妊娠合并外陰陰道假絲酵母菌病患者的陰道菌群構(gòu)成＊

張 寧 肖澤兵 張新麗 管曉陽 王艷玲 孫秀麗

濮陽市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心 (河南 濮陽 457000)

外陰陰道假絲酵母菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)是由機(jī)會致病菌假絲酵母菌引起的育齡婦女最常見的一種外陰陰道炎癥性疾病[1-2]。同時(shí)研究表明，妊娠期婦女的假絲酵母菌感染率高于非孕婦女。妊娠合并VVC不僅會對孕婦的身體和心理帶來困擾，還會增加不良妊娠結(jié)局的發(fā)生幾率，嚴(yán)重影響胎嬰健康[3-5]。本研究對孕早、中、晚期合并VVC患者的陰道分泌物進(jìn)行16S rDNA V3V4可變區(qū)測序，并與健康孕婦的陰道微生物組成相比較，試圖對妊娠合并VVC患者的陰道菌群結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行描述和分析[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料本實(shí)驗(yàn)由濮陽市婦幼保健院倫理委員會審核并批準(zhǔn)同意開展。研究對象均為我國漢族人，年齡20～40歲，入選病例的孕周劃分為早孕組(孕5-12+6周)、中孕組(孕13-27+6周)、晚孕組(孕28周以上)。選取 2022年10月至 2023年3月期間在產(chǎn)科門診首次確診為妊娠合并 VVC 患者共 52 例，根據(jù)孕周不同，將妊娠合并 VVC 患者分為早孕組(VE)20例、孕中期(VM)9例、孕晚期(VL)23例；因此，編號VE-01表示 VE 組第1個患者的陰道分泌物，以此類推 VE-02、VE-03、……VE-20，VM-01、VM-02、……VM-09，VL-01、VL-02、……VL-23等。健康孕婦共69例，分別為孕早期(CE)30例、孕中期(CM)9例、孕晚期(CL)30例；編號為CE-01、CE-02、……CE-30，CM-01、CM-02、……CM-09，CL-01、CL-02、……CL-30等。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 妊娠期VVC患者納入標(biāo)準(zhǔn) 臨床表現(xiàn)為外陰瘙癢、灼痛，白帶增多等；外陰潮紅、水腫，陰道內(nèi)見較多白色粘稠凝乳或豆渣樣分泌物；pH小于4.5；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有芽生孢子和假菌絲。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性VVC；細(xì)菌性陰道病、細(xì)胞溶解性陰道病等；糖尿病、免疫系統(tǒng)性疾病、激素治療性疾病等。

1.2.2 健康組納入標(biāo)準(zhǔn) 選取同時(shí)期進(jìn)行孕期檢查的健康孕婦，詳細(xì)詢問病史及用藥史、陰道分泌物Nugent評分等。入組標(biāo)準(zhǔn)需要同時(shí)滿足：無臨床癥狀；陰道清潔度分級為Ⅰ～Ⅱ級；Nugent評分 0～3分；1月內(nèi)未使用抗菌素及陰道局部用藥，3d內(nèi)無性生活史，無糖尿病等。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 經(jīng)研究對象知情同意后，囑咐孕婦先排盡尿液。觀察并記錄外陰、陰道壁、宮頸黏膜有無充血、水腫、白色膜狀覆蓋物等，陰道分泌物的顏色、性狀、量及有無異味。用3根無菌棉式子于陰道后穹隆及上1/3采集分泌物，避免碰觸其他部位以防標(biāo)本污染。1根進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室鏡檢；2根用于陰道分泌物基因組DNA的提取。

1.3.2 標(biāo)本基因組DNA的提取 基因組DNA抽提試劑盒選用 The PowerSoil? DNAIsoilation kit(美國 MOBIO)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用 Nanodrop 2000 進(jìn)行各標(biāo)本基因組DNA的濃度及純度的測定，濃度≥ 20.0ng/μl， OD260/OD280＝1.8～2.0視為合格標(biāo)本，于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并切膠回收以提高純度。

