分析方法，可同時(shí)檢測(cè)8 種苯胺類和1 種苯酚類β-受體激動(dòng)劑。

圖7 重氮化法合成克倫特羅和萊克多巴胺二聚體人工抗原技術(shù)路線圖

2 β-受體激動(dòng)劑人工抗原鑒定

人工抗原合成后，需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定或表征，以判斷偶聯(lián)是否成功，通常采用紫外光譜法、電泳法、紅外光譜法和核磁共振法等進(jìn)行鑒定。

2.1 紫外光譜法

由于藥物、載體蛋白及二者偶聯(lián)物的最大吸收波長(zhǎng)不同，因此可以測(cè)定偶聯(lián)前后最大吸收波長(zhǎng)的變化，來(lái)證實(shí)完全抗原是否偶聯(lián)成功，該方法操作簡(jiǎn)便，常用于人工抗原鑒定。宋珊珊等[24]比較了萊克多巴胺（RAC）、BSA 和RAC-BSA 的紫外光譜圖，發(fā)現(xiàn)RAC、BSA 的紫外吸收峰分別在269、278 nm 處，RAC-BSA 在200～400 nm 處有特征吸收峰，且出現(xiàn)相應(yīng)的光譜疊加現(xiàn)象，認(rèn)為RAC 與BSA 偶聯(lián)成功。

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中根據(jù)分子大小不同而呈梯度分開，藥物與載體蛋白結(jié)合后分子質(zhì)量發(fā)生變化，使得電泳條帶位置不同。周景明等[25]采用該方法鑒定克倫特羅人工抗原，發(fā)現(xiàn)BSA 及雞卵清蛋白的涌動(dòng)速度比偶聯(lián)物的涌動(dòng)速度快，偶聯(lián)物的電泳條帶較載體蛋白明顯滯后，說(shuō)明克倫特羅與載體蛋白偶聯(lián)成功。

2.3 紅外光譜法

紅外光譜圖具有高度專屬性和特異性，根據(jù)譜圖中吸收峰的波長(zhǎng)、強(qiáng)度和形狀可以判斷分子中的基團(tuán)，直觀反映物質(zhì)結(jié)構(gòu)特征。劉紅梅等[26]從RAC-BSA 紅外光譜中看到3 294 cm-1處有氨基N-H 吸收峰，1 658 和1 538 cm-1處有酰胺吸收峰，說(shuō)明含有BSA 結(jié)構(gòu)；RAC-BSA 和RAC 在833 cm-1處有相似的吸收峰，而BSA 在此處無(wú)吸收，說(shuō)明含有RAC 結(jié)構(gòu)，據(jù)此推測(cè)RAC 和BSA偶聯(lián)成功。

2.4 核磁共振法

核磁共振氫譜可以用來(lái)確定分子結(jié)構(gòu)，每種含氫化合物都有自己獨(dú)特的波譜圖，通過(guò)不同的化學(xué)位移和自旋偶合來(lái)表征化合物結(jié)構(gòu)。Lommen等[27]用該方法對(duì)非諾特羅抗原進(jìn)行檢測(cè)，分析氫化學(xué)位移特征，確定偶聯(lián)反應(yīng)成功。非諾特羅的特征化學(xué)位移在δ= 0.95、2.43、2.60、2.77、2.82、4.41、5.95、6.52 和6.82 處，經(jīng)過(guò)20 h 的反應(yīng)，這些共振（除δ= 5.95）降低到原始振幅的70%，在δ= 5.95 處共振幾乎消失。該共振來(lái)自非諾特羅的雙酚側(cè)質(zhì)子，其在高pH 值下與溶劑（D2O）中的氘緩慢交換，使非諾特羅共振振幅降低了30%，相當(dāng)于平均30 個(gè)非諾特羅分子結(jié)合到1 個(gè)BSA分子中。于洪俠等[14]也通過(guò)核磁共振法鑒定了RAC-BSA 偶聯(lián)物。

3 展望

免疫分析法具有操作快速、靈敏度高、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以突破常規(guī)儀器分析的局限，在β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。制備具有良好免疫原性的人工抗原，是免疫分析技術(shù)的基礎(chǔ)。反應(yīng)位點(diǎn)、連接臂及長(zhǎng)度、載體連接方式和偶聯(lián)比等都是影響人工抗原免疫原性的重要因素。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、分子模擬技術(shù)等，由于可預(yù)測(cè)半抗原與潛在免疫特性之間的關(guān)系，有助于開發(fā)性能更穩(wěn)定、免疫原性更高的人工抗原，近年來(lái)極大推動(dòng)了半抗原分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和合成工作，具有較大的發(fā)展?jié)撃堋?/p>