基于生信分析納米銀對(duì)斑馬魚的毒性和機(jī)制

范子怡,宋 杰,楊 正,馮 晨,葛文浩,王慧利,錢秋慧 (蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009)

納米銀具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、抗菌性能以及導(dǎo)電能力,因此在生物醫(yī)療、化學(xué)和電力工程等領(lǐng)域被廣泛地應(yīng)用[1].據(jù)報(bào)道,約有30%的商用納米銀會(huì)進(jìn)入淡水環(huán)境,濃度達(dá)到約0.1g/L,而廢水和受污染河流中的濃度則更高[2].由于納米銀粒徑較小,它們極易進(jìn)入生物體內(nèi)并對(duì)其產(chǎn)生毒性作用,例如,當(dāng)納米銀濃度達(dá)到1.9×10-10mol/L 時(shí),斑馬魚胚胎就會(huì)遭受嚴(yán)重?fù)p傷[3].

納米銀的毒性效應(yīng)與其粒徑和表面涂層密切相關(guān).納米銀的粒徑可以影響細(xì)胞對(duì)其的攝取率,這是因?yàn)榧{米銀的粒徑?jīng)Q定了其比表面積,進(jìn)而影響納米銀進(jìn)入細(xì)胞或生物體的途徑以及對(duì)生物體的毒性作用[4].例如,相較于20nm 和70nm 粒徑的納米銀,4nm 粒徑的納米銀在人巨噬細(xì)胞U937 中表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激反應(yīng)[5].相似地,Kim 等[6]也證明20nm 粒徑的納米銀比110nm 的納米銀對(duì)斑馬魚胚胎具有更強(qiáng)的毒性.Lee 等[7]進(jìn)一步揭示了納米銀毒性與粒徑關(guān)系的可能機(jī)制,發(fā)現(xiàn)粒徑較小的納米銀(30～72nm)可以通過絨毛膜通道被動(dòng)進(jìn)入斑馬魚胚胎,進(jìn)而干擾其正常的發(fā)育過程.以上研究證實(shí)了納米銀的毒性效應(yīng)具有粒徑依賴性,其中較小粒徑的納米銀顯示出更強(qiáng)的毒性效應(yīng).此外,表面涂層對(duì)穩(wěn)定溶液中的納米銀起到重要作用,常見的表面涂層有檸檬酸鈉(CIT)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、多糖和表面活性劑等,其中PVP 和麥芽糖兩種涂層的納米銀因其優(yōu)異的穩(wěn)定性和生物相容性被廣泛研究和使用.一些研究還表明,納米銀的表面涂層在其毒性中發(fā)揮了重要作用.研究表明,涂層材料的不同導(dǎo)致了生物體對(duì)納米銀不同的毒性效應(yīng)和積累方式.具體來說,使用支化聚亞乙基亞胺(BPEI)作涂層的納米銀顯示出對(duì)母鼠的肝臟和大腦的毒性,且這種影響有可能延伸至后代[8].此外,斑馬魚在暴露于麥芽糖涂層納米銀后,在其鰓、肝臟和腸道中銀的積累量顯著增加,并在鰓部位出現(xiàn)炎癥和增生現(xiàn)象[9].CIT 和PVP作為涂層的納米銀能夠在大鼠體內(nèi)引起嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)炎癥[10].在比較CIT 和PVP 作為涂層時(shí),研究發(fā)現(xiàn)CIT 涂層的納米銀對(duì)斑馬魚產(chǎn)生了更強(qiáng)的神經(jīng)[11]、魚鰓和腸道毒性[12],進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了不同涂層材料對(duì)納米銀毒性影響的差異.上述研究表明,納米銀的毒性效應(yīng)與其粒徑和表面涂層密切相關(guān).

斑馬魚因其體積小、易于培養(yǎng)、胚胎透明度高、繁殖周期短、與人類高達(dá)87%的基因相似度[13],以及肝臟中眾多與哺乳動(dòng)物同源的脂質(zhì)代謝酶等特點(diǎn),在毒理學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用[14].這些特性不僅使其成為評(píng)價(jià)水生生物毒理學(xué)的理想模型,也提供了模擬人類生物響應(yīng)的有效平臺(tái).斑馬魚對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的防御機(jī)制,包括酶的誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等,與哺乳動(dòng)物相似,進(jìn)一步增強(qiáng)了其作為研究模型的價(jià)值.

