二代測序技術診斷鸚鵡熱衣原體肺炎8例＊

鄭文川 吳敏丹 莊 嘉 吳樹瀚 周琪鵬 蔡俊福 鄭泓斌 張淇釧,*

1.廣東省汕頭大學醫(yī)學院 (廣東 汕頭 515000)

2.廣東省汕頭市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 (廣東 汕頭 515000)

人類鸚鵡熱是一種由鸚鵡熱衣原體引起的人畜共患急性傳染病，鳥類是鸚鵡熱衣原體的自然宿主，人類通常是因為吸入含有鸚鵡熱衣原體的氣溶膠而受感染。鸚鵡熱衣原體肺炎是一種革蘭陰性的專性胞內細菌，進入人體后在肝脾的單核吞噬細胞內復制后通過血液傳播到身體各個器官，肺是最常見的受累器官，嚴重者可引起急性呼吸窘迫綜合征、重癥肺炎。據(jù)一項薈萃分析結果顯示，鸚鵡熱衣原體肺炎占社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)的1%[1]。除了特異性的流行病學接觸史，鸚鵡熱衣原體肺炎的臨床表現(xiàn)多呈非特異性、缺乏靈敏度及特異度高的檢測手段、臨床醫(yī)生對其認知程度較低，常導致誤診、漏診，使鸚鵡熱衣原體肺炎的發(fā)病率被低估。近年來，宏基因組二代測序技術(macrogenome nextgeneration sequencing, mNGS)作為一種新型的病原學檢測方法，因其檢測速度快、準確性高，在未知病原體感染的疑難危重癥的診斷中越發(fā)重要。本文回顧性地分析通過支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)mNGS確診的鸚鵡熱支原體肺炎的流行病學特點、臨床表現(xiàn)、實驗室檢驗結果、肺部影像學特征、治療及預后，提高臨床醫(yī)生對該病的診治水平，減少鸚鵡熱衣原體重癥肺炎的比例。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2021年1月至2022年8月汕頭市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科確診為鸚鵡熱衣原體肺炎的8例患者的臨床資料，包括基本信息、臨床癥狀及體征、實驗室檢查、胸部CT影像學資料、抗菌藥物使用方案、轉歸情況。所有患者均由BALF mNGS檢測確診。本研究已得到汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會審查批準豁免簽署知情同意書，審批號：[2022]科研096號。

1.2 研究方法記錄患者的基本資料(年齡、性別、基礎疾病、鳥禽接觸史)；臨床癥狀及體征；診治過程包括抗菌藥物、呼吸支持情況；記錄患者入院當日及出院前最后一次復查的血常規(guī)、C反應蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、動脈血氣分析；監(jiān)測肝功能的動態(tài)變化(首次、峰值、末次)，如谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)；心肌酶指標如乳酸脫氫酶(LDH)肌酸激酶(CK)。記錄患者入院前第一次胸部CT及后續(xù)復查胸部CT影像學資料；BALF的mNGS檢測結果。

1.3 mNGS檢測嚴格按照臨床操作規(guī)范收集患者BALF標本，于干冰低溫運輸，送至廣州美格醫(yī)學檢驗所進行mNGS檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法應用GraphPad Prism7.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，所有結果均先進行正態(tài)檢驗分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均值±標準差(Mean±SD)表示，進行配對T檢驗或重復測量單因素方差分析。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)，第一個四分位數(shù)，第三個四分位數(shù)(Median,P25-P75)進行描述，進行wilcoxon非參數(shù)檢驗法。分類資料以數(shù)值(百分比)進行描述。若P＜0.05則表示此結果具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 基本資料8 例患者中男性1 例，女性7 例，平均年齡(56.25±16.53)歲。既往患高血壓2例、心功能不全1例、卵巢癌1例、頭部外傷后精神疾病1例、結締組織病待排1例。半數(shù)否認鳥禽接觸史，2例有明確鳥類接觸史，2例因居住于市場旁，可疑接觸史。(見表1)

2.2 臨床表現(xiàn)本研究臨床表現(xiàn)主要分為發(fā)熱、肺內癥狀、肺外癥狀。8例患者均有高熱，體溫峰值為39.3～40.5℃，平均(39.94±0.4)℃。8例患者肺內癥狀均有咳嗽，其中4例為干咳(4/8)，伴有畏寒寒戰(zhàn)(3/8)、鼻塞流涕(1/8)、胸悶痛(2/8)。肺外癥狀出現(xiàn)神經系統(tǒng)表現(xiàn)的有一過性暈厥(1/8)、頭暈(2/8)、反應遲鈍(1/8)、亂語躁動(1/8)、精神疲倦(2/8)，出現(xiàn)消化系統(tǒng)表現(xiàn)的有納差(5/8)、惡心嘔吐(1/8)，出現(xiàn)非特異性表現(xiàn)有四肢乏力(2/8)、肌肉酸痛(1/8)。(見表1)

