動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室廢棄物分類高壓滅菌程序探索

曾薈燕，王團(tuán)結(jié)，李婉清，李 強(qiáng)，孟伯龍，郭桐同，李倩琳，楊成崗，門星光，張廣川

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

2021 年實(shí)施的《中華人民共和國生物安全法》對(duì)病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全提出了明確要求，指出病原微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)廢棄物的管理，依法對(duì)廢水、廢氣以及其他廢棄物進(jìn)行處置，采取措施防止污染[1]?！恫≡⑸飳?shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》亦提出實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)依照環(huán)境保護(hù)的有關(guān)法律、行政法規(guī)和國務(wù)院有關(guān)部門的規(guī)定，對(duì)廢水、廢氣以及其他廢棄物進(jìn)行處置，并制定相應(yīng)環(huán)境保護(hù)措施，防止環(huán)境污染[2]。由此可見，對(duì)實(shí)驗(yàn)室廢棄物的有效滅菌處理，是實(shí)驗(yàn)室生物安全的重要組成部分。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室被處理對(duì)象的生物危害程度和采取的防護(hù)措施，生物安全實(shí)驗(yàn)室分為微生物生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4）和動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室（ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4）[3]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室種類不同，實(shí)驗(yàn)活動(dòng)產(chǎn)生的廢棄物種類亦有差異。微生物生物安全實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢棄物主要為試驗(yàn)耗材（如吸管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、鑷子、離心管等）和個(gè)人防護(hù)用品，動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢棄物主要為動(dòng)物尸體、動(dòng)物排泄物、個(gè)人防護(hù)用品及試驗(yàn)耗材。

高壓滅菌是通過破壞或滅活生物因子對(duì)試驗(yàn)材料滅菌和廢棄物去污染的最有效和可靠的方法，不同類型的廢棄物通常需要不同的操作周期以達(dá)到適當(dāng)?shù)臏缁顪囟萚4]?？紤]到動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室廢棄物種類多，且滅菌時(shí)裝載量較大，需要對(duì)廢棄物的滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證，以確保實(shí)驗(yàn)室生物安全。本研究通過對(duì)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢棄物進(jìn)行分類，探索了不同種類廢棄物合理的高壓滅菌程序，以期為動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

生物安全型脈動(dòng)真空滅菌器（ 型號(hào)BIST-P3）、化學(xué)指示卡（批號(hào)22809）、生物指示劑（批號(hào)22F02），均購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)GNP-9270），購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雞、鴨、兔、鼠等小動(dòng)物尸體，豬、牛、羊等大動(dòng)物尸體，糞膜所收集的禽類糞便，豬、牛、羊、兔等飼養(yǎng)動(dòng)物的袋裝糞便，以及防護(hù)服、利器盒、過期飼料和廢棄墊料等一般廢棄物，均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所ABSL-1 和ABLS-2 實(shí)驗(yàn)室；高壓滅菌袋（規(guī)格870 mm×760 mm），購自長(zhǎng)沙湘安環(huán)?？萍加邢薰?；不銹鋼高壓滅菌箱（規(guī)格尺寸50 cm×40 cm×30 cm，箱體兩側(cè)帶有透氣孔），購自北京宇軒宏達(dá)科技有限公司。

1.2 廢棄物分類及高壓前預(yù)處理

根據(jù)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動(dòng)物試驗(yàn)活動(dòng)產(chǎn)生的廢棄物種類，將廢棄物分為5 類：小動(dòng)物尸體（雞、鴨、鼠、兔等）、大動(dòng)物尸體（豬、牛、羊等）、禽類糞便以及豬、牛、羊等動(dòng)物的袋裝糞便和一般廢棄物（防護(hù)服、利器盒、過期飼料和墊料等）。

小動(dòng)物尸體處理，是將小動(dòng)物腹部剖開并裝入高壓滅菌袋中；大動(dòng)物尸體處理，是將動(dòng)物的頭及四肢肢解，并將胸腔和腹腔剖開后放入高壓滅菌袋中；禽類糞便，由鋪設(shè)在隔離器底部的糞膜卷軸旋轉(zhuǎn)收集；一般廢棄物，是將防護(hù)服、利器盒、過期飼料和廢棄墊料等物品置于高壓滅菌袋中。以上物品的高壓滅菌袋置于滅菌箱后體積不可超過滅菌箱的2/3。袋裝糞便是豬、牛、羊、兔等動(dòng)物糞便，可直接收集到高壓滅菌袋中。高壓前將滅菌袋中的糞便平鋪在滅菌箱中，平鋪高度不超過10 cm。所有裝有廢棄物的高壓滅菌袋袋口用專用膠帶適度包扎，不要過緊[5]。

基于實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理流程，在試驗(yàn)活動(dòng)中產(chǎn)生的動(dòng)物尸體、糞便及墊料無法被實(shí)時(shí)高壓滅菌處理時(shí)，需暫存于冷庫[6]。高壓前先對(duì)此類廢棄物進(jìn)行解凍。廢棄物解凍是在滅菌前將廢棄物置于脈動(dòng)真空滅菌器中，通過流經(jīng)鍋體夾套中的蒸汽進(jìn)行解凍，4 h 后再對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌處理。