1.3.3 16S rDNA V3V4區(qū)基因擴(kuò)增及Illumina測序 選擇細(xì)菌 16SrDNA V3V4 高變異區(qū)基因片段進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，采用正向引物F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA ，反向引物R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT。送上海派森諾生物技術(shù)股份有限公司，基于Illumina-NovaSeq-6000 測序平臺進(jìn)行測序分析。切膠回收后的PCR產(chǎn)物利用ABI StepOne(ABI，USA)熒光定量分析平臺進(jìn)行定量檢測，計(jì)算每個樣品的測序量，按照合適的比例均勻混合。上機(jī)測序前，樣本逐一質(zhì)檢，且濃度在 2nM 以上視為合格。根據(jù)Illumina NovaSeq 6000 測序平臺要求，將純化后的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行文庫構(gòu)建、測序、分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析測序數(shù)據(jù)用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；α多樣性采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行菌群豐富度和均勻度的比較分析，Beta多樣性使用LEfSe (linear discriminant analysis effect size)[7]分析組間具有顯著差異的標(biāo)志物種；計(jì)數(shù)資料用(%)表示。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 測序結(jié)果本項(xiàng)目采用Illumina平臺對群落DNA片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測序。共完成121例樣品測序，獲得去除singleton后的高質(zhì)量序列10 700 662條Reads，平均每個樣品為88 435 條Reads，最少的樣本為 49 576 條 Reads。經(jīng)QIIME2 軟件注釋，CE組、CM組、CL組、VE組、VM組、VL組分別鑒定出獨(dú)有的所包含的ASV/OTU的數(shù)目為1537個、1036個、5100個、2060個、444個、1778個，其中共有的為112個。見圖1。

圖1 不同組間 OTUs 的韋恩圖。圖2 不同分組的稀釋曲線圖。圖3 CE、VE組的Shannon指數(shù)分布。圖4 CM、VM組的Shannon指數(shù)分布。圖5 CL、VL組的Shannon指數(shù)分布。圖6 CE、VE組的LEfSe分析。圖7 CM、VM組的LEfSe分析。圖8 CL、VL組的LEfSe分析。圖9 不同分組的細(xì)菌門水平物種組成。圖10 不同分組的細(xì)菌屬水平物種組成。

2.2 Alpha多樣性分析 隨著測序深度的增加，各分組中的菌群OTU 曲線趨于平穩(wěn)，表明測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所包含的菌群組成多樣性。見圖2。

Shannon指數(shù)結(jié)合了豐度和均勻度信息，衡量菌落的異質(zhì)性。CE組與VE組、CL組與VL組之間的 Shannon指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，CM組與VM組之間的 Shannon指數(shù)比較，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖3、圖4、圖5。

2.3 物種差異與標(biāo)志物種分析/ LEfSe分析 LEfSe法可以篩選微生物群落的標(biāo)志性物種，直觀清晰地展示了樣本群落中從門到屬(從內(nèi)圈到外圈)主要分類單元的分類等級關(guān)系。圖6在僅有CE組和VE組參與分析時(shí)，藍(lán)色的差異物種在CE組中上調(diào)，紅色的差異物種在VE組中上調(diào)。圖7結(jié)果顯示這些差異物種是在兩組之間產(chǎn)生的，在CM組豐度更高。圖8在僅有CL組和VL組參與分析時(shí)，藍(lán)色的差異物種在CL組中上調(diào)，紅色的差異物種在VL組中上調(diào)。