隨著環(huán)境污染物研究的深入,特別是新型納米污染物如納米銀的生物安全性和環(huán)境毒理效應(yīng)成為科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn).納米銀因其獨(dú)特的理化特性及復(fù)雜多變的環(huán)境行為,對(duì)生物體可能產(chǎn)生的影響備受關(guān)注.本研究采用生物信息學(xué)方法,對(duì)不同粒徑和涂層的納米銀對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性影響進(jìn)行分析,探索其可能的毒性機(jī)制.通過整合和深入分析GEO 數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)集,全面比較納米銀的毒性特性,揭示其作用于生物體的具體機(jī)理.這種結(jié)合斑馬魚這一毒理學(xué)模型生物和生物信息學(xué)技術(shù)的方法,為納米銀的毒性評(píng)估提供了新的視角.

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)獲取、質(zhì)控和差異基因篩選

從NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的GEO 數(shù)據(jù)庫下載基因芯片數(shù)據(jù)集:GSE50718、GSE61186 和GSE89653,對(duì)這些數(shù)據(jù)集進(jìn)行一系列分析,包括表達(dá)量箱式圖、PCA 主成分分析和聚類分析.使用R 軟件的Limma 包進(jìn)行差異基因篩選.GSE50718 數(shù)據(jù)集[15]來源于韓國(guó)NEXBIO 公司,公開于2016 年1 月,試驗(yàn)生物為斑馬魚幼魚.在GSE50718 數(shù)據(jù)集中,選擇了對(duì)照組(Control)、PVP 組(PVP,0.1mg/L)、150nm PVP 涂層納米銀組(PVP-AgNPs-150nm,1mg/L)、50nm PVP 涂層納米銀組(PVP-AgNPs-50nm,1mg/L)和銀離子組(AgNO3,20μg/L),一共15 個(gè)幼魚樣本,其中空白對(duì)照組3 個(gè)樣本,四種處理組各有3 個(gè)樣本.空白對(duì)照組即未做任何處理的斑馬魚幼魚,PVP 組的濃度依據(jù)PVP 涂層納米銀組的PVP 含量(10%)所設(shè),銀離子組的濃度約為納米銀暴露在介質(zhì)中所測(cè)得的濃度.將72-hpf 幼魚暴露于上述各組藥物中96h 后,提取RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.除了暴露藥物不同,所有組均在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行.GSE61186數(shù)據(jù)集[16]來源于盧森堡科技院,公開于2015 年1 月,試驗(yàn)生物為斑馬魚幼魚.在GSE61186 數(shù)據(jù)集中,選擇了對(duì)照組(Control)和 20nm 無涂層納米銀組(AgNPs,10μg/L),一共9 個(gè)幼魚樣本,其中空白對(duì)照組6 個(gè)樣本,處理組3 個(gè)樣本.空白對(duì)照組即未做任何處理的斑馬魚幼魚,除了暴露藥物不同,所有組均在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行.GSE89653 數(shù)據(jù)集[17]來源于巴斯克大學(xué),公開于2018 年7 月,試驗(yàn)生物為斑馬魚成魚.在GSE89653 數(shù)據(jù)集中,選擇了暴露時(shí)間為21d的對(duì)照組(Control)和20nm 麥芽糖涂層納米銀組(Maltose-AgNPs,10μg/L),一共9 個(gè)成魚肝臟樣本,其中空白對(duì)照組4 個(gè)樣本,處理組5 個(gè)樣本.將4 月齡成魚暴露于上述藥物中21d 后,提取RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.空白對(duì)照組即未做任何處理的斑馬魚成魚肝臟,除了暴露藥物不同,所有組均在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行.本文將數(shù)據(jù)集中的對(duì)照組與其他處理組進(jìn)行差異分析.差異分析結(jié)果通過以下的閾值條件進(jìn)行篩選:P<0.05,|log2FC|>1.接著將篩選出的差異基因進(jìn)行交集,以探索不同粒徑和涂層的納米銀暴露組差異基因的不同.

1.2 差異基因功能富集分析

使用R 中的clusterProfile 包對(duì)各組篩選后的差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 功能富集分析,并進(jìn)行全基因集的GSEA-KEGG 富集.富集分析物種類型選擇斑馬魚,設(shè)定P閾值為0.05,使用BH 方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正.GO 分析用于注釋目標(biāo)基因的細(xì)胞組分、分子功能和生物過程.KEGG 分析用于預(yù)測(cè)和分析基因富集的生物學(xué)通路.

