韓曉雯,徐婕妤,王偉偉,錢秋慧,王慧利* (.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 5009;.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江 溫州 35035)
三氯生(TCS)是一種高效的廣譜抗菌劑,被廣泛應(yīng)用于牙膏、洗滌劑等生活用品及醫(yī)療器械中[1].TCS 生產(chǎn)及使用過程中被釋放到環(huán)境,由于目前現(xiàn)有的常規(guī)污水處理方式難以完全除去TCS,導(dǎo)致TCS 對水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)性污染影響[2-4].在水生系統(tǒng)中,TCS 的濃度從低到高,從納克水平到10000 倍不等, COVID-19 以來,大量含TCS 消毒劑的使用導(dǎo)致部分地區(qū)兒童TCS 預(yù)估每日攝入量(EDI)已超過每日可接受攝入量(ADI)[5-6].由于其具有較長的半衰期,并且具有蓄積作用,TCS 極易對生物機(jī)體的正常生長發(fā)育造成影響,并通過生物累積作用,導(dǎo)致人體暴露和健康影響,從而對環(huán)境和人類造成潛在的健康風(fēng)險[4-5,7].有研究顯示,TCS 在母體羊水、尿液、臍帶血清和母乳樣本中廣泛檢出,對胎兒產(chǎn)生潛在的健康影響[8].與TCS 類似,雙酚A(BPA)也因具有高效、低耐久性的優(yōu)點而作為一種塑料合成材料廣泛應(yīng)用于人類的日常用品中,例如食品貯存容器、醫(yī)用器械、供水管道與防護(hù)涂料中[9].已有研究表明,在海洋和淡水水體收集的多種魚類體內(nèi),可檢測到濃度范圍為0.2~13000μg/kg 的BPA[10].已有的體內(nèi)和體外實驗研究表明,環(huán)境中低劑量TCS和BPA 長期作用于水生系統(tǒng),對魚類和高等脊椎動物的生殖、免疫系統(tǒng)、肌肉功能造成不良毒性影響以致威脅到生物安全[7,9].然而,探究人類或其他生物早期TCS 和BPA 暴露與神經(jīng)發(fā)育之間的關(guān)系及其機(jī)制的相關(guān)研究較少,對TCS 和BPA 進(jìn)行生物毒性相關(guān)研究和評估具有一定必要性.因此,本研究探討與比較環(huán)境內(nèi)分泌干擾物TCS 和BPA 的致毒機(jī)理,旨在為“污染性疾病”的認(rèn)識、生態(tài)安全評價與環(huán)境健康維護(hù)提供參考.
本實驗以斑馬魚為模型生物,主要使用野生型AB 品系斑馬魚與轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(elavl3:EGFP)以及Tg(fli1:EGFP),所用斑馬魚購于國家斑馬魚資源中心,按照標(biāo)準(zhǔn)斑馬魚養(yǎng)殖手冊飼養(yǎng)于斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng),雌雄成魚分缸飼養(yǎng),系統(tǒng)水溫維持在(28.5±0.5) ℃,pH 值為6.8~7.5,光暗周期為14h 光照和10h黑暗,每日早晚分2 次投喂新鮮孵育豐年蝦,并清理飼料殘渣與排泄物.
實驗試劑:三氯生(CAS No.3380-34-5, 99.9%),雙酚A(CAS No.201-245-8,99.9%),均購于Sigma-Aldrich 公司(St.Louis, USA).藥品溶劑為丙酮(Acetone,99.9%),購于浙江中星化工試劑有限公司.基因逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京寶日醫(yī)生物有限公司;第一鏈cDNA 合成試劑盒、Trans Start@ Greenq PCR SuperMix 試劑盒來源于北京全式金公司, AO染色試劑盒以及乙酰膽堿酯酶活性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司.
實驗儀器:斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(上海海圣生物實驗室有限公司)、體式顯微鏡(Cover-015,日本奧林巴斯)、臺式低溫高速離心機(jī)(Gentrifuge5424R,德國Eppendorf 公司)、制冰機(jī)(IBS-20,寧波特朗普儀器有限公司)、渦旋混合器(XW-80,上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)、F6/F10 手持式高速勻漿機(jī)(上海凈信科技公司)、Step OnePlus? Real-Time PCR System((48 孔)美國thermofisher 科技公司).