2.4 物種注釋結(jié)果在門水平上，共發(fā)現(xiàn)25個門，CE組、VE組、CM組、VM組、CL組、VL組均以厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)占主要比例，見圖9。在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)51個屬，見圖10。乳桿菌屬可在全部樣本中檢出,其次為加德納氏菌屬、普雷沃氏菌屬、阿托波菌屬等。CE組占比超過0.5%的主要屬，依次為乳桿菌屬(Lactobacillus) 87.34%, 加德納菌屬(Gardnerella) 4.8%, 阿托波菌屬(Atopobium)4.06%, 鏈球菌屬(Streptococcus)1.64%, 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)0.64%, 普氏菌屬(Prevotella)0.52%.CM組依次為乳桿菌屬(Lactobacillus)74.03 %，加德納菌屬(Gardnerella) 10.88 %，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)10.72 %,普氏菌屬(Prevotella)1.33 %，小球菌屬(Pediococcus)0.51 %.CL組依次為乳桿菌屬88.44%，加德納菌屬4.46%，雙歧桿菌屬1.73%，普氏菌屬0.42%，阿托波菌屬 0.69%.VE組依次為乳桿菌屬(Lactobacillus)60.45 %，加德納菌屬(Gardnerella) 23.76 %，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)6.64 %,阿托波菌屬(Atopobium)4.82 %,普氏菌屬(Prevotella)1.32 %，氣球菌屬(Aerococcus)0.99%.VM組依次為乳桿菌屬(Lactobacillus) 88.19 %，加德納菌屬(Gardnerella) 9.44 %，阿托波菌屬(Atopobium)0.79 %.VL組依次為乳桿菌屬(Lactobacillus) 74.2 %，加德納菌屬(Gardnerella) 18.67 %，阿托波菌屬(Atopobium)4.17 %，氣球菌屬(Aerococcus)0.94 %.

3 討 論

本研究借助Illumina測序平臺對細(xì)菌的16S rDNA序列中的V3V4高變異區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)，妊娠早、中、晚期合并 VVC患者的陰道微生物組成的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門、放線菌門，乳桿菌屬在屬水平的占比最大，其次為加德納菌屬。從相對豐度大于50%為優(yōu)勢菌屬來看,CE組26例樣本的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬(26/30,86.67 %),2例樣本的優(yōu)勢菌屬為加德納菌屬(2/30,6.67%)，1例為阿托波菌屬(1/30,3.33 %)，1例為鏈球菌屬、雙歧桿菌屬與乳桿菌屬混合(1/30,3.33 %)。CM組7例樣本的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬(7/9,86.67 %)，1例為雙歧桿菌屬(1/9，1.11 %)，1例樣本的優(yōu)勢菌屬為加德納菌屬(1/9,1.11 %)。CL組30例樣本中28例的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬(28/30, 93.3 %)，1例樣本的優(yōu)勢菌屬為加德納菌屬(1/30,3.33 %),1例樣本的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬混合(1/30，3.33 %)。個別健康孕婦出現(xiàn)了陰道內(nèi)優(yōu)勢菌群為非乳桿菌、菌種多樣性較高的情況,對此差異性特征還需進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)健康孕婦陰道內(nèi)有豐度極低Anaerococcus、Corynebacterium、Dialister、Varibaculum等。這可能是不同菌種之間的競爭拮抗作用導(dǎo)致了某一菌種的優(yōu)先定植。研究發(fā)現(xiàn)，多個乳桿菌種在維持陰道微生態(tài)方面發(fā)揮了重要的作用[8-10]。

本研究基于二代擴(kuò)增子測序，存在無法準(zhǔn)確分辨種水平信息的局限性，后續(xù)將逐步深入研究。另外，本研究中的陰道樣本未能做到單個孕婦連續(xù)性采樣,無法詳細(xì)描述健康孕婦及妊娠合并VVC患者的陰道菌群動態(tài)變化特征。部分研究組獲得的樣本數(shù)量較少,孕中期納入樣本數(shù)量較少，可能對研究結(jié)果造成一定的偏差。

總之，VVC患者由于妊娠影響機(jī)體免疫能力，陰道內(nèi)弱酸性環(huán)境破壞，優(yōu)勢乳桿菌顯著減少，易受真菌等致病菌的侵襲[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，VVC患者陰道菌群組成及比例發(fā)生了明顯變化，大部分患者的乳桿菌屬減少,加德納菌屬，阿托波菌屬，雙歧桿菌屬，普氏菌屬，氣球菌屬的比例明顯增多。這些細(xì)菌豐度的改變可能與妊娠合并VVC的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有聯(lián)系。