1.3 差異基因相互作用分析

將各組篩選后的差異基因?qū)朐诰€數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org),設(shè)定綜合分?jǐn)?shù)閾值為0.4,篩選出相互作用關(guān)系較強(qiáng)的基因.然后,利用Cytoscape3.9.0 軟件進(jìn)行可視化分析,通過生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)的形式,將高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)和分子狀態(tài)信息有機(jī)整合在一起.在Cytoscape 中,利用CytoHubba 插件中的最大團(tuán)中心度(MCC)算法進(jìn)行計(jì)算,尋找關(guān)鍵的hub 基因,以構(gòu)建納米銀/銀離子與斑馬魚胚胎基因蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò).

1.4 差異基因合并分析

由于GSE61186 數(shù)據(jù)集中的無涂層AgNPs 和GSE89653 數(shù)據(jù)集中的Maltose-AgNPs 具有相同的粒徑和濃度,本文將這兩個(gè)數(shù)據(jù)合并進(jìn)行分析,進(jìn)而通過質(zhì)控、差異基因篩選和功能富集分析以揭示涂層對(duì)納米銀毒性的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)集質(zhì)控

考慮到數(shù)據(jù)的可靠性,針對(duì)GSE50718數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)的質(zhì)量情況進(jìn)行了檢查,如圖1 所示.箱式圖顯示,數(shù)據(jù)的分布趨勢(shì)基本一致,表明數(shù)據(jù)經(jīng)過了一定標(biāo)準(zhǔn)化處理.通過PCA 主成分分析,發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)具有一定的區(qū)分度.聚類分析也展示了相關(guān)組別的分類與聯(lián)系.盡管有一組PVP 樣本被聚類到了對(duì)照組,以及一組 PVP-AgNPs-150nm 樣本被聚類到了 PVPAgNPs-50nm 組,但總體上聚類結(jié)果的區(qū)分度較高,數(shù)據(jù)具有一定的可重復(fù)性.

圖1 GEO 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控圖(GSE50718)Fig.1 Quality control chart for GEO microarray data (GSE50718)

2.2 差異基因表達(dá)分析

針對(duì)GSE50718 數(shù)據(jù)集,根據(jù)篩選條件(P<0.05,|log2FC|>1)進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析.結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,PVP(0.1mg/L)處理的斑馬魚幼魚共有171 個(gè)基因的表達(dá)被改變,其中126 個(gè)基因上調(diào),45 個(gè)基因下調(diào);在PVP-AgNPs-150nm (1mg/L)處理組中,共有300 個(gè)差異基因,其中239 個(gè)上調(diào),61 個(gè)下調(diào);在PVP-AgNPs-50nm (1mg/L)處理組中,共有1224 個(gè)差異基因,其中1106 個(gè)上調(diào),118 個(gè)下調(diào);在AgNO3(20 μg/L)處理組中,共有969 個(gè)差異基因,其中603 個(gè)上調(diào),366個(gè)下調(diào).隨后,使用R 軟件中的ggplot2包繪制了相應(yīng)的差異基因火山圖,如圖2(a～d)所示,并使用pheatmap包繪制了前50個(gè)差異基因的熱圖(圖2(e～h)),以進(jìn)行可視化的差異基因表達(dá)分析.

