越南非洲豬瘟疫苗AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）研究工作分析與思考

戈勝強(qiáng)，沙 洲，左媛媛，初薛霏，徐天剛，張永強(qiáng)，李金明，王志亮

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島市現(xiàn)代生物工程及動物疫病研究重點(diǎn)實驗室，山東青島 266032；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風(fēng)險預(yù)警及防控重點(diǎn)實驗室（南方），山東青島 266032；4. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271018）

2023 年7 月，越南正式將非洲豬瘟（African swine fever，ASF） 弱毒疫苗NAVET-ASFVAC（ASFV-G-ΔI177L） 和AVAC ASF LIVE（ASFVG-ΔMGF）推向其全國市場，這是世界范圍內(nèi)首次在一個國家全面實施ASF 疫苗防控措施。上述兩種疫苗均為引進(jìn)的美國基因II 型非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）弱毒疫苗株，其中ASFV-G-ΔI177L為2020年研制的疫苗候選株，ASFV-G-ΔMGF 為2015 年研制的疫苗候選株。據(jù)越南媒體報道，NAVET-ASFVAC（ASFV-G-ΔI177L）在臨床試驗期間出現(xiàn)過接種豬發(fā)病死亡事件，但AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）未有任何負(fù)面信息報道。相比ASFV-G-ΔI177L，ASFV-G-ΔMGF的系統(tǒng)研究資料相對較少，但是國內(nèi)弱毒疫苗候選株HLJ/18-7GD[1]和CN2018 ΔMGF/ΔCD2v（數(shù)據(jù)未發(fā)表）中多基因家族（MGF）的敲除區(qū)域與其缺失位置相似，也可以為其提供一定研究補(bǔ)充資料。為此本文就越南ASFV-G-ΔMGF 疫苗種毒的核心研究數(shù)據(jù)及國內(nèi)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜述，以期為我國相關(guān)研究及政策制定提供參考。

1 ASFV-G-ΔMGF 基因缺失株首次評價數(shù)據(jù)

2015 年，O'Donnell 等[2]根據(jù)以往自然缺失株（OURT 88/3 和E75）、細(xì)胞傳代適應(yīng)株（BA71V和ASFV-G-P110） 和基因缺失株（Pr4Δ35 和MALΔSVD）的研究總結(jié)，判斷多基因（MGF）家族中的MGF360 和MGF505 蛋白編碼基因可能與病毒的毒力和復(fù)制相關(guān)，因此將基因II 型強(qiáng)毒株ASFV-G 基因組的27 928～35 487 bp 位置進(jìn)行了人工敲除（長度7 558 bp，涉及MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF-14L、MGF505-2R 和MGF505-3R 等6 個蛋白編碼基因），結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASFV-G-ΔMGF 毒力減弱且能誘導(dǎo)產(chǎn)生攻毒保護(hù)能力。這是第一次明確證明MGF蛋白為ASFV 的毒力決定因子，這也是第一個可對ASFV-G 產(chǎn)生攻毒保護(hù)的試驗性疫苗。

ASFV-G-ΔMGF 在細(xì)胞上的繁殖能力與其母本強(qiáng)毒株相似，不同劑量接種（102、104HAD50，肌肉注射，每組10 只）后，28 d 觀察期內(nèi)無任何臨床異常表現(xiàn)。ASFV-G-ΔMGF 接種后會在血液中檢測到病毒，且病毒滴度與接種劑量呈一定正相關(guān)，但不同接種豬存在一定差異。102H A D50接種組的病毒血癥檢測結(jié)果顯示：3 頭接近臨界值（101.8HAD50/mL），6 頭為中等滴度（1 02～4H A D50/m L），1 頭滴度較高（105HAD50/mL），但在攻毒前所有血樣中均已檢測不到病毒。104HAD50接種組的病毒血癥滴度普遍高于1 02HAD50接種組，其中4 頭高于1 04HAD50/mL，6 頭最大滴度區(qū)間為103～104HAD50/mL。攻毒前，6 頭已轉(zhuǎn)為陰性，但仍有4 頭滴度為102～103HAD50/mL。

