115462例新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查及基因突變分析＊

張禾璇 楊 雪 王侶金 李林潔 張曉怡 劉興宇 余 蕾

貴州省貴陽市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科 (貴州 貴陽 550003)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphat edehydrogenase, G6PD)是存在于人體紅細胞表面催化葡萄糖-6-磷酸的一種限速酶。G6PD缺乏癥是由于G6PD基因突變引起的一種溶血性酶缺陷疾病，在食用蠶豆、服用氧化藥物或感染等氧化應(yīng)激條件下，紅細胞膜失去巰基保護而功能受損導(dǎo)致溶血性貧血，又名“蠶豆病”。新生兒核黃疸患兒可出現(xiàn)智力低下、腦癱等嚴重并發(fā)癥，甚至死亡[1-2]。據(jù)報道，G6PD缺乏癥全球受累人數(shù)達 4 億人[3]，主要分布于非洲、亞洲、中東和地中海等地區(qū)，發(fā)生率高達15%～26%[4]，遺傳模式呈X-連鎖不完全顯性遺傳，男性患者呈半合子，女性具有兩條X染色體，女性患者則表現(xiàn)為純合子和雜合子這兩種類型。我國G6PD缺乏癥以廣西、廣東、海南等發(fā)生率較高[5]，但近年來隨著經(jīng)濟發(fā)展、人口流動加劇及婚育制度改革，各區(qū)域G6PD缺乏癥患病率也隨之發(fā)生變化[6-7]。

本研究以貴陽地區(qū)115462例新生兒為研究對象，使用熒光分析法檢測貴陽地區(qū)新生兒血片樣本葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，召回初篩陽性患兒，采用多色探針熒光溶解曲線法(multicolor meltingcurve analysis，MMCA)進行中國人群常見16種G6PD基因突變類型檢測及比值法檢測G-6-PD酶活性，以期調(diào)查貴陽地區(qū)G6PD 缺乏癥患病率及G6PD 基因突變特征，為本地區(qū)新生兒“蠶豆病”的篩查、診斷、治療和預(yù)防等提供更全面的數(shù)據(jù)參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料研究對象為 2020 年 8 月至 2023 年1 月期間在貴陽市新生兒遺傳代謝性疾病篩查中心進行新生兒遺傳代謝疾病篩查的115462例新生兒。相關(guān)研究獲得貴陽市婦幼保健院倫理委員會審核及批準(科研倫理審查批件 2021-56號)，并征得新生兒監(jiān)護人知情同意。標本的采集、保存和遞送均達到《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范(2010年版)》要求，護士采集足跟血滴于903# 濾紙片上，制成新生兒足跟血干血斑，于一周內(nèi)送至貴陽市新生兒疾病篩查中心，實驗室驗收血片后及時進行實驗檢測。

1.2 主要儀器芬蘭PE Panthera-PuncherTM(產(chǎn)品號2081-0010)半自動打孔儀、芬蘭PE 2021 Genetic Screening Processor(產(chǎn)品號2021-0010)、上海宏石全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96p。

1.3 試劑芬蘭PE公司生產(chǎn)的熒光分析法葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒GSP Neonatal G6PD kit、康寧生命科學(xué)有限公司AXYGEN AP-MN-BL-GDNA-50核酸提取試劑盒、廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的G6PD熒光PCR熔解曲線法基因突變檢測試劑盒(檢測中國人常見的16種G6PD基因突變類型)：c.1024C ＞T、1388G＞A、c.1376G ＞ T、c.383T ＞ C、c.95A ＞ G、c.1387C＞ T、c.392G ＞ T、c.1381G ＞ A、c.1360C ＞ T、c.519 C＞ T、c.487G ＞ A、c.517T ＞ C、c.592C ＞ T、c.871G ＞ A、c.493A ＞G、c.1004C ＞ A。

1.4 G6PD酶活性檢測實驗采用芬蘭PE公司生產(chǎn)的G6PD熒光分析法試劑盒，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作，儀器操作按照PE 2021 Genetic Screening Processor 2021-0010操作程序嚴格進行，新生兒足跟血干血斑G6PD酶活性初篩實驗cut-off值擬定為27 U/dL，即將干血斑樣本實驗測定值 ≤27 U/dL判斷為陽性。第一次檢測值呈陽性則行原血片復(fù)查或召回復(fù)查，原方法復(fù)測測定值再次陽性判讀為G6PD缺乏癥初篩陽性，電話召回初篩陽性患兒，知情同意后抽取患兒外周血行MMCA法G6PD基因突變檢測及比值法酶學(xué)診斷檢測。MMCA法G6PD基因突變檢測：Axygen DNA提取試劑盒人工提取新生兒外周血基因組DNA，點樣后使用上海宏石全自動醫(yī)用SLAN-96p進行基因擴增，再根據(jù)SLAN-96p分析系統(tǒng)FAM、HEX、ROX和Cy5各檢測通道分析比較熔解曲線。判讀規(guī)則：通過比較兩管中FAM、HEX、ROX和Cy5檢測通道試劑盒中野生型對照品與待檢測樣本各通道熔解峰之間熔點(Tm值)的差值，判讀其待測樣本是否發(fā)生突變、基因突變位點以及純雜合突變類型。對疑有試劑盒未覆蓋的未知突變樣本，由廈門致善生物科技股份有限公司完善G6PD基因測序分析。G6PD 酶活性診斷檢測( G6PD/6PGD 熒光比值法)：采用廣州豐華G6PD/6GPD比值法葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒。結(jié)果判斷：G6PD/6PGD≥0.95為正常，0.7≤G6PD/6PGD＜0.95 為輕度缺乏，0.5≤G6PD/6PGD＜0.7為中度缺乏，G6PD/6PGD＜0.5為重度缺乏。