2.3 各組調(diào)控差異基因分析

對(duì)以上4 組以P<0.05 和|log2FC|>1 篩選條件篩選出的差異基因進(jìn)行交集分析,并通過韋恩圖進(jìn)行可視化,如圖3 所示.結(jié)果顯示,PVP 和納米銀處理組(PVP-AgNPs-50nm、PVP-AgNPs- 150nm)大部分差異基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),AgNO3組的上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)量相近.其中,PVP 與PVP- AgNPs-150nm 組共有40 個(gè)交集差異基因,PVP 與PVP-AgNPs-50nm 共有90個(gè)交集差異基因,PVP- AgNPs-150nm與PVPAgNPs-50nm 共有 172 個(gè)交集差異基因,PVPAgNPs-50nm 與AgNO3共有219 個(gè)交集差異基因(圖3a).為了進(jìn)一步說明交集差異基因的調(diào)控情況,本文對(duì)各組的上調(diào)和下調(diào)差異基因分別進(jìn)行了交集分析.PVP 與PVP-AgNPs-50nm 共有87 個(gè)上調(diào)、3 個(gè)下調(diào)交集差異基因,分別占兩組總基因數(shù)的8%和2%;PVP- AgNPs-50nm 與AgNO3共有190 個(gè)上調(diào)、20 個(gè)下調(diào)交集差異基因,分別占兩組總基因數(shù)的13%和4%;PVP-AgNPs-150nm 與PVP-AgNPs-50nm 共有153 個(gè)上調(diào)、19 個(gè)下調(diào)交集差異基因,分別占兩組總基因數(shù)的13%和12%;PVP 與PVPAgNPs-150nm 共有26 個(gè)上調(diào)、13 個(gè)下調(diào)交集差異基因,分別占兩組總基因數(shù)的8%和14%(圖3(b～i)).上述結(jié)果表明PVP- AgNPs 和AgNO3可能在許多生物過程中發(fā)揮各自的作用,并且對(duì)斑馬魚幼魚基因表達(dá)改變的程度:PVP- AgNPs-50nm > AgNO3>PVP-AgNPs-150nm.

圖3 各處理組DEGs 的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of DEGs in each treatment group

2.4 差異基因功能富集分析

為深入評(píng)估上述差異基因的生物學(xué)特性,使用R 包對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集分析,并對(duì)相關(guān)基因及其參與的生物過程進(jìn)行注釋,如圖4(a～d)所示.

圖4 各處理組DEGs 的GO、KEGG 和GSEA 富集分析Fig.4 GO, KEGG and GSEA enrichment analysis of DEGs in each treatment group

結(jié)果顯示PVP 組的差異基因顯著富集在化學(xué)檢測(cè)、感官神經(jīng)和免疫蛋白影響等生物過程;PVPAgNPs-150nm 組的差異基因主要在光周期現(xiàn)象相關(guān)的生物過程中得到富集;PVP-AgNPs-50nm 組的差異基因主要富集的生物過程與PVP 組類似,而AgNO3組的差異基因主要富集在氨基酸代謝、胚胎發(fā)育、DNA 損傷以及氧化應(yīng)激等生物過程.AgNO3和PVP-AgNPs-50nm 組的差異基因都富集了12 個(gè)生物過程,而PVP 組和PVP-AgNPs- 150nm 組的差異基因分別在10個(gè)與1個(gè)生物過程中得到富集.此外,還進(jìn)行了差異基因的KEGG 通路富集分析,如圖4(e～g)所示.結(jié)果顯示,PVP 組的差異基因顯著富集在內(nèi)吞作用和細(xì)胞因子相互作用; PVP-AgNPs-150nm組的差異基因未富集到相關(guān)的KEGG 通路;PVPAgNPs-50nm 組的差異基因主要富集在細(xì)胞因子相互作用、腸道免疫功能和Toll 樣受體信號(hào)等通路上;而AgNO3組的差異基因主要富集在氨基酸代謝、脂質(zhì)、氧化應(yīng)激、異物檢測(cè)和代謝以及PPAR 信號(hào)通路等.在GO 和KEGG 通路分析中,AgNPs 處理組中未發(fā)現(xiàn)與AgNO3暴露相關(guān)的生物過程.這一發(fā)現(xiàn)可能表明納米銀具有不同于AgNO3的獨(dú)特基因毒理學(xué)特征.為了準(zhǔn)確描述各處理組對(duì)斑馬魚胚胎的影響,本文采用了GSEA 全基因集富集分析,結(jié)果如圖4(h～k)所示.PVP、PVP-AgNPs-150nm 和PVP-AgNPs-50nm 組的基因都顯著富集在氨基酸代謝、核糖體、用于生產(chǎn)IgA的腸道免疫通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路,且富集通路數(shù)量相近.而AgNO3主要富集在氧化磷酸化、碳代謝、核糖體和氨基酸代謝等通路,且富集通路數(shù)量為20 條,顯著多于其他3 組納米銀暴露組.

2.5 蛋白質(zhì)互作和關(guān)鍵基因分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,并利用Cytoscape 中Cytohubba 模塊計(jì)算分析相互作用,從差異基因中篩選出具有代表性的關(guān)鍵基因(Hub 基因).考慮到PVP 和PVP-AgNPs-150nm 的差異基因較少,而其他兩組的差異基因較多,為了得到相互作用程度最高的基因,因此本研究將PVP 組與PVP-AgNPs- 150nm 組的Hub 基因設(shè)置為12 個(gè),其余組的Hub 基因設(shè)置為20 個(gè),根據(jù)PPI網(wǎng)路分析確定的各暴露組Hub 基因如圖5(a～d)所示.