基于BPA 的環(huán)境檢測濃度在ng/L~mg/L 水平不等,在工業(yè)廢水中甚至可以達(dá)到370mg/L[11],而TCS 的環(huán)境監(jiān)測濃度在0~1000ng/L 不等,在畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖等特殊環(huán)境中,其監(jiān)測濃度高達(dá)mg/L 級別[12].通過實驗測定擬合二者對120hpf斑馬魚幼魚的LC50 值分別為9.06 和0.51mg/L[13],本研究中BPA 和TCS 的濃度均選擇250μg/L,分別不足其LC50 的1/36 和1/2.目的是使斑馬魚暴露于亞致死劑量下,以便捕捉和統(tǒng)計其幼魚的表觀發(fā)育畸形,運動行為異常,潛在的分子變化及深入探索潛在的分子機(jī)制.實驗前一天晚上將斑馬魚按照雌雄比2:2放入產(chǎn)卵器中,使用透明隔板分隔雌魚及雄魚,次日早上開燈刺激產(chǎn)卵,2h 后收集胚胎.挑選優(yōu)質(zhì)胚胎孵育至 6h 后進(jìn)行暴毒實驗.設(shè)置對照組(CTR 0.01%丙酮)和藥物處理組(TCS 250μg/L、BPA 250μg/L 處理組),加入預(yù)先配制的TCS 與BPA 溶液開始暴毒,每間隔24h 換液一次以保持染毒濃度,連續(xù)暴毒120h 后,進(jìn)行后續(xù)實驗.
胚胎暴露3dpf 后,分組收集于1.5mL 離心管,加入1mL PBS 低速震蕩漂洗2 次,吸去PBS 殘液后,避光加入AO 凋亡染液,避光染色15min 后吸去AO 染色液,避光加入PBS 漂洗胚胎3 次.將幼魚移至載玻片,加入魚酚麻醉劑,于體視熒光顯微鏡下成像記錄.
將對照組、TCS 處理組以及BPA 處理組暴露5dpf 的斑馬魚幼魚移至96 孔無菌培養(yǎng)板后移入Noldus(荷蘭)行為分析儀觀察箱,參考之前的行為學(xué)分析方法[14],利用EthoVisionXT 軟件設(shè)定實驗程序進(jìn)行運動軌跡采集,統(tǒng)計運動指標(biāo).
分別從對照組、TCS 處理組以及BPA 處理組吸取暴露5dpf 的幼魚于FP 管中, PBS 清洗兩次,吸取RIPA 液超聲勻漿,2500r/min 速度下離心 15min,吸取上清液待測.樣本蛋白質(zhì)濃度根據(jù)碧云天BCA 蛋白濃度試劑盒操作流程進(jìn)行測定.使用乙酰膽堿酯酶(AChE)測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)測定乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性.
根據(jù)制造商說明從不同處理組暴毒5dpf 幼魚中提取總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄體系將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.根據(jù)TransStart Green qPCR Super Mix 試劑盒操作要求配制樣本反應(yīng)液,在ABI7500 儀器上運行程序進(jìn)行 RT-qPCR 分析.
從有機(jī)小分子活性數(shù)據(jù)庫 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取TCS 及BPA 的結(jié)構(gòu)式,導(dǎo)入 Pharm Mapper 在線數(shù)據(jù)庫(http://lilabecust.cn/pharmmapper/)對靶點進(jìn)行預(yù)測,將篩選得到的藥物靶蛋白導(dǎo)入 STRING 在線數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/),進(jìn)行 String 轉(zhuǎn)化,利用Metascape 數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org)及微生信在線平臺(https://www.bioinformatics.com.cn)分析轉(zhuǎn)化結(jié)果.
數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)(SD)表示,實驗組間比較在 Tukey 排序檢驗之后進(jìn)行單向方差分析(ANOVA),所有統(tǒng)計分析均以SPSS 18.0 軟件(芝加哥,美國)進(jìn)行,顯著性水平記錄為P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***).
為了對TCS和BPA 對斑馬魚幼魚發(fā)育的影響作整體評價,把胚胎分為對照組、TCS 處理組和BPA 處理組,進(jìn)行連續(xù)120hpf 的連續(xù)暴毒.結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,在TCS 和BPA 暴露下,幼魚的形態(tài)在觀察下表現(xiàn)出多種明顯表觀畸形.72hpf 在TCS 和BPA 處理后幼魚開始出現(xiàn)卵黃囊腫,尤其是暴露到120hpf 時TCS 處理組和BPA 處理組幼魚畸形現(xiàn)象極為顯著,出現(xiàn)例如心包水腫、脊柱彎曲和游囊發(fā)育遲緩等發(fā)育畸形現(xiàn)象(圖1(a)).圖1(b)和圖1(c)量化了TCS 及BPA 的致畸率,其中BPA 組畸形率為31.6%(P<0.05),而TCS 組畸形率高達(dá)43.7%(P<0.001).