1.5 統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，樣本計數(shù)資料組間比較使用χ2檢驗，檢驗水平α=0.05，P＜0.05則判為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 篩查情況統(tǒng)計2020年8月至2023年1月貴陽地區(qū)共計115462例(男性61801例，女性53661例)活產(chǎn)新生兒完成了G6PD缺乏癥篩查，G6PD缺乏癥初篩陽性率為1.39%(1606/115462)，男性新生兒初篩陽性率1.8 3%(1 1 3 0/6 1 8 0 1)，女性占0.89%(476/53661)，男女間G6PD缺乏癥初篩陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同性別新生兒G6PD酶活性篩查結(jié)果

2.2 召回確診情況1606例(1130例男性，476例女性)初篩陽性兒電話召回1044例(848例男性，196例女性)，召回率65.00%(1044/1606)，根據(jù)其基因診斷和酶學(xué)診斷結(jié)果，上述兩項實驗結(jié)果任一陽性即為確診。確診G6PD缺乏癥患兒1000例(824例男性，176例女性)，總體召回確診與初篩陽性符合率95.79%(1000/1044)，男性召回確診與初篩陽性符合率97.17%(824/848)，女性召回確診與初篩陽性符合率89.80%(176/196)， 推算本地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥總發(fā)生率為1.33%(1.39%＊95.79%)，發(fā)病率=初篩陽性率×召回確診與初篩陽性符合率，男性新生兒發(fā)病率為1.78%(1.83%＊97.17%)，女性新生兒發(fā)病率為0.80%(0.89%＊89.80%)，男女間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 貴陽市新生兒G6 P D 基因突變情況召回初篩陽性患兒1 0 4 4 例(8 4 8 例男性，1 9 6 例女性)，G 6 P D 基因突變率8 7.0 7%(9 0 9/1 0 4 4)，男性新生兒G 6 P D 基因突變率90.09%(764/848)，女性G6PD基因突變率73.98%(145/196)，男女間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同性別新生兒G6PD基因突變結(jié)果

2.4 G6PD基因突變型檢出情況召回樣本中，合計檢出G6PD基因單一突變型13種：c.1024 G ＞ T、c.1388 G ＞ A、c.95 A ＞ G、c.1376 G ＞ T、c.592C ＞ T、c.871 G ＞ A、c.519 C ＞ T、c.392G＞ T、c.493 A ＞ G、c.1004C ＞ A、c.1360C ＞ T、c.383T ＞ C、c.517T ＞ C。6種復(fù)合突變：c.1376 G ＞ T雜合復(fù)合 c.95A ＞ G雜合、c.1024 G ＞ T雜合復(fù)合c.95A ＞ G雜合、c.1024 C ＞ T雜合復(fù)合c.1388 G ＞ A雜合、c.1024 C ＞ T雜合復(fù)合c.519C ＞ T雜合、c.1376 G＞T雜合復(fù)合c.1024 C＞T雜合突變、c.95A＞G雜合復(fù)合c.1388 G＞A雜合突變。從總體來看，貴陽市新生兒最普遍的四種突變型為c.1024 C ＞ T突變258例占28.38%、c.1388 G ＞ A突變230例占25.30%、c.95 A ＞ G突變178例占19.58%、c.1376 G ＞T突變149例占16.39%。其他突變型見表3。對于男性新生兒，G6PD基因突變較易發(fā)生下列四種：c.1024 C ＞ T(29.45%)、c.1388 G ＞ A(27.49%)、c.1376 G ＞ T(17.93%)、c.95 A ＞G(16.23%)。對于女性新生兒，G6PD基因突變較易發(fā)生下列四種：c.95 A ＞ G(28.28%)、c.1024 C ＞ T(22.76%)、c.1376 G ＞T(17.24%)、c.1388 G ＞ A(13.79%)。男女新生兒間G6PD基因突變差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。圖1～圖3為突變圖譜。

