基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清腎顆粒主要藥物治療慢性腎臟病作用機(jī)制

孫璇君，金華，張磊，王億平

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是由各種原因造成的腎臟結(jié)構(gòu)和/或功能異?；虿幻髟蚰I小球?yàn)V過(guò)率下降（＜60 mL/min·1.73 m2）超過(guò)3個(gè)月[1]。研究表明，CKD流行性廣、發(fā)病率高[2-3]，其防治工作至關(guān)重要。清腎顆粒是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院開(kāi)發(fā)的院內(nèi)制劑，為治療CKD常用方，相關(guān)臨床研究表明，其可達(dá)到改善腎功能及并發(fā)癥的目的[4-6]，目前尚未進(jìn)行藥理機(jī)制研究。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，選取清腎顆粒的君藥、臣藥及重要使藥，即大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參，探討其治療CKD的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點(diǎn)獲取

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.tcmsp-e.com/），分別以大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參為檢索詞，以口服生物利用度（OB）≥30%且類(lèi)藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得上述成分的SDF結(jié)構(gòu)，并將上述成分導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)，以藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)值＞0作為篩選條件。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取

以“chronic renal failure”為關(guān)鍵詞，分別檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://previous.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https://ngdc.cncb.ac.cn/）獲取CKD相關(guān)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值，獲取CKD靶點(diǎn)。

1.3 中藥成分-疾病靶點(diǎn)獲取

將以上4味中藥活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)及CKD靶點(diǎn)輸入Venny2.1 平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，得到4味中藥治療CKD潛在靶點(diǎn)。

1.4 中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將4 味中藥活性成分及治療CKD 潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，使用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯瑯?gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。按照degree值大小排序，degree值與重要性呈正相關(guān)。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.3”項(xiàng)中交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），設(shè)置為“Homo sapiens”，交互分?jǐn)?shù)≥0.4，構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并下載.tsv格式文件。

1.6 核心靶點(diǎn)篩選

利用Cystoscape3.7.2 軟件的Network Analyzer 插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算出degree值、中介中心性（BC）、平均最短路徑長(zhǎng)度（ASPL）和緊密中心性，結(jié)果以degree值排序，使用R3.6.1對(duì)前30個(gè)靶點(diǎn)繪制條形圖。將“1.5”項(xiàng)中的.tsv文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用MCODE模塊進(jìn)行基因簇分析，以基因分值大于平均分作為核心靶點(diǎn)篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 GO功能與KEGG通路富集分析

利用R3.6.1 調(diào)用BiocManager、ClusterPr ofiler 等程序包，以P＜0.05、Q＜0.05為篩選條件，進(jìn)行GO功能分析，包括細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物過(guò)程（BP）。利用ClusterProfiler、org.Hs.eg.db等軟件包進(jìn)行KEGG通路富集分析，利用pathview包繪制信號(hào)通路圖，根據(jù)P值排序，選取前20位繪圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及作用靶點(diǎn)收集

通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲取大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參活性成分99種，藥物靶點(diǎn)873個(gè)。將活性成分按degree值排序，排名前10位見(jiàn)表1，包括槲皮素、木犀草素、丹參醇A等活性成分。

表1 白花蛇舌草、大黃、丹參、黃連活性成分

2.2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)檢索OMIM、GeneCards、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)，去重后獲得1 010個(gè)CKD相關(guān)靶點(diǎn)。將CKD相關(guān)靶點(diǎn)與藥物活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)取交集，得到102個(gè)交集靶點(diǎn)，即為大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參治療CKD的潛在靶點(diǎn)。利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。

圖1 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將102個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到由102個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 250條邊構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2）。導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，利用Network Analyzer工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵傩?，核心靶點(diǎn)的基因分值以大于平均分作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并使用R3.6.1對(duì)前30個(gè)靶點(diǎn)繪圖（見(jiàn)圖3），由大到小排序，前5位核心靶點(diǎn)依次為VEGFA、EGFR、AKT1、SRC、STAT3。

圖2 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 基于拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)篩選（前30位）