圖1 TCS 和BPA 暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響Fig.1 The effects of embryo development under TCS and BPA exposure
運動行為是神經(jīng)功能最直觀的體現(xiàn)形式,且行為學(xué)檢測具有普適性、穩(wěn)定性和易操作性的優(yōu)點,因此,神經(jīng)行為檢測在神經(jīng)毒性的高通量篩選中被較為廣泛應(yīng)用[15].為探究TCS 和BPA 對幼魚神經(jīng)運動行為的影響,通過自主運動、光暗節(jié)律和聲刺激實驗評價TCS 及BPA 暴露對幼魚運動行為的影響.在自主運動實驗中,如軌跡示蹤熱圖(圖2(a))所示,與對照組相比,TCS 處理組和BPA 處理組幼魚運動軌跡更單一稀疏,多為短距離游動,行為熱度下降.自主運動顯示(圖2(b)),TCS 處理組及BPA 處理組運動距離顯著降低(P<0.05).同時,TCS 及BPA處理組幼魚移動速度也顯著降低(P<0.01) (圖2(c)),此外,與BPA 相比,TCS 處理組移動距離和移動速度略低,但不具有顯著性.表明TCS 及BPA 暴露可導(dǎo)致幼魚自主運動遲緩和活力下降,對斑馬魚的運動神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響,且TCS 對斑馬魚的影響更大.
圖2 TCS 和BPA 暴露下對斑馬魚幼魚行為的影響Fig.2 Effects of TCS and BPA exposure on the behavior of zebrafish larvae
在光暗節(jié)律實驗中(圖2(d)),TCS 處理組和BPA處理組幼魚對光暗交替瞬間的反應(yīng)較對照組更為遲鈍,行為變化較弱,且游動距離有小于對照組的趨勢,運動行為活力下降,證實TCS 和BPA 暴露對幼魚的光暗感知能力產(chǎn)生破壞且對相關(guān)神經(jīng)有損害作用.在聲刺激狀態(tài)下(圖2(e)),與對照組相比TCS 處理組和BPA 處理組幼魚運動活力降低(P<0.05),表明TCS 及BPA 暴露對幼魚聽覺相關(guān)神經(jīng)功能產(chǎn)生影響,導(dǎo)致幼魚對聲音刺激的敏感度和應(yīng)激反應(yīng)受到抑制,造成聽覺功能受損.
為了探究TCS 和BPA 暴露對斑馬魚幼魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響以及它們對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成與分化的影響,對Tg(elavl3:EGFP)神經(jīng)轉(zhuǎn)基因斑馬魚和Tg(fli1:EGFP)血管轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行暴露.作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要標(biāo)志基因,elavl3 在神經(jīng)元分化中發(fā)揮重要作用,利用Tg(elavl3:EGFP)品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以有效觀察斑馬魚神經(jīng)元生長情況[16];基因fli1在血管生成中發(fā)揮作用,因此可以通過觀察Tg(fli1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究TCS 和BPA 對斑馬魚血管發(fā)育的影響[17].如圖3(a)所示,對照組幼魚腦部的綠色熒光清晰,而經(jīng)過120hpf 暴毒的TCS 處理組和BPA 處理組幼魚腦部熒光強(qiáng)度及面積下降,且出現(xiàn)間腦與后腦間隙模糊的情況(圖3(a)白色箭頭),表明TCS 和BPA 暴露后會使新生神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量減少,導(dǎo)致斑馬魚的早期神經(jīng)發(fā)育受到抑制.Tg(fli1:EGFP)血管轉(zhuǎn)基因斑馬魚的結(jié)果顯示(圖3(b)),與對照組相比,在TCS 和BPA 的暴露處理下,斑馬魚幼魚身體和腦部血管發(fā)生消融,且腦部血管排列無序.
圖3 TCS 和BPA 暴露下對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響Fig.3 The effects of TCS and BPA exposure on the development of the nervous system of zebrafish
利用吖啶橙(AO)染色以研究TCS 及BPA 暴露對細(xì)胞凋亡的影響.結(jié)果表明,暴露至120hpf 時,對照組幼魚腦部存在少量自然凋亡情況而TCS 處理組和BPA 處理組幼魚腦部可觀察到明顯致密濃縮的綠色熒光碎片顆粒(圖3(c)白色箭頭),熒光強(qiáng)度及數(shù)量較對照組顯著增強(qiáng),表明TCS 和BPA 可誘導(dǎo)腦部細(xì)胞凋亡,影響斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育.