免疫豬攻毒（ASFV-G，103HAD50，肌肉注射）后，21 d 觀察期內(nèi)，所有豬只均存活。但體溫監(jiān)測結(jié)果顯示，102HAD50接種組有3 頭，104HAD50接種組有4 頭體溫一過性升高。攻毒后第4 天或第7 天的病毒血癥監(jiān)測顯示，102HAD50接種組中，3頭檢測為陰性，6 頭滴度區(qū)間為102～103HAD50/mL，1 頭為104.55HAD50/mL。利用建立的疫苗株和攻毒株鑒別PCR 方法檢測，結(jié)果3 頭同時檢出疫苗株和攻毒株，5 頭檢測出疫苗株。104HAD50接種組中，3頭檢測為陰性，4 頭滴度區(qū)間為102～104HAD50/mL，3 頭滴度區(qū)間為104～107HAD50/mL（最高為106.12HAD50/mL）。鑒別PCR 檢測結(jié)果顯示，4 頭同時檢出疫苗株和攻毒株，剩余6 頭均檢測出疫苗株。以上數(shù)據(jù)說明，雖然ASFV-G-ΔMGF 免疫后可以保護(hù)豬只抵御強(qiáng)毒株攻擊，但在30%～40%的豬體中仍能檢測到強(qiáng)毒株感染，此外在出現(xiàn)一過性體溫升高的接種豬中大多數(shù)（6/7）能檢測到強(qiáng)毒株核酸。以上試驗數(shù)據(jù)說明，使用ASFV-G-ΔMGF作為減毒活疫苗仍存在一定安全風(fēng)險，需要進(jìn)一步評估其接種動物導(dǎo)致慢性病發(fā)展的長期影響。2020 年Chen 等[1]對構(gòu)建的多種ASFV 基因缺失株HLJ/18-6GD（刪除編碼MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L 和MGF360-14L 蛋白的基因）進(jìn)行了安全性評價。雖然HLJ/18-6GD 與ASFV-G-ΔMGF 兩個毒株使用的母本種毒不同，后者構(gòu)建使用的種毒是格魯吉亞分離株（ASFV-G），前者構(gòu)建使用的種毒是黑龍江2018 年分離株（HLJ/18），但這兩個種毒均為基因II 型強(qiáng)毒株，序列高度相似。因此，HLJ/18-6GD 的相關(guān)研究數(shù)據(jù)可以為ASFV-G-ΔMGF 提供一定參考（表1）。HLJ/18-6GD 接種豬后（103和105TCID50，肌肉注射），21 d 觀察期內(nèi)無體溫及臨床異常表現(xiàn)，表明其具備良好安全性。攻毒后HLJ/18-6GD 接種豬觀察期內(nèi)均存活，但其心、肺、脾、扁桃體、胸腺和5 個淋巴結(jié)（腸淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、支氣管淋巴結(jié)和胃肝淋巴結(jié)）可檢測出不同拷貝數(shù)病毒，表明該缺失株具備一定功效。

表1 ASFV-G-ΔMGF 和HLJ/18-6GD 疫苗株首次評價相關(guān)數(shù)據(jù)資料

表2 ASFV-G-ΔMG 和HLJ/18-6GD 疫苗株毒力返強(qiáng)試驗相關(guān)數(shù)據(jù)資料

2 二次接種及傳代細(xì)胞培養(yǎng)株驗證

為進(jìn)一步評價ASFV-G-ΔMGF 的安全性和有效性，受碩騰公司（Zoetis）委托和資助，德國弗里德里?！だ辗蚶昭芯吭海‵riedrich-Loeffler-Institut，F(xiàn)LI）開展了對該毒株的相關(guān)評價[3-4]。此次試驗共設(shè)置了2 組研究，分別使用了2 種細(xì)胞擴(kuò)繁種毒，A 組使用的是外周血單核細(xì)胞（PBMC），B組使用的是一種商品化傳代細(xì)胞系（背景不詳，由碩騰公司提供）。A 組和B 組均進(jìn)行了2 次肌肉注射接種（間隔3 周），每組5 頭豬，A 組接種劑量為104HAD50，B 組為103HAD50。兩組豬接種后均表現(xiàn)正常，只有1 頭豬（B 組）在第12 天時體溫升至40.5 ℃但很快恢復(fù)。病毒血癥監(jiān)測結(jié)果顯示：A 組接種后有2 頭豬出現(xiàn)病毒血癥，基因拷貝數(shù)分別為2.8×100copies/5 μL（第7 天）和2.0×102copies/5 μL（第21 天）；B 組接種后有2 頭豬出現(xiàn)低拷貝病毒血癥，基因拷貝數(shù)分別為3.5×100copies/5 μL（第7 天）和1.0×100copies/5 μL（第14 天）。