圖5 各處理組Hub 基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 The network diagram of Hub genes in each treatment group

2.6 納米銀涂層對(duì)差異基因的影響

為了深入探討涂層對(duì)納米銀毒性的潛在影響,本研究綜合分析了GSE61186 數(shù)據(jù)集和GSE89653數(shù)據(jù)集.在這兩組數(shù)據(jù)中,均涉及到粒徑為20nm 的無涂層 AgNPs 和麥芽糖涂層 AgNPs(Maltose-AgNPs).為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,選擇將這兩組數(shù)據(jù)整合后進(jìn)行分析.首先,對(duì)合并后的數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)估,如圖6(a～d)所示.

圖6 GEO 芯片數(shù)據(jù)分析(GSE89653)Fig.6 Analysis of GEO microarray data (GSE89653)

圖6(a)和(c)分別為整合后數(shù)據(jù)的箱式圖和PCA成分分析圖,圖6(b)和(d)分別為圖6(a)和(c)校正后的質(zhì)控圖.箱式圖反映出數(shù)據(jù)在各組間展現(xiàn)出一致的分布趨勢(shì),說明數(shù)據(jù)經(jīng)過了恰當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化處理.PCA 主成分分析進(jìn)一步證實(shí)了數(shù)據(jù)之間的區(qū)別.整體而言,這些分析確保了數(shù)據(jù)的高度一致性與可靠性.進(jìn)一步,本文選定P<0.05 和|log2FC|>1 為篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)差異基因進(jìn)行了交集分析,結(jié)果如圖6(e)和(f).無涂層AgNPs組中,共有215 個(gè)顯著差異基因,包括110 個(gè)上調(diào)及105 個(gè)下調(diào)基因;而Maltose-AgNPs 組則有302 個(gè)顯著差異基因,其中148 個(gè)為上調(diào)基因,163 個(gè)為下調(diào)基因.通過兩組的交集分析,本文識(shí)別到了3 個(gè)上調(diào)共有基因及5 個(gè)下調(diào)共有基因.

為了對(duì)上述識(shí)別出的差異基因的生物功能進(jìn)行更為深入的探究,本文采用R 軟件包進(jìn)行了功能富集分析,并對(duì)這些基因及其涉及的生物過程進(jìn)行了詳盡的注釋,如圖6(g)和(h)所示.分析結(jié)果顯示,無涂層AgNPs 組的差異基因主要集中于核糖核蛋白復(fù)合物和核糖體等關(guān)鍵生物過程中,而Maltose- AgNPs 組的差異基因則主要集中在內(nèi)切蛋白酶活性、絲氨酸蛋白酶活性、晝夜節(jié)律以及精子與卵子的相互識(shí)別等生物過程中.進(jìn)一步地,通過KEGG 通路富集分析,本文觀察到無涂層AgNPs 組的差異基因在核糖體、過氧化物酶體、肌醇合成以及聚糖代謝等生物通路中有顯著的聚集現(xiàn)象.而Maltose- AgNPs 組的差異基因則在驅(qū)動(dòng)蛋白、細(xì)胞衰老、氨基酸與核苷酸糖代謝,以及類固醇生物合成等關(guān)鍵通路中呈現(xiàn)出顯著富集(圖6(i),(j)).值得注意的是,兩組中的差異基因都在糖代謝通路中表現(xiàn)出了顯著的富集,這暗示了兩者在毒性作用機(jī)制上存在一定的相似性.

3 討論

在PCA 主成分分析中觀察到, PVP-AgNPs-50nm 組和AgNO3組與Control 組之間有明顯的區(qū)分,而PVP 組和PVP-AgNPs-150nm 組與Control 組之間的區(qū)分度較小.聚類分析的結(jié)果也與上述結(jié)果相類似.聚類分析結(jié)果顯示,Control 組與PVP、PVPAgNPs-150nm 的基因表達(dá)更為相似,而AgNO3組的基因表達(dá)與其他組有明顯的差異.因此,結(jié)合各組差異表達(dá)基因的數(shù)量,推測(cè)不同納米銀和銀離子暴露對(duì)斑馬魚胚胎基因的影響從大到小的順序?yàn)?PVP-AgNPs-50nm>AgNO3>PVP-AgNPs-150nm.