為了進(jìn)一步探究TCS 和BPA 對斑馬魚幼魚神經(jīng)毒性的影響機(jī)制,本研究篩選了4 個神經(jīng)相關(guān)功能基因(elavl3、gfap、ngn1、gap43)進(jìn)行RT-qPCR驗證.結(jié)果顯示(圖4(a)~(d)),與對照組相比,TCS 處理組及BPA 幼魚的elavl3、gfap、ngn1、gap43 基因表達(dá)均受到抑制,其中elavl3、gfap和ngn1 表達(dá)水平顯著下降,而gap43 基因表達(dá)沒有顯著差異,表明TCS 和BPA 都能對與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用.而乙酰膽堿酯酶(AChE)結(jié)果顯示(圖4(e)),與對照組相比,TCS 處理組AChE 顯著增加(P<0.01),而BPA 組AChE 表達(dá)略有提升但不具有顯著性.
圖4 TCS 和BPA 暴露下對斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因以及生化指標(biāo)的影響Fig.4 The effects of TCS and BPA exposure on neurodevelopment-related genes and biochemical indicators in zebrafish larvae
基于上述TCS 和BPA 暴露對斑馬魚產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用,為進(jìn)一步分析TCS 和BPA 對生物產(chǎn)生毒性作用的機(jī)制和作用途徑,本文通過生物信息學(xué)分析預(yù)測TCS 和BPA 的作用靶基因,并對其進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析.圖5 展示了TCS 及BPA 富集排名前10 的GO terms(P<0.05),以及排名前 20 的 KEGG 途徑(P<0.05).
圖5 TCS 及BPA 作用的靶基因GO 功能富集與KEGG 通路富集Fig.5 GO functional classification and KEGG pathway analysis of TCS and BPA target genes
GO 分析顯示(圖5(a)-(b)),生物過程(Biological process)方面,TCS 的靶基因主要富集在“細(xì)胞氨基酸代謝過程(Cellular amino acid metabolic process)”、“有機(jī)酸分解代謝過程(Organic acid catabolic process) ”和“羧酸分解代謝過程(Carboxylic acid catabolic process)”等生物過程,其中“有機(jī)酸分解代謝過程”和“羧酸分解代謝過程”可以富集較多的BPA 靶基因.在細(xì)胞組成(Celluar component)方面,TCS 主要富集在“Sin3 復(fù)合體(Sin3complex)”和“線粒體基質(zhì)(Mitochondrial matrix)”中,而BPA 在“線粒體基質(zhì)”中也存在較多富集的靶基因.此外,BPA 的靶基因還在“過氧化物酶體(Peroxisome)”以及“微體(Microbody)”中富集.在分子功能(Molecular function)方面,TCS 主要富集在“核受體活性(Nuclear receptor activity)”和“配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性(Ligand-activated transcription factor activity)”,而BPA 則富集在“維生素結(jié)合(Vitamin binding)”和“有機(jī)酸結(jié)合(Organic acid binding)”.其中,TCS和BPA 的靶基因均可在“維生素結(jié)合”,“核受體活性”以及“類固醇結(jié)合(Steroid binding)”功能中富集.
KEGG 分析發(fā)現(xiàn)(圖5(c)~(d)),TCS和BPA 在“癌癥相關(guān)通路(Pathways in cancer)”、“碳代謝(Carbon metablism)”、“輔因子的生物合成(Biosynthesis of cofactors)”以及“谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)”通路富集.值得注意的是,TCS 在“帕金森病(Parkinson disease)”、“藥物代謝-其他酶(Drug metabolism-other enzymes)”和“Wnt 信號通路(Wnt signaling pathway)”富集,而BPA 在“胰島素信號通路(Insulin signaling pathway)”、“PPAR 信號通路(PPAR signaling pathway)”、“HIF-1 信號通路(HIF-1signaling pathway)” 以及“色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)”、“酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism) ”、“ β- 丙氨酸代謝(Beta-Alanine metabolism)”等代謝相關(guān)通路富集,表明TCS 和BPA均能誘導(dǎo)神經(jīng)毒性,但其誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的作用機(jī)制和途徑可能不同.