圖1 熔解曲線檢測G6PD基因純合突變圖譜。樣本在某個通道有突變峰(橘色曲線)，而其余的熔解峰均為野生峰(黑色曲線)，突變峰熔點(Tm值)68.58℃，野生峰Tm值72.06℃。計算對應(yīng)野生峰與突變峰熔點的差異(ΔTm值)，判讀樣本為1024C ＞ T純合突變型。 圖2 熔解曲線檢測G6PD基因雜合突變圖譜。樣本在某個通道既有野生峰(黑色曲線)又有突變峰(橘色曲線)熔點(Tm值)68.13℃，野生峰Tm值為72.38℃。計算對應(yīng)野生峰與突變峰熔點的差異(ΔTm值)，判讀樣本為1024C ＞ T雜合突變型。 圖3 熔解曲線檢測G6PD基因復(fù)合雜合突變圖譜。樣本在某兩個通道或一個通道有兩個突變峰，其余的熔解峰為野生峰，計算對應(yīng)野生峰與突變峰熔點的差異(ΔTm值)，判讀樣本為c.1024C ＞ T復(fù)合c.1376G ＞ T雜合突變型。

表3 貴陽地區(qū)新生兒G6PD基因突變類型分布

3 討 論

不同地域、不同種族其G6PD缺乏癥發(fā)生率具有差異性，采用熒光定量法在貴陽地區(qū)新生兒中開展G6PD缺乏癥篩查，貴陽地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥篩查陽性率為1.39%，其中男性G6PD缺乏癥初篩陽性率為1.83%，女性G6PD缺乏癥初篩陽性率為0.89%，既往采用熒光斑點定性篩查本地區(qū)G6PD缺乏癥陽性率1.21%[8]，本研究結(jié)果總體與既往報道接近。但高于鄰省四川地區(qū)[9]，低于廣西、重慶、云南地區(qū)[10-12]。既往報道貴州省患病率為3.43%[13]，得益于國家經(jīng)濟發(fā)展、人口流動加劇以及婚育制度的改革等，貴陽地區(qū)G6PD基因突變發(fā)生率明顯下降。

G6PD基因突變特點也有較大的異質(zhì)性，一般表現(xiàn)為某地區(qū)或一定范圍人群以特定的突變基因占優(yōu)勢[14]。從全球范圍來看，地中海沿岸國家以c.563C＞T基因突變?yōu)橹鱗15]，非洲國家以c.202G＞A或c.376A ＞G基因突變?yōu)橹?，然而柬埔寨、老撾等東南亞國家大多以c.871G＞A或c.1311C＞T基因突變?yōu)橹?。?jù)報道[16]，中國人群中G6PD基因突變類型已被檢出達35種，排列前四位高頻突變位點為 c.1376C＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G、c.1024C＞T[17]，其中又以c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95A＞G最常見、最多發(fā)[18-20]，約占G6PD基因總突變類型的70～80%。本研究共檢出 13 個突變位點，前四個最常見的突變依次是c.1024C＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G和c.1376G＞T，占 所 有G6PD 基因變 異 的89.65%。這不同于先前其他地區(qū)的報道[21-23]。c.1024C＞T、c.1388 G＞A、c.95A＞G和c.1376G＞T為本地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥的四大熱點基因突變類型，男女新生兒G6PD基因突變類型與G6PD缺乏癥表型一致性存在明顯差異，表現(xiàn)為男性新生兒患者明顯更高。

酶活性檢測法操作便捷、成本低廉，是臨床上開展較早的診斷G6PD缺乏癥的重要方法，本研究顯示，對于G6PD 基因變異的女性患兒，特別是女性新生兒突變雜合子的G6PD 活性分布廣泛，從嚴重缺乏到正常，無法分辨出明顯的界限值，因此單獨檢測G6PD酶活性不足以診斷女性雜合子，單測G6PD酶活性易引起女性雜合突變患者漏診，女性雜合子的敏感性較低，存在一定漏診率，這與既往報道的觀點相符[24]。采用多色探針熒光PCR熔解曲線法對女性行G6PD基因檢測，大大提高了女性G6PD缺乏癥的檢出率，直接明確突變的位點和性質(zhì)，為臨床提供準確的診斷依據(jù)，可用于臨床上新生兒G6PD缺乏癥的二級篩查方法。對于G6PD缺乏癥初篩陽性新生兒，建議同時結(jié)合酶活性診斷和基因診斷檢測，必要時進行基因測序檢測。臨床工作中尤其是孕產(chǎn)保健科、群體保健科醫(yī)務(wù)人員應(yīng)高度重視G6PD缺乏癥篩查及診斷，建議盡早為孕產(chǎn)婦完善G6PD基因突變檢測，以預(yù)防新生兒高膽紅素的發(fā)生，提高新生人口質(zhì)量。