所有廢棄物高壓滅菌驗(yàn)證均在滅菌器滿載的情況下進(jìn)行[7]。滅菌器置物架上、下兩層各放置11 箱高壓滅菌箱，22 個(gè)滅菌箱之間保留適當(dāng)空隙，確保蒸汽能夠順利穿透。

1.3 生物指示劑和化學(xué)指示卡放置方法

小動(dòng)物尸體的化學(xué)指示卡和生物指示劑放置于尸體的腹腔內(nèi)部，大動(dòng)物尸體的放置于尸體肌肉里層，禽類糞便的放置于糞膜卷軸中心位置，豬、牛、羊等動(dòng)物袋裝糞便的放置于糞便底層，一般廢棄物的放置于每個(gè)滅菌箱內(nèi)廢棄物的中心位置[8]。

1.4 滅菌器程序設(shè)定

將滅菌器預(yù)設(shè)程序中的滅菌溫度121 ℃、排空上限80 kPa、脈動(dòng)次數(shù)4 次設(shè)置為固定參數(shù)。根據(jù)滅菌器使用說明，初始以30 min 作為1 個(gè)滅菌時(shí)間單位，每間隔30 min 設(shè)置1 個(gè)滅菌時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行滅菌驗(yàn)證；將小動(dòng)物尸體、禽類糞便、一般廢棄物的排空下限設(shè)置為-80 kPa。因袋裝糞便與大動(dòng)物尸體含有液體成分較多，排空下限不宜太低，設(shè)置為-10 kPa。

1.5 結(jié)果判定

高壓滅菌結(jié)束后，取出生物指示劑和化學(xué)指示卡。觀察化學(xué)指示卡變色情況，若達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)色或深于標(biāo)準(zhǔn)色，則滅菌合格；若顏色淺于標(biāo)準(zhǔn)色，則滅菌失敗。采用專用夾具，夾破生物指示劑的內(nèi)含培養(yǎng)基，將生物指示劑置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱，同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對(duì)照，56 ℃培養(yǎng)48 h。當(dāng)陰陽性對(duì)照成立時(shí)，若培養(yǎng)液保持紫色，則滅菌合格；若培養(yǎng)液變成黃色，則滅菌失敗。只有生物指示劑和化學(xué)指示卡均指示合格時(shí)，才表示滅菌合格。

2 結(jié)果

2.1 小動(dòng)物尸體

結(jié)果（表1）顯示，當(dāng)滅菌時(shí)間為30 min 時(shí)，22 箱被滅菌物品中，14 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果為合格，8 箱為不合格。當(dāng)滅菌時(shí)間為60、90 min 時(shí)，22 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑滅菌結(jié)果均為合格。

表1 小動(dòng)物尸體滅菌結(jié)果

2.2 大動(dòng)物尸體

結(jié)果（表2）顯示，當(dāng)滅菌時(shí)間為30 min 時(shí)，有5 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果為合格，17 箱為不合格；當(dāng)滅菌時(shí)間為60 min 時(shí)，13箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果為合格，9 箱為不合格；當(dāng)滅菌時(shí)間為90 min 時(shí)，22 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為合格。

表2 豬、牛、羊等大動(dòng)物尸體滅菌結(jié)果

2.3 禽類糞便

結(jié)果（表3）顯示，當(dāng)滅菌時(shí)間為30 min 時(shí)，22 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為不合格；當(dāng)滅菌時(shí)間為60 min 時(shí)，11 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果為合格，11 箱為不合格；當(dāng)滅菌時(shí)間為90 min 時(shí)，16 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果為合格，6 箱為不合格。因90 min 未達(dá)到滅菌效果，將滅菌時(shí)間延長(zhǎng)至120 min。當(dāng)滅菌時(shí)間為120 min 時(shí)，22 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為合格。

表3 禽類糞便滅菌結(jié)果

2.4 袋裝糞便

結(jié)果（表4）顯示，當(dāng)滅菌時(shí)間為30 min 時(shí)，7 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為合格，15 箱為不合格；當(dāng)滅菌時(shí)間為60 min 時(shí)，18箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為合格，4 箱為不合格；當(dāng)滅菌時(shí)間為90 min 時(shí)，22 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為合格。

表4 豬、牛、羊等動(dòng)物袋裝糞便滅菌結(jié)果

2.5 一般廢棄物

結(jié)果（表5）顯示，當(dāng)滅菌時(shí)間分別為30、60、90 min 時(shí)，22 箱廢棄物的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為合格。

表5 一般廢棄物滅菌結(jié)果

2.6 廢棄物滅菌程序確定

分別選取5 種廢棄物首次通過滅菌試驗(yàn)的滅菌參數(shù)進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重復(fù)試驗(yàn)的化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果均為合格，因此確定5 種廢棄物的滅菌參數(shù)如表6 所示。