為了比較TCS 和BPA 作用靶基因?qū)ι锏亩拘宰饔?利用Cytohubba 對TCS 及BPA 作用靶基因的關(guān)鍵基因(Hub基因)進(jìn)行篩選,其中TCS組排名前十的Hub 基因(圖5(e))分別為EP300、RXRB、RXRG、THRB、MUC1、E2F1、BIRC5、CALML3、GCDH、ARHGEF7.其中,EP300 是自閉癥譜系障礙相關(guān)蛋白和基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵樞紐,研究發(fā)現(xiàn)EP300在 lnc MEG3 對 CDH2 的調(diào)控中發(fā)揮重要作用,MEG3 可以通過與EP300 相互作用,上調(diào)CDH2,從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的凋亡和細(xì)胞凋亡[18].Shimizu 等[19]的一項研究則證實EP300 可以調(diào)控斑馬魚視神經(jīng)頂蓋成體神經(jīng)發(fā)生和再生神經(jīng)發(fā)生過程中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化,抑制EP300 的表達(dá)可以在生理條件下促進(jìn)神經(jīng)上皮樣干細(xì)胞新生神經(jīng)元的生成.BPA 組排名前十的Hub 基因(圖5(f))分別為AR、PA2G4、CCNA2、MUC1、SMARCA4、HMGCS1、CLPP、INSR、HIBCH、ALK.其中PA2G4可以與受體、激酶以及一些細(xì)胞調(diào)節(jié)因子相互作用,與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和癌癥有關(guān),研究證實PA2G4 敲降減少神經(jīng)嵴中凋亡細(xì)胞的數(shù)量,也導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞的減少,表明PA2G4 在控制神經(jīng)板,神經(jīng)嵴和顱板結(jié)構(gòu)域的大小方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[20].值得注意的是MUC1在TCS 和BPA 作用的靶基因中均發(fā)揮重要作用.MUC1 是一種跨膜粘蛋白樣糖蛋白,是Toll 樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,可以抑制TLR 激活引起的促炎反應(yīng),抑制TLR 介導(dǎo)的NF-κB 活化[21].NF-κB 可以激活細(xì)胞增殖和炎癥等細(xì)胞生物學(xué)過程,有研究證實NF-κB 可以調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子的分泌,調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP 的表達(dá)[22].
綜上所述,TCS 和BPA 可以通過作用于神經(jīng)相關(guān)的Hub 基因誘導(dǎo)神經(jīng)毒性作用,其中抑制神經(jīng)元發(fā)育和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或凋亡異常是TCS 和BPA 誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的重要方式.基于生信分析本文對TCS和BPA 誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的作用途徑和機(jī)制進(jìn)行分析和比較,而在之前的實驗中,本文也證實了TCS 和BPA 急性暴露會誘導(dǎo)斑馬魚神經(jīng)元的發(fā)育異常和細(xì)胞凋亡增加.這些發(fā)現(xiàn)有利于進(jìn)一步的了解TCS和BPA 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性效應(yīng)和作用機(jī)制的異同.
作為典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,TCS 和BPA的親脂性和較強(qiáng)的生物蓄積能力導(dǎo)致其極易對生物造成毒性作用,越來越多的實驗證實了TCS 和BPA 對免疫、生殖、神經(jīng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響.基于斑馬魚 (Daniorerio)轉(zhuǎn)基因品系豐富和中樞神經(jīng)系統(tǒng)在功能上與人類神經(jīng)系統(tǒng)高度相似等特點[23],本研究選擇環(huán)境中常見的兩種典型內(nèi)分泌干擾物TCS 和BPA 為對象,以斑馬魚為模式生物,探究TCS 和BPA 對斑馬魚神經(jīng)發(fā)育和運動行為的影響.