研究認(rèn)為,納米銀的致毒機(jī)制主要涉及到“特洛伊木馬機(jī)制”,即納米銀被細(xì)胞攝取后,在細(xì)胞內(nèi)釋放高水平的有毒陽離子[18].這種“特洛伊木馬”效應(yīng)使得納米銀顆粒能夠進(jìn)入細(xì)胞和有機(jī)體,提高其滲透性和生物可利用性[19].然而,銀離子在培養(yǎng)基中不易溶解且傳輸途徑受限,從而導(dǎo)致細(xì)胞難以大量吸收銀離子.因此,當(dāng)將相同原子濃度的納米銀和銀離子與細(xì)胞一起孵育時(shí),納米銀處理下的細(xì)胞內(nèi)銀離子含量可能高于銀離子處理的細(xì)胞.這種細(xì)胞內(nèi)銀離子濃度的差異可能是導(dǎo)致其毒性差異的原因.此外,某些研究中指出,納米銀的毒性可能是由于其“顆粒特異性”所致.例如,Beer 等[20]發(fā)現(xiàn)納米銀對(duì)A549 細(xì)胞展現(xiàn)了顆粒特異性效應(yīng),與納米銀處理相比,銀離子處理的細(xì)胞在細(xì)胞防御基因的表達(dá)上受到了更大的干擾.然而,目前未有研究從基因水平上去探究納米銀和銀離子毒性差異的主要原因.在本研究中,差異基因表達(dá)分析結(jié)果顯示,PVPAgNPs-50nm 組的顯著差異基因數(shù)量多于AgNO3組,并且交集基因的上、下調(diào)數(shù)量不一致.在蛋白質(zhì)相互作用和關(guān)鍵基因分析中,PPI 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因也不相同.功能富集分析顯示,納米銀更多地富集在與免疫相關(guān)的通路上,而AgNO3主要影響細(xì)胞周期和代謝等方面.通過對(duì)比兩種暴露條件下斑馬魚的差異基因表達(dá),推斷納米銀的毒性效應(yīng)并非僅僅來源于其釋放的銀離子,更關(guān)鍵的是其獨(dú)特的顆粒特異性,這在基因調(diào)控過程中發(fā)揮了決定性作用.一些研究表明,納米銀和銀離子都能破壞腦部的突觸結(jié)構(gòu),導(dǎo)致突觸小泡向神經(jīng)纖維網(wǎng)釋放、突觸結(jié)構(gòu)退化,但與銀離子相比,納米銀引起的海馬區(qū)域突觸結(jié)構(gòu)退化更為嚴(yán)重[21].此外,在無細(xì)胞毒性的低濃度暴露實(shí)驗(yàn)中,納米銀還能通過誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增加釋放多種炎癥因子,促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),而銀離子則沒有觀察到這種現(xiàn)象.此外,Xiu 等人[22]的研究顯示,納米銀展現(xiàn)出明顯的“顆粒效應(yīng)”.具體而言,隨時(shí)間的延長(zhǎng),由納米銀導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)銀濃度明顯高于來自離子形態(tài)的銀.這或許能為PVP-AgNPs-50nm 相對(duì)于AgNO3的毒性稍高提供一個(gè)解釋.Autrup 等[23]進(jìn)一步揭示,當(dāng)使用相同的銀原子濃度進(jìn)行孵育時(shí),納米銀誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中的ROS水平遠(yuǎn)超過銀離子,這為納米銀的“顆粒效應(yīng)”提供了進(jìn)一步的證據(jù).因此,納米銀自身的性質(zhì)在其毒性作用中扮演著重要的角色.