2 次免疫后（第42 天），兩組均使用基因II型Armenia 2008 強(qiáng)毒株進(jìn)行口鼻腔攻毒（鼻腔接種0.5 mL，口腔接種1.0 mL）。后經(jīng)重新滴度評估，A 組接種滴度約為104HAD50，B 組約為105HAD50。兩組攻毒后，在28 d 觀察期內(nèi)均沒有任何體溫和臨床異常表現(xiàn)。排毒/帶毒檢測結(jié)果顯示，A 組拭子全部為陰性，但有2 頭豬出現(xiàn)病毒血癥，基因拷貝數(shù)分別為2.0×10-1copies/5 μL（攻毒后第4 天）和3.7×10-1/3.2×10-2copies/5 μL（攻毒后第10/14 天），最終只有1 頭豬的剖解組織樣本檢測為陽性，分別為肺臟（1.1×100copies/5 μL）和腘淋巴結(jié)（8.7×101copies/5 μL）。相反，B 組所有拭子、血樣和組織樣本全部為陰性。病理觀察結(jié)果顯示：A 組中除有1 頭豬存在輕度肺實變，腎臟與胃肝淋巴結(jié)變暗變紅外，其余豬只沒有任何病理形態(tài)學(xué)異常；B 組中除有3 頭豬的氣管、支氣管、腎臟和胃肝淋巴結(jié)變暗變紅外，其余臟器和豬只沒有任何表觀異常。以上數(shù)據(jù)說明：2 次免疫后攻毒，90%的豬（9/10）在試驗結(jié)束時已無法從組織和血液中檢測到疫苗株和攻毒株；使用商品化傳代細(xì)胞系繁殖的種毒（B 組）與使用外周血單核細(xì)胞繁殖的種毒（A 組）在動物試驗評價中差異不顯著。比較之前單次接種的動物試驗數(shù)據(jù)[2]，2 次免疫接種可以進(jìn)一步減少病毒血癥，效果更好。

3 野豬口服接種評價

為評價ASFV-G-ΔMGF 作為野豬口服疫苗的可能性，碩騰公司聯(lián)合德國FLI 進(jìn)行了野豬口服接種的免疫攻毒評價。研究[3]發(fā)現(xiàn)：8 頭6 月齡野豬口腔接種ASFV-G-ΔMGF（105HAD50）后，28 d 觀察期內(nèi)無任何臨床異常表現(xiàn)；病毒血癥監(jiān)測結(jié)果顯示，在第21 天有3 頭豬檢測為陽性，基因拷貝數(shù)分別為9.7×101、3.3×101和1.2×100copies/5 μL。

疫苗接種后第28 天，使用基因II 型Germany 2020 強(qiáng)毒株進(jìn)行口鼻接種攻毒（鼻腔接種0.5 mL，口腔接種1.0 mL，104HAD50），結(jié)果有2 頭豬自第5 天時出現(xiàn)食欲減退和活動減少，并最終分別在第8 天和第9 天死亡。另有3 頭豬雖然在第5 天和第9 天出現(xiàn)了輕微的食欲和活動減少，但最終都恢復(fù)正常。排毒/帶毒檢測結(jié)果顯示，攻毒后第21天有3 頭豬的血液樣品檢測為陽性，2 頭死亡豬的所有臟器檢測均為強(qiáng)陽性（高達(dá)105gc），3 頭豬的個別組織/淋巴結(jié)檢測為弱陽性（小于10 gc），3 頭豬的組織樣品檢測為陰性。病理觀察結(jié)果顯示，2 頭死亡豬病變較重，出現(xiàn)漿液性腹膜炎和胸腔積液，脾臟腫大，腎臟、各種淋巴結(jié)和胃腸道輕度至重度出血等。剩下的6 頭豬表現(xiàn)非常輕微的病變，包括肝、胃和腎淋巴結(jié)變紅，其中3 頭豬的脾臟表現(xiàn)輕度至中度腫大、易碎等。該試驗發(fā)現(xiàn)，口服免疫接種后并非所有豬都能產(chǎn)生抗體（第21 天轉(zhuǎn)陽率為50%），較明顯的趨勢是但凡產(chǎn)生抗體的豬都能產(chǎn)生攻毒保護(hù)能力。有趣的是，有2 頭抗體陰性豬也最終抵御了強(qiáng)毒株攻擊，其原因可能是，豬只之間的個體差異，Germany 2020 或有一定毒力減弱，或免疫接種誘導(dǎo)產(chǎn)生了一定保護(hù)等。