為了評價TCS 和BPA 對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響,本研究統(tǒng)計了亞致死劑量暴露下TCS 和BPA 誘導(dǎo)胚胎及幼魚的畸形情況,發(fā)現(xiàn)TCS 和BPA 暴露會導(dǎo)致幼魚的形態(tài)出現(xiàn)多種明顯表觀畸形,如卵黃囊腫、心包水腫、脊柱彎曲及游囊閉合發(fā)育遲緩的情況,且與BPA 處理組相比,TCS 處理組幼魚畸形情況更為嚴(yán)重,表明TCS 和BPA 具有明顯的致畸反應(yīng).在Sun 等[24]的研究中發(fā)現(xiàn)TCS 和BPA 對斑馬魚幼魚均有較為明顯的致畸作用,大部分發(fā)育異常的斑馬魚出現(xiàn)兩種或兩種以上的畸形情況,主要表現(xiàn)為卵黃囊腫、心包水腫和脊柱彎曲,這與本研究的發(fā)現(xiàn)相似.此外,其研究發(fā)現(xiàn)BPA 暴露導(dǎo)致的畸形率略高于TCS 暴露誘導(dǎo)的畸形率,而在本研究中TCS 致畸率更高,這可能是本研究與其研究暴露濃度不同導(dǎo)致.脊柱彎曲和頭部畸形與神經(jīng)細(xì)胞失調(diào)有關(guān)[25],因此需要進(jìn)一步研究TCS 和BPA 暴露對神經(jīng)發(fā)育的影響.
斑馬魚幼魚行為模型可以檢測大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的功能變化,例如空間和社交學(xué)習(xí)、記憶、焦慮以及由神經(jīng)遞質(zhì)驅(qū)動的社交或疾病行為,斑馬魚對光暗刺激和聲音做出反應(yīng)的游泳則是一種反射反應(yīng),可以反應(yīng)對光照及聲刺激的敏感性和感知神經(jīng)的功能[15].在本研究中斑馬魚幼魚對外界刺激的反射行為以及運動能力發(fā)生了改變.自主運動、光暗節(jié)律和聲刺激行為學(xué)實驗顯示,TCS 和BPA 暴毒可導(dǎo)致幼魚運動距離和游動速率降低,運動行為活力下降,并損傷幼魚對光暗刺激和聲音刺激的感知神經(jīng)功能,對斑馬魚幼魚運動行為有明顯抑制作用.Ling等[25]研究了TCS 對斑馬魚運動行為的影響,證實TCS 會導(dǎo)致斑馬魚自主運動活力下降并破壞斑馬魚幼魚的晝夜節(jié)律;Heredia-García 等[26]則對BPA誘導(dǎo)的行為障礙進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)BPA 暴露濃度為220μg/L 時會擾亂斑馬魚的運動行為,具體表現(xiàn)為移動距離的降低,這與本研究的結(jié)果相似, 表明TCS和BPA 會導(dǎo)致運動神經(jīng)系統(tǒng)和感知神經(jīng)功能障礙,且與BPA 相比,TCS 對神經(jīng)行為的影響更大.
基于上述TCS 和BPA 暴露對斑馬魚幼魚大腦發(fā)育和運動行為的影響,考慮到運動行為的改變可能與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)傳遞有關(guān),本研究分析了TCS 和BPA 暴露對斑馬魚神經(jīng)元發(fā)育的影響[27].在斑馬魚早期神經(jīng)發(fā)育過程中,elavl3 基因承擔(dān)十分關(guān)鍵的作用,elavl3 基因缺位會導(dǎo)致視覺神經(jīng)系統(tǒng)缺陷,伴隨神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良,是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要標(biāo)志基因[16].由于脈管發(fā)育與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密不可分,而fli1 基因在血管生成中起著重要作用[17].轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚的綠色熒光觀察結(jié)果表明,TCS 和BPA具有神經(jīng)毒性作用,會抑制中樞神經(jīng)發(fā)育和血管生成,導(dǎo)致中樞神經(jīng)元細(xì)胞熒光強(qiáng)度和面積下降,血管消融和頭部血管排列雜亂無序,證實TCS 及BPA 暴露會對斑馬魚神經(jīng)元發(fā)育和血管發(fā)育產(chǎn)生影響.在之前.Wang等[29]證實TCS暴露濃度為250 μg/L時會導(dǎo)致大腦神經(jīng)元數(shù)量減少,后腦和間腦間隙模糊不清[28].血管生成是一個較為復(fù)雜的過程,血管發(fā)育對維持大腦功能具有重要作用.在本研究中發(fā)現(xiàn)TCS和BPA 暴露會導(dǎo)致頭部血管無序分布,出現(xiàn)血管消融的情況,這與之前的研究相似[29].據(jù)報道,TCS 可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,Szykowski 等[30]研究發(fā)現(xiàn)TCS激活了芳香烴受體(AhR)依賴性細(xì)胞凋亡,并影響了小鼠新皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)物中細(xì)胞色素P450 酶Cyp1a1 和Cyp1b1 的表達(dá);Qi 等[31]的研究發(fā)現(xiàn)BPA會以濃度依賴性方式降低細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在暴露于50 和70 μmol/L BPA 的細(xì)胞中觀察到細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞死亡,這與本文的研究結(jié)果一致.在本研究中TCS 和BPA 暴露下均出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡信號增加的情況,表明TCS 和BPA 可通過誘導(dǎo)腦部細(xì)胞凋亡,對斑馬魚產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用.