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析結(jié)果

將102 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入R3.6.1，進(jìn)行GO 功能與KEGG通路富集分析。其中GO富集分析得到2 212個(gè)BP條目、36個(gè)CC條目、126個(gè)MF條目。BP主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、蛋白質(zhì)自身磷酸化、肌肉細(xì)胞增殖等；CC主要涉及薄膜筏、膜微疇、膜區(qū)域、質(zhì)膜筏、細(xì)胞頂端部分、頂端質(zhì)膜、焦點(diǎn)黏附、細(xì)胞-基質(zhì)黏附體連接等；MF主要包括蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、生長(zhǎng)因子結(jié)合、胰島素受體底物結(jié)合等。根據(jù)P值選取各項(xiàng)前20條目繪圖，見(jiàn)圖4。

圖4 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD靶點(diǎn)GO功能富集分析

共得到143條KEGG通路，靶點(diǎn)主要富集于缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。按照P值選取前20條目繪制條形圖，見(jiàn)圖5。

圖5 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

引起CKD的原因很多，如急/慢性原發(fā)性腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、腎病綜合征，代謝性疾病如高血壓病、1型或2型糖尿病、高尿酸血癥，結(jié)締組織病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗中性粒細(xì)胞抗體血管炎等。西醫(yī)治療多為單靶點(diǎn)治療，鑒于CKD機(jī)制的復(fù)雜性，需要多靶點(diǎn)、多通路進(jìn)行治療。研究表明，中醫(yī)藥防治CKD作用顯著[7]。清腎顆粒中大黃味苦性寒，具有瀉下清熱、解毒逐瘀之功，為君藥，黃連、白花蛇舌草及丹參具有清熱利濕、化瘀泄?jié)嶂8]。

治療CKD除針對(duì)原發(fā)病治療之外，中醫(yī)藥防治也至關(guān)重要。清腎顆?？梢燥@著改善患者血肌酐、尿素氮，減輕大小鼠腎臟炎癥及纖維化，調(diào)節(jié)免疫及糾正貧血，并通過(guò)不同信號(hào)通路如PI3K-Akt、Janus激酶信號(hào)通路等實(shí)現(xiàn)對(duì)腎間質(zhì)纖維化治療作用[9-11]。Louren?o等[12]通過(guò)對(duì)CKD貓模型研究中發(fā)現(xiàn)，VEGFR在CKD模型組中表達(dá)明顯下降，且與CKD生物標(biāo)志物如血肌酐呈負(fù)相關(guān)性。Patel等[13]指出，單側(cè)輸尿管梗阻模型小鼠中的TGF-β1下游EGFR與腎纖維化呈正相關(guān)性，而Kim等[14]指出，AKT基因沉默小鼠的腎纖維化程度明顯加重。Li等[15]研究表明，SRC家族激酶對(duì)于急性腎損傷（AKI）治療發(fā)揮關(guān)鍵作用。Park等[16]研究表明，STAT3 可能影響AKI 到CKD 的發(fā)展，在此過(guò)程中，STAT3亞型有不同程度的表達(dá)。

GO富集分析結(jié)果表明，BP主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)自身磷酸化、肌肉細(xì)胞增殖等；MF主要富集于蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、生長(zhǎng)因子結(jié)合、胰島素受體底物結(jié)合等。CC主要涉及囊泡腔、前緣薄膜、嗜苯胺藍(lán)粒腔等。氨基酸代謝是CKD關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制之一，這與GO富集分析結(jié)果一致[17]。

KEGG 結(jié)果顯示，HIF-1、PI3K-Akt、Rap1、MAPK信號(hào)通路參與治療CKD。Liang等[18]研究表明，活化Rap1能調(diào)節(jié)TNF-α以控制腎纖維化。Ye等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad3 和HIF1 信號(hào)通路在老齡小鼠AKI中發(fā)揮作用。Shi等[20]指出，PI3K信號(hào)通路參與AKI過(guò)程，而Rana等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路參與CKD 小鼠發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA、EGFR、AKT1、SRC、STAT3等重要靶點(diǎn)及HIF-1、PI3K-Akt、Rap1、MAPK等重要信號(hào)通路參與CKD治療。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討中藥復(fù)方清腎顆粒中白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD的潛在活性成分可能是槲皮素、木犀草素、丹參醇A等，核心靶點(diǎn)涉及VEGFA、EGFR、AKT1，可能涉及HIF-1、PI3K-Akt、Rap1、MAPK 等信號(hào)通路。本研究為進(jìn)一步揭示清腎顆粒治療CKD的作用機(jī)制提供了新思路。但限于中藥數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)信息招募過(guò)程中潛在的遺漏，仍需開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，才能更好地闡明中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑治療CKD的生物學(xué)特性與作用機(jī)制。