綜上所述，1 次單劑量口服接種至少可以使50%的野豬產(chǎn)生攻毒保護(hù)能力，但不可否認(rèn)，可能由于病毒攝入的差異，口鼻接種存在一定的不確定性，而動物的行為、唾液中的蛋白酶水平以及黏膜的易感性等都可能存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致整個試驗系統(tǒng)/數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差。

4 毒力返強(qiáng)評價

根據(jù)獸醫(yī)產(chǎn)品注冊技術(shù)要求國際合作準(zhǔn)則中關(guān)于毒力返強(qiáng)的試驗要求（歐盟文件EMA/CVMP/VICH/1052/2004）[6]，德國FLI 開展了該毒株的毒力返強(qiáng)相關(guān)評價[5]。該試驗將疫苗種毒在豬體內(nèi)連續(xù)傳5 代（每組10 頭豬，肌肉注射）。第1 代接種劑量為1.75×106HAD50/mL，接種后第7 天（據(jù)之前試驗數(shù)據(jù)，此時的病毒含量最高[3]）測定血液和組織中的病毒含量，將最高滴度的組織懸浮液接種第2 代，后面以此類推。經(jīng)計算，第1 代至第4代制備的組織懸浮液（等同于第2 代至第5 代的病毒接種液）的滴度分別為104.25、102.25、104.00和105.75HAD50/mL。臨床觀察數(shù)據(jù)顯示：第1 代接種豬無發(fā)熱及臨床異常；第2 代接種豬有3 頭豬出現(xiàn)了一過性體溫升高，體溫最高為40.4 ℃；從第3代開始，有接種豬出現(xiàn)最高42.1 ℃的高燒（接種后第5 天和第6 天）；第5 代時，10 頭接種豬中有9 頭出現(xiàn)過41 ℃的體溫（部分持續(xù)超過1 d），伴隨著體溫升高，部分豬只還出現(xiàn)了輕度至中度的食欲和精神不振等。雖然有體溫升高，但最終所有豬只均恢復(fù)正常。在第5 代的21 d 觀察期結(jié)束時，所有豬只在臨床上是健康的，但其中1 頭豬（21 號）在接種后立即出現(xiàn)了右前腿感覺和運(yùn)動功能完全喪失。經(jīng)地塞米松治療無效后，出于倫理考慮，該豬只在第7 天時被實施安樂死。病理檢測結(jié)果顯示，第1 代到第5 代的豬均能檢測到極少的病變，即淋巴結(jié)輕微腫大和肺實變等，但將病變與傳代次數(shù)進(jìn)行分析時，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性及差異。以上數(shù)據(jù)說明，隨著傳代次數(shù)增加，病毒似乎有毒力變強(qiáng)跡象，但并不十分明顯。

每一代接種豬第7 天剖殺的組織樣品（脾臟、扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)和血液等）病毒載量檢測結(jié)果顯示：第1 代接種豬的組織病毒拷貝數(shù)均小于7.2×101copies/5 μL，其中還有2 頭豬未檢測到病毒核酸；第2 代接種豬的組織病毒拷貝數(shù)均小于7.2×101copies/5 μL，其中還有5 頭豬未檢測到病毒核酸；從第3 代開始，每頭豬的組織樣品中至少有1 份檢測為陽性，最高拷貝數(shù)可達(dá)1.8×103copies/5 μL；到第4 代時，所有樣品均檢測為陽性，最大拷貝數(shù)為2.6×103copies/5 μL；最后在第5 代時，所有樣品均檢測為陽性，血液滴度與第4 代相似，但組織中的拷貝數(shù)略低于第4 代（第21 天剖解），其中在第7 天被實施安樂死的21 號豬拷貝數(shù)最大，達(dá)2.6×103copies/5 μL。以上數(shù)據(jù)說明，隨著傳代次數(shù)增加，病毒感染程度有變強(qiáng)跡象，但這也可能是由接種劑量增大導(dǎo)致的。