為了從分子層面探究TCS 和BPA 對斑馬魚神經(jīng)發(fā)育的影響,本研究通過RT-qPCR 分析了TCS 及BPA 急性暴露對斑馬魚的四種神經(jīng)相關(guān)基因(elavl3、gfap、ngn1、gap43)的表達(dá)水平的變化.elavl3、gfap、ngn1、gap43 基因都是與斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的基因,在神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞命運、神經(jīng)元軸突生長與再生過程中發(fā)揮重要作用,對評價神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義[32].elavl3 基因和ngn1 基因是神經(jīng)元發(fā)育的標(biāo)記基因,elavl3 基因表達(dá)的缺失會引起視覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷,并導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育損傷[16].ngn1 基因與神經(jīng)軸突生長有較強(qiáng)關(guān)聯(lián),ngn1 也在神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞命運過程中發(fā)揮作用[33].研究發(fā)現(xiàn)gfap是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架中表達(dá)的中間絲蛋白,該基因可作為一種生物標(biāo)記物分析斑馬魚神經(jīng)毒性,gfap基因表達(dá)量的下調(diào)表明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可能受到損傷[34].gap43 基因與神經(jīng)元軸突生長和再生有關(guān),在神經(jīng)受損重新生長時誘導(dǎo)軸突再生長,當(dāng)神經(jīng)元軸突再生發(fā)育時表達(dá)量上升[35].郭子一等[13]探索了三種內(nèi)分泌干擾物對斑馬魚神經(jīng)毒性效應(yīng)和機(jī)制,發(fā)現(xiàn)elavl3、ngn1 和gfap在Hub 基因和神經(jīng)標(biāo)志功能基因蛋白間的互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮重要作用.本研究RT-qPCR 結(jié)果證實,TCS 和BPA 暴露會改變與斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平,導(dǎo)致elavl3、gfap和ngn1 表達(dá)下降而對gap43 的表達(dá)沒有顯著影響,且TCS 對這幾個神經(jīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響更大.基于TCS 及BPA 處理下神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的變化可以推測,TCS 和BPA 暴露通過抑制elavl3、ngn1 和gfap的表達(dá),影響神經(jīng)細(xì)胞的生長,造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷,且亞致死劑量下TCS 比BPA 對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷更嚴(yán)重.
乙酰膽堿酯酶(AChE)具有催化神經(jīng)突觸間隙中乙酰膽堿水解的功能,在神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞過程中起到非常關(guān)鍵的作用,可作為生物標(biāo)志物來檢測發(fā)育性神經(jīng)毒性,且與運動行為具有關(guān)聯(lián)性,其活性變化可作為衡量神經(jīng)毒性的重要指標(biāo)之一[36].已有研究表明,TCS 可以通過調(diào)控AChE 的表達(dá),造成運動行為障礙并誘導(dǎo)神經(jīng)毒性[27];Murugan 等[37]則證實BPA可以通過改變AChE 活性和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對斑馬魚誘導(dǎo)神經(jīng)毒性作用.本研究中AChE 結(jié)果表明,TCS 和BPA 暴露會影響神經(jīng)沖動的正常傳遞,且TCS 組對神經(jīng)傳遞的影響更大.