納米銀的表面修飾對(duì)其理化性質(zhì)有著重要的影響,包括表面電荷、親疏水性、極性等,從而影響其生物學(xué)效應(yīng).其中,PVP 是一種非離子型高分子化合物,可以有效抑制納米銀的團(tuán)聚和銀離子的釋放.同樣地,麥芽糖因其良好的生物相容性而常被用于納米銀的表面修飾,從而顯著提高納米銀的分散性[24].在本研究中,對(duì)Maltose-AgNPs 與無涂層AgNPs 暴露下斑馬魚的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較.在控制粒徑和劑量一致的條件下,Maltose-AgNPs 組的差異表達(dá)基因數(shù)量顯著多于無涂層AgNPs 組.在進(jìn)一步的差異基因功能富集分析中,Maltose-AgNPs 組與無涂層AgNPs 組在生物進(jìn)程和相關(guān)通路的影響呈現(xiàn)相似性.這一發(fā)現(xiàn)暗示,在相同粒徑的情況下,麥芽糖涂層對(duì)細(xì)胞攝取納米銀的能力并未產(chǎn)生顯著影響,從而導(dǎo)致生物效應(yīng)的相似性.綜合分析兩組樣本的差異基因表達(dá)特征,可以推斷Maltose-AgNPs 對(duì)斑馬魚的毒性效應(yīng)可能略高于無涂層AgNPs.盡管涂層本身并無生物毒性,但有研究認(rèn)為納米銀被涂層后的細(xì)胞毒性會(huì)顯著增強(qiáng),并且對(duì)DNA的損傷能力更強(qiáng).這主要?dú)w因于涂層限制了納米銀的團(tuán)聚,使其具有更高的分散性.高度分散的納米銀相較于團(tuán)聚的納米銀具有更大的相對(duì)比表面積,表現(xiàn)出更高的反應(yīng)性和生物利用度,從而發(fā)揮更高的細(xì)胞毒性[25-26].這與本文中分散性較好的Maltose-AgNPs相比無涂層AgNPs 顯示更高的毒性相吻合.

此外,納米銀的粒徑也是影響其生物毒性的重要因素之一.較小粒徑的納米銀具有更大的比表面積,更高的細(xì)胞滲透能力和銀離子釋放速率,從而增加了其對(duì)細(xì)胞的毒性和細(xì)胞損傷的可能性.一般認(rèn)為,納米銀粒徑越小,越容易通過生物屏障,并且對(duì)生物體的毒性影響也更大.斑馬魚對(duì)納米銀的攝取率受到納米銀的粒徑影響,這是由于納米銀的粒徑?jīng)Q定了其比表面積,而比表面積又能夠影響納米銀進(jìn)入生物體或細(xì)胞的效率,從而進(jìn)一步影響對(duì)生物體的毒性作用[5].這一現(xiàn)象在PVP-AgNPs-150nm 和PVP-AgNPs-50nm 組的基因變化中也得到了證實(shí).PVP-AgNPs-50nm 組的顯著差異基因數(shù)量顯著多于PVP-AgNPs-150nm 組,并且在功能富集分析中,PVP-AgNPs-50nm 組影響的GO 項(xiàng)目和KEGG通路也顯著多于PVP-AgNPs-150nm組.此外,PPI網(wǎng)絡(luò)分析也證實(shí)了這一點(diǎn).因此,納米銀顆粒對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)具有粒徑依賴性,粒徑越小,毒性越大,同時(shí)也更容易引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥和DNA 損傷等反應(yīng).這主要是由于小粒徑納米銀具有更高的細(xì)胞攝取效率,并且釋放銀離子的能力也比大粒徑的納米銀更強(qiáng)[27].小粒徑的納米銀進(jìn)入細(xì)胞后,由于其較高的比表面積和生物活性,會(huì)產(chǎn)生更高程度的氧化應(yīng)激、細(xì)胞免疫等生物效應(yīng)[28].然而,本研究只是通過生物信息學(xué)手段分析納米銀的毒性作用及其機(jī)制,還需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證推論.

4 結(jié)論

4.1 研究表明,納米銀的粒徑越小,其毒性越大.具體來說,相較于 PVP-AgNPs-150nm 組, PVPAgNPs-50nm 組的顯著差異基因數(shù)量更多,富集到更多的GO 項(xiàng)目和KEGG 通路.

4.2 納米銀組(150 和50nm)在斑馬魚中主要影響代謝和免疫相關(guān)的基因表達(dá),暗示可能對(duì)魚類的生長(zhǎng)和發(fā)育造成損害.同時(shí),全基因集富集分析的結(jié)果也顯示,AgNO3和納米銀在斑馬魚體內(nèi)引發(fā)的基因表達(dá)變化主要集中在代謝相關(guān)通路.這表明納米銀的毒性不僅僅與釋放的銀離子有關(guān),而且與其顆粒特性密切相關(guān).

4.3 相較于無涂層納米銀,麥芽糖涂層的納米銀在斑馬魚中導(dǎo)致更多差異基因的表達(dá),暗示麥芽糖涂層可能增加納米銀的毒性.