對各代次代表樣品進(jìn)行病毒全基因測序，結(jié)果在第4 代的2 個樣品中發(fā)現(xiàn)了1 個基因組5'末端出現(xiàn)大范圍基因缺失的變異株（命名為ΔMGFnV）。ΔMGFnV 除缺失11 197 bp（涉及18 個基因）外，還在基因組3' 端出現(xiàn)了1 個18 592 bp 的重復(fù)序列。該重復(fù)序列以反向互補(bǔ)方向與5'端結(jié)合，導(dǎo)致29 個基因重復(fù)。隨后進(jìn)一步對所有樣品進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該變異株在第1 代接種豬（1081 號）中就已出現(xiàn)，該變異株與原始種毒混合存在；第2 代接種豬中，有2 頭豬感染ΔMGFnV，其中1 頭是混合感染；第3 代和第4 代所有接種豬均感染ΔMGFnV，且每代次均有9 頭豬是混合感染；至第5 代時，4 頭豬單一感染ΔMGFnV，6 頭豬同時感染ΔMGFnV 和原始種毒。以上數(shù)據(jù)說明，ΔMGFnV 在出現(xiàn)變異后的混合連續(xù)傳代過程中，感染比例逐步增加，呈現(xiàn)出更強(qiáng)的復(fù)制能力。雖然第5 代接種豬中，單獨(dú)感染ΔMGFnV 的豬和混合感染的豬沒有臨床差異，但第5 代接種豬體溫普遍上升等情況的出現(xiàn)可能與ΔMGFnV 有關(guān)。Chen 等[1]的毒力返強(qiáng)試驗顯示：對6 頭豬接種HLJ/18-6GD（107TCID50，肌肉注射）第1 代后，體溫正常，但有4 頭豬血液帶毒（滴度最高為6.1 log10），1 頭豬脾臟帶毒；第2～6 代均使用上一接種代次的帶毒血液進(jìn)行接種（第2～5 代接種3 頭豬，第6 代接種5 頭豬），結(jié)果自第2 代開始，血液和組織的帶毒比例和滴度逐漸升高，第5 和第6 代時，絕大多數(shù)評價組織（心臟、肝臟、脾臟腎臟、扁桃體和胸腺等）和淋巴結(jié)（腸、腹股溝、頜下、支氣管和胃肝淋巴結(jié)）均已帶毒，病毒血癥滴度最高達(dá)9.4 log10，且最終每組均有1 頭豬死亡。以上數(shù)據(jù)說明，HLJ/18-6GD 有毒力返強(qiáng)風(fēng)險。

5 小結(jié)

AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）使用的細(xì)胞系為DMAC（Diep's Macrophage cell）。該細(xì)胞系是一種永生化的傳代細(xì)胞系（具體背景不詳）。AVAC ASF LIVE 在越南的成功上市，首次將ASFV 傳代細(xì)胞系適應(yīng)株應(yīng)用于臨床研究，這對于ASF 疫苗研究具有重要意義。相比原代細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗候選株（如ASFV-G-ΔI177L、HLJ/18-7GD、CN2018 ΔMGF/ΔCD2v 和CN2018-LVR等），傳代細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗候選株批次之間差異可能更小，細(xì)胞質(zhì)控可能更便捷，這使得AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）具有更可靠的生產(chǎn)優(yōu)勢。但結(jié)合現(xiàn)有的種毒試驗數(shù)據(jù)（原代細(xì)胞培養(yǎng)、傳代細(xì)胞培養(yǎng)、相似種毒且缺失基因相似）分析，ASFV-G-ΔMGF 似乎優(yōu)勢并不明顯，特別是ASFVG-ΔMGF 接種后未能清除強(qiáng)毒株感染，且毒力返強(qiáng)數(shù)據(jù)并不理想。國內(nèi)研究證明，與ASFV-G-ΔMGF類似的HLJ/18-7GD（分別刪除編碼MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L 和CD2v 蛋白的基因）對妊娠母豬具備良好的安全性[1]。但與ASFV-GΔI177L相似，ASFV-G-ΔMGF仍缺乏很多研究數(shù)據(jù)，如是否能發(fā)生垂直傳播、基因重組，以及基因I 型的交叉保護(hù)能力等。這使得大規(guī)模應(yīng)用后不確定性事件仍有可能發(fā)生，因此仍需進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)測評估，不斷優(yōu)化毒株工藝（如2 次免疫等），以最大化發(fā)揮弱毒疫苗的功效。