為進(jìn)一步分析TCS 和BPA 誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制,基于生物信息學(xué)對TCS 和BPA 的作用靶基因在功能和富集通路上的異同進(jìn)行分析,結(jié)果顯示TCS與BPA 在功能和涉及的通路上具有一定的相似性.值得注意的是,盡管TCS 和BPA 的靶基因在影響神經(jīng)發(fā)育相關(guān)通路均有富集,但其誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的作用通路存在一定差異.TCS 靶基因在“配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性”以及“Wnt 信號通路”富集.芳香烴受體(AhR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)控外源化合物代謝和控制細(xì)胞周期[38].之前的研究表明TCS 可以通過與芳香烴受體相互作用,降低大腦皮質(zhì)層神經(jīng)元中NF-κB 蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)神經(jīng)毒性和細(xì)胞凋亡[30,39].最近的一項研究證實TCS 可能充當(dāng)內(nèi)分泌干擾物,影響小鼠神經(jīng)元中Sirt1、Sirt3和AhR蛋白的表達(dá),從而影響大腦中的神經(jīng)激素平衡[40].Wnt 通路與胚胎發(fā)育、突觸生成與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān),Wnt 信號通路激活可抑制病理性神經(jīng)炎癥的發(fā)生[41].BPA 的靶基因在胰島素信號通路、PPAR 信號通路、HIF-1 信號通路以及色氨酸代謝等代謝相關(guān)通路富集.PPAR 信號通路可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,最近的研究表明PPARs 的一種亞型PPARγ 具有抗氧化和抗炎功能,主要通過影響Wnt 信號通路、NF-κB信號通路等調(diào)控突觸可觸性,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[42].色氨酸是人體必需氨基酸之一,與神經(jīng)遞質(zhì)和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[43].TCS 和BPA 結(jié)構(gòu)的區(qū)別可能是造成作用靶基因及基因富集通路不同的重要因素.TCS 可以通過影響生物的合成與代謝產(chǎn)生神經(jīng)毒性,而BPA 則通過影響色氨酸、絡(luò)氨酸等氨基酸代謝以及PPAR 通路誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生,產(chǎn)生神經(jīng)毒性.Hub 基因篩選發(fā)現(xiàn)TCS和BPA 均能直接或間接作用于神經(jīng)相關(guān)的Hub 基因,抑制神經(jīng)元發(fā)育和誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖和凋亡,從而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性,這與之前的研究及我們實驗得出的結(jié)果相符.這些發(fā)現(xiàn)有利于進(jìn)一步的了解TCS 和BPA 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性效應(yīng)和作用機(jī)制的異同.
4.1 TCS 和BPA 可誘導(dǎo)斑馬魚幼魚產(chǎn)生卵黃囊腫、心包水腫、脊柱彎曲等畸形情況, 此外,與對照組相比,TCS 暴露組致畸率為43.7%(P<0.001),而BPA 致畸率為31.6%(P<0.05),表明TCS 和BPA 暴露誘導(dǎo)斑馬魚幼魚發(fā)育畸形,且相同劑量下TCS 對幼魚發(fā)育的影響更大.
4.2 行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn),TCS 和BPA 暴露導(dǎo)致幼魚運動活力下降,表現(xiàn)為移動距離和移動速度顯著降低(P<0.05、P<0.01);此外,光暗周期和聲刺激實驗發(fā)現(xiàn)TCS 和BPA 暴露損傷幼魚對光暗刺激和聲音刺激的感知神經(jīng)功能,導(dǎo)致斑馬魚幼魚對光暗刺激和聲刺激敏感性降低.
4.3 TCS 和BPA 暴露影響斑馬魚神經(jīng)和血管發(fā)育,減少中樞神經(jīng)元的表達(dá),并造成血管分布雜亂和血管消融.此外,TCS 和BPA 暴露還會導(dǎo)致頭部凋亡細(xì)胞數(shù)量增加,且TCS 比BPA 對神經(jīng)和血管發(fā)育以及細(xì)胞凋亡的影響更大.抑制中樞神經(jīng)元細(xì)胞的表達(dá)并導(dǎo)致血管發(fā)育障礙血管消融,且這種抑制可能是通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的.
4.4 生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)TCS 和BPA 通過影響斑馬魚幼魚體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性,對神經(jīng)傳導(dǎo)產(chǎn)生影響.RT-qPCR 結(jié)果顯示,TCS 和BPA 會降低與斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平,減少elavl3、gfap和ngn1 的表達(dá),而對gap43 的影響不顯著,表明TCS 和BPA 影響乙酰膽堿酯酶以及elavl3、gfap、ngn1 和gap43 的表達(dá),且TCS 對這些神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因和乙酰膽堿酯酶的影響更大.
4.5 針對靶基因的GO 和KEGG 分析則說明TCS和BPA 作用的靶基因富集的功能和通路有一定相似性,均會對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能產(chǎn)生影響,但TCS的內(nèi)分泌干擾有關(guān)基因功能富集更為顯著,但二者涉及相關(guān)神經(jīng)發(fā)育的代謝通路有所不同,TCS 可能通過內(nèi)分泌干擾誘導(dǎo)神經(jīng)毒性,而BPA 則可能通過影響氨基酸的合成與代謝誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)疾病的發(fā)生.此外,誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)育異常和細(xì)胞增殖和凋亡異常也是TCS 和BPA 誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的潛在機(jī)制.