表6 廢棄物滅菌參數(shù)

3 討論

3.1 高壓滅菌溫度和時(shí)間的重要性

采用滅菌器預(yù)設(shè)程序?qū)?dòng)物尸體和動(dòng)物糞便進(jìn)行高壓滅菌時(shí)，有部分化學(xué)指示卡和生物指示劑結(jié)果為滅菌失敗。在后續(xù)試驗(yàn)中，通過對(duì)滅菌程序的滅菌時(shí)間、脈動(dòng)下限等參數(shù)優(yōu)化處理，實(shí)現(xiàn)了廢棄物的可靠滅菌。

影響高壓滅菌效果的因素有很多，比如溫度、時(shí)間、脈動(dòng)方式、滅菌包質(zhì)量、滅菌器是否漏氣等[9-12]。一個(gè)滅菌程序?qū)ξ⑸锏闹滤佬?yīng)主要由兩大因素決定，即溫度和時(shí)間[13]。只要被滅菌對(duì)象的中心溫度達(dá)到設(shè)定溫度，維持一定時(shí)間就可實(shí)現(xiàn)滅菌。而其他影響因素是為熱蒸汽能夠快速穿透物品提供便利。例如有研究[14]表明，排空方式為上限80 kPa、下限-80 kPa 比上限80 kPa、下限0 kPa 具有更徹底的冷空氣排除效果，進(jìn)而為飽和蒸汽的快速、充分滲入提供了條件。工作中，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況綜合考慮飼養(yǎng)動(dòng)物的便利性和廢棄物的無害化處理，如采用卷糞膜的方式收集禽類糞便可以提高工作效率，但因糞便被多層塑料膜包裹，其中心部位需要很長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到滅菌溫度，因此需通過延長(zhǎng)滅菌時(shí)間（120 min）實(shí)現(xiàn)滅菌效果。同時(shí)，對(duì)于開展高致病性病原微生物試驗(yàn)活動(dòng)產(chǎn)生的廢棄物，需采用多層包裝和袋口扎緊等措施保障生物安全，在高壓滅菌時(shí)可通過調(diào)整脈動(dòng)次數(shù)和延長(zhǎng)滅菌時(shí)間等方式實(shí)現(xiàn)可靠滅菌。

3.2 廢棄物分類高壓的重要性

動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室的廢棄物種類較多，涉及動(dòng)物尸體、動(dòng)物排泄物、動(dòng)物墊料、防護(hù)用品以及試驗(yàn)耗材等。目前國內(nèi)尚缺乏動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室廢棄物的消毒技術(shù)規(guī)范，滅菌器的說明書也僅是提供預(yù)設(shè)程序。高壓蒸汽滅菌器作為廢棄物無害化處理的有效方式，必須對(duì)其進(jìn)行規(guī)范管理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室器械、感染性廢棄物、動(dòng)物尸體等不同的消毒滅菌對(duì)象，建立各項(xiàng)規(guī)章制度和操作規(guī)程[15]。因此，動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)廢棄物種類進(jìn)行分類高壓，保證滅菌效果。除確保實(shí)驗(yàn)室生物安全外，分類高壓還能優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室廢棄物處置程序，提高實(shí)驗(yàn)室廢棄物無害化處理效率。

3.3 廢棄物高壓驗(yàn)證的重要性

廢棄物去污染處理后，必須定期對(duì)消毒滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證措施包括物理驗(yàn)證和微生物驗(yàn)證，同時(shí)壓力蒸汽滅菌器有多種滅菌程序，也應(yīng)對(duì)每一種程序分別驗(yàn)證[7，16]。動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行廢棄物滅菌前，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室滅菌設(shè)備體積大小、廢棄物種類及廢棄物包裝大小，開展高壓滅菌驗(yàn)證。然后根據(jù)滅菌結(jié)果，制定本單位廢棄物高壓滅菌標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并對(duì)廢棄物的滅菌程序、廢棄物包裝尺寸、廢棄物類別、滅菌時(shí)袋口狀態(tài)等作出明確規(guī)定。對(duì)采用相同高壓程序?qū)崿F(xiàn)廢棄物滅菌的，在實(shí)際工作中可一同高壓，否則應(yīng)分類、分次進(jìn)行高壓。

3.4 加強(qiáng)動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室消毒技術(shù)規(guī)范建設(shè)

我國于2002 年發(fā)布的《消毒技術(shù)規(guī)范》[17]對(duì)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)廢棄物處理作了明確要求，但涉及動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室及微生物生物安全實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理時(shí)，尚屬欠缺。通常情況下，后者參考《消毒技術(shù)規(guī)范》開展相關(guān)工作。生物安全是國家安全的重要組成部分，因此建議加強(qiáng)各級(jí)動(dòng)物生物安全試驗(yàn)室消毒技術(shù)規(guī)范建設(shè)，確保實(shí)驗(yàn)室廢棄物無害化處理，保障生物安全。