2.3 實驗室檢查8例患者血常規(guī)檢驗結果中，半數(shù)出現(xiàn)白細胞計數(shù)升高，平均(11.24±3.71)×109/L(圖1A)，大多數(shù)患者出現(xiàn)中性粒細胞數(shù)量升高(7/8)，伴淋巴細胞數(shù)量降低(6/8)；所有患者血象均表現(xiàn)為中性粒細胞比例升高(84.69±7.55，%，圖1B)伴淋巴細胞比例降低(9.66±4.34，%，圖1C)；有2例出現(xiàn)輕度貧血。炎癥指標中，所有患者的CRP均顯著升高，波動在32～344mg/L，初診為(211.6±102.2)mg/L(圖1D)；所有患者PCT均顯著升高，初診為0.788(0.304-4.40)ng/ml(圖1E)；心肌酶譜中，8例患者有4例出現(xiàn)肌酸激酶升高，峰值在309～4727U/L(圖1F)，只有2例出現(xiàn)肌酸激酶同工酶升高，但只有1例出現(xiàn)肌鈣蛋白I輕微升高；有6例出現(xiàn)乳酸脫氫酶升高，峰值波動在345～822U/L；肝功能指標中提示所有患者的肝功能均受到不同程度的損害，谷丙轉氨酶峰值在45～196U/L，均值為(105±49.43)U/L, (圖1G)；谷草轉氨酶峰值在47～345U/L，均值為(147.38±107.91)U/L, (圖1H)，而膽紅素未見明顯升高；所有患者均出現(xiàn)白蛋白明顯下降，谷值波動在19.31～33.1g/L，均值為(27.65±4.53)g/L。8例患者中血氣分析提示只有1例患者出現(xiàn)I型呼吸衰竭(病例8)。

圖1 鸚鵡熱衣原體肺炎8例的住院期間實驗室檢驗結果。注：血常規(guī)結果中：白細胞數(shù)量(WBC, A)輕度升高，中性粒細胞比例(NEU%, B)均明顯升高，淋巴細胞比例均明顯下降(LYM%.C)，經治療后基本可恢復至正常。炎癥指標中：C反應蛋白(CRP, D)、降鈣素原(PCT, E)顯著升高，經治療后可明顯下降。心肌酶譜中，肌酸激酶(CK，F(xiàn))有半數(shù)明顯升高，但經治療后可明顯降至正常。肝酶指標中，谷丙轉氨酶(ALT, G)及谷草轉氨酶(AST,H)在病程中呈現(xiàn)不同程度的升高，經治療后均可明顯好轉。紅色虛線：正常值上限，綠色虛線：正常值下限。*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001，****＜0.0001。

2.4 影像學檢查所有患者在初診及病情好轉時均接受胸部CT影像學檢查，病變以單側多見(7/8)，只有1例為雙肺彌漫性病變。浸潤肺段累及右肺下葉(4/8)、左肺上葉(4/8)、左肺下葉(3/8)、右肺上葉(2/8)。胸部CT影像學特征有斑片磨玻璃影(1/8，見圖2A)、團塊狀實變(1/8，見圖2B)、斑片狀滲出實變(7/8，見圖2C)、胸腔積液(5/8)、支氣管充氣征(2/8)、縱膈淋巴結腫大(1/8)。所有患者經治療后復查胸部CT均可見病灶較前明顯吸收至消失，典型影像學病灶好轉可見圖2D。

圖2 鸚鵡熱衣原體肺炎部分胸部CT影像學表現(xiàn)。注：圖2A：病例8呈現(xiàn)雙肺彌漫性磨玻璃影。圖2B：病例1呈現(xiàn)右下肺團塊樣實變孤立病灶。圖2C：病例7均呈現(xiàn)單葉肺大片實變，圖2D：病例7經治療25天后復查的胸部CT結果，提示治療后原發(fā)病灶已消失。

2.5 mNGS檢測所有患者均行氣管鏡檢查并行肺泡灌洗術，通過肺泡灌洗液mNGS檢測明確診斷。經mNGS可檢測出鸚鵡熱衣原體外，4例檢出白色念珠菌，2例檢測出微小微單胞菌，1例檢出肺炎鏈球菌，1例檢出紋帶棒狀桿菌、1例檢出人類腺病毒C型。這些多考慮為背景菌或者定植菌。(見表2)

表2 鸚鵡熱衣原體肺炎8例的mNGS檢測結果

2.6 治療及轉歸8例患者在明確診斷前均接受了經驗性抗感染藥物治療，抗感染藥物包括碳青霉烯類抗生素、頭孢菌素、青霉素類復合制劑、喹諾酮類，同時有4例同時接受奧司他韋抗病毒，但初始治療效果不佳。明確診斷后4例應用多西環(huán)素、2例應用奧瑪環(huán)素、2例應用莫西沙星。8例患者均有重癥傾向，其中1例需高流量氧療(病例2：加溫加濕高流量氧療1周)。治療療程14～21天，經治療后未見發(fā)熱，癥狀明顯好轉出院，隨訪末次復查胸部CT均可見肺內病灶吸收至消失。所有患者起病至確診時間為6～33天，平均(11.25±9.08)天；而自入院至確診時間為3～5天，平均(3.86±0.99)天；住院天數(shù)為8～14天，平均(10.38±2.72)天。(見表3)。

表3 鸚鵡熱衣原體肺炎8例的診治情況

3 討 論

鸚鵡熱衣原體是一種需氧、革蘭陰性、嚴格胞內寄生的病原菌，宿主主要為鳥類或家禽。該病原菌通過病畜或無癥狀感染者的排泄物或分泌物而排出，人類通過呼吸道吸入被其污染的氣溶膠而被感染[2-3]。此外亦有人傳人的報道，但較為罕見[3-4]。人類感染后可引起急性、亞急性、慢性多系統(tǒng)器官受累，肺部是最常見的受累器官，嚴重者可引起急性呼吸窘迫綜合征、重癥肺炎，潛伏期多為7～15天[2]。據(jù)一項薈萃分析結果顯示，鸚鵡熱衣原體肺炎占CAP的1%[1]；但2022年一項在我國進行的多中心前瞻性研究發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體肺炎占據(jù)CAP病因的7.5%[5]。然而由于鸚鵡熱衣原體的檢測手段較為局限，其真實世界的發(fā)病率可能有所低估。因此，有鳥類或家禽接觸史的肺炎患者，臨床上需高度警惕鸚鵡熱衣原體肺炎的可能。我們報道的8例患者中，2例有明確的鳥類接觸史；2例因居住在市場旁，有可疑的家禽接觸史；而有4例無明確的鳥類接觸史。

鸚鵡熱衣原體經過呼吸道進入血液后，在肝脾的單核巨噬細胞吞噬，寄生于細胞內增殖，再經血行播散至全身各個器官，所以臨床癥狀呈多樣性，除了累及呼吸系統(tǒng)之外，還會出現(xiàn)心臟、肝臟、胃腸道、中樞神經癥狀[6-11]。本研究中，8例患者均有高熱，且經驗性抗感染效果退熱效果均不佳，4例為干咳為主，4例伴有咳白粘痰，3例出現(xiàn)中樞神經系統(tǒng)癥狀(暈厥、反應遲鈍、亂語、躁動、頭暈頭痛)，1例出現(xiàn)惡心嘔吐。所以在CAP患者中高熱、咳嗽咳痰伴有明顯肺外癥狀時，除了軍團菌肺炎、病毒性肺炎外，需警惕鸚鵡熱衣原體肺炎，鳥類或家禽接觸史是較為特殊的鑒別點。在衣原體中，鸚鵡熱衣原體的繁殖速度相對快、致病能力也更強，在短期內病情可進展至重癥肺炎，因此在疾病早期診斷和盡早治療極為關鍵[12]。

本研究輔助檢查結果顯示：(1)50%患者出現(xiàn)白細胞升高，有1例(病例1)明顯升高，考慮患者高齡，合并感染，因此白細胞明顯升高。所有患者中性粒細胞比例明顯上升、淋巴細胞比例明顯下降；這與既往研究的結果一致[8-11]，他們的研究結果顯示白細胞數(shù)目正常、略有升高甚至減低，猜測可能與鸚鵡熱衣原體可以感染人體內大部分細胞從而達到免疫逃逸，亦可能與感染開始時機體免疫功能受到抑制有關[13]。(2)炎癥指標如CRP、PCT均明顯升高。(3)病情進程中可見肝酶(谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶)水平升高但不伴有膽紅素升高。心肌酶譜中，肌酸激酶、乳酸脫氫酶常有明顯的升高，但肌鈣蛋白I并未見明顯升高。本研究所有患者的血肌酐尚在正常值范圍內，但既往研究發(fā)現(xiàn)重癥患者常可出現(xiàn)腎功能損害[14]。這提示鸚鵡熱衣原體肺炎?？珊喜⒏闻K、心臟、腎臟受損，因此，在肺炎治療過程中需監(jiān)測肝腎功能、心功能、腎功能。(4)胸部CT影像學表現(xiàn)以單側病變多見，病情加重累及多葉甚至雙肺，此時?？蛇M展成重癥肺炎。主要以大片實變伴支氣管充氣征為主，但可出現(xiàn)磨玻璃影、結節(jié)灶、少量胸腔積液。本研究中病例1以單側團塊狀病灶為主要影像學表現(xiàn)，與腫瘤病變鑒別困難。

迄今為止，鸚鵡熱衣原體的診斷多數(shù)是基于臨床表現(xiàn)和接觸史，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)，沒有明確接觸史的患者診斷鸚鵡熱也是常見的，因此臨床上鸚鵡熱衣原體的發(fā)病率仍被低估。傳統(tǒng)的鸚鵡熱衣原體診斷方法包括病原體分離培養(yǎng)、特異性IgG抗體滴度、熒光定量PCR，但培養(yǎng)及血清檢測周期長、陽性率低、需專業(yè)實驗室支持，常出現(xiàn)漏診、誤診，因此PCR檢測目前已經取代培養(yǎng)成為鸚鵡熱衣原體診斷的金標準[15]。mNGS可以將多種樣本中的微生物核酸序列通過高通量測序技術與數(shù)據(jù)庫中已有的微生物核酸序列進行比對分析；受先前抗生素暴露的影響較小，可以快速識別潛在的病原體，因此在不明原因肺炎的病原學檢測方面有較好的前景。近年來，mNGS技術在診斷鸚鵡熱衣原體肺炎的相關報道越來越多[16-20]，可見mNGS已成為鸚鵡熱衣原體的主要診斷方法之一；鸚鵡熱衣原體在正常人體內是不存在的，通常1/100萬即可考慮鸚鵡熱衣原體感染[16]。因mNGS可檢測多種標本，既往研究中常見標本有血、痰、BALF，然而相對于外周血，器官特異性來源的樣本是更能準確且針對性評估靶器官病情的最佳樣本，既往研究也顯示，外周血相對于BALF在鸚鵡熱衣原體的序列數(shù)明顯減少[21]。相對于痰標本，BALF減少了口腔定期菌污染的概率，降低了誤診的概率，因此本研究應用BALF作為送檢mNGS的標本，成功地確診了鸚鵡熱衣原體肺炎。

鸚鵡熱衣原體肺炎疾病進展快，重癥比例高，早期診斷早期治療常有更好的預后。鸚鵡熱衣原體肺炎可用的抗菌藥物有四環(huán)素類(多西環(huán)素、米諾環(huán)素)、喹諾酮類(莫西沙星、左氧氟沙星)、大環(huán)內酯(阿奇霉素)類。臨床上首選多西環(huán)素，輕中癥患者可選擇口服劑型治療，重癥患者推薦靜滴劑型，必要時需聯(lián)合喹諾酮類，療程建議14～21天；當四環(huán)素類有禁忌癥時，如孕婦，推薦選用大環(huán)內酯類如阿奇霉素[22-23]。本研究中病例均有重癥傾向，平均入院后確診時間為3.8天，確診后4例予應用多西環(huán)素、2例予應用莫西沙星、2例予應用奧瑪環(huán)素，其中3例因合并感染需聯(lián)合應用抗菌藥物，所有患者均癥狀明顯好轉而出院，復查胸部CT提示肺部病灶均明顯吸收。因此早期明確診斷選用合適抗菌藥物可明顯降低重癥肺炎比例、減少抗菌藥物的不恰當使用。奧瑪環(huán)素是一種新型的四環(huán)素類藥物，為米諾環(huán)素的衍生物，是首個臨床應用的氨甲基四環(huán)素類品種，具有更廣的抗菌譜、更好的藥代動力學。本研究2例應用奧瑪環(huán)素治療鸚鵡熱衣原體肺炎效果佳，為奧瑪環(huán)素在鸚鵡熱中的應用提供臨床證據(jù)。

綜上所述，除了典型的鳥類/家禽接觸史，鸚鵡熱衣原體肺炎有一定的臨床特征，但臨床診斷仍然困難。而mNGS具有檢測快、準確性高，有助于早期明確診斷、盡早選用敏感抗菌藥物、減少抗菌藥物不恰當使用、改善預后，可推薦應用于不明原因高熱且懷疑鸚鵡熱衣原體肺炎的患者。鸚鵡熱衣原體肺炎一旦確診，推薦應用多西環(huán)素治療；奧瑪環(huán)素為新型四環(huán)素類藥物，在本病亦有明顯的療效。但mNGS費用高，臨床醫(yī)師需嚴格把握應用指征。