乙酰輔酶A羧化酶相關(guān)樹突狀細(xì)胞標(biāo)記預(yù)測肝癌患者的預(yù)后及潛在治療藥物識別

閆長孟 韓君

[摘要]?目的?研究乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coa?carboxylase?1，ACACA）基因在肝癌中的表達(dá)、預(yù)后價值及其與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，構(gòu)建肝癌預(yù)后模型。方法?整合基因型組織表達(dá)（genotype-tissue?expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫和癌癥基因組圖譜（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)分析ACACA基因在癌癥及癌旁組織的表達(dá)差異，預(yù)后分析。分析ACACA與免疫細(xì)胞的相關(guān)性。使用GSE156625單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single?cell?RNA?seq，scRNA-seq）數(shù)據(jù)研究ACACA在樹突狀細(xì)胞（dendritic?cells，DCs）中的表達(dá)。建立基于載脂蛋白C-Ⅰ（apolipoprotein?c-Ⅰ，APOC1）和載脂蛋白C-Ⅲ（apolipoprotein?c-Ⅲ，APOC3）的肝細(xì)胞癌（hepatocellular?carcinoma，HCC）預(yù)后模型，使用Kaplan-Meier生存曲線和時間依賴性受試者操作特征（receiver?operator?characteristic，ROC）曲線評估預(yù)后能力，并通過分子對接分析中藥成分在APOC1和APOC3中的作用。結(jié)果?ACACA在多種癌癥中表達(dá)差異顯著，與肝癌預(yù)后相關(guān)。高表達(dá)ACACA降低樹突狀細(xì)胞含量。APOC1和APOC3是主要DCs標(biāo)記基因，與ACACA表達(dá)正相關(guān)?；贏POC1和APOC3的原發(fā)性HCC預(yù)后模型具有中等的敏感性和特異性。使用列線圖預(yù)測TCGA隊(duì)列中肝癌患者的1年，3年和5年總生存期（overall?survival，OS）的可能性，并通過校準(zhǔn)曲線分析證實(shí)了其可靠性。Salvianolic?acid?B、Asiaticoside和Neohesperidin可能對APOC1和APOC3具有作用潛力。結(jié)論?ACACA與肝癌預(yù)后密切相關(guān)，基于APOC1和APOC3的預(yù)后模型可作為預(yù)測指標(biāo)，部分中藥成分可能對肝癌治療有潛力。

[關(guān)鍵詞]?肝癌；乙酰輔酶A羧化酶；預(yù)后；免疫細(xì)胞；DCs細(xì)胞標(biāo)記基因

[中圖分類號]?R735.7????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.05.018

Prediction?of?prognosis?and?identification?of?potential?therapeutic?agents?for?liver?cancer?patients?based?on?acetyl-coa?carboxylase?1-associated?dendritic?cell

YAN?Changmeng1，?HAN?Jun2

1.Department?of?Gastroenterology，?Huludao?Central?Hospital，?Huludao?125000，?Liaoning，?China;?2.Traditional?Chinese?Medicine?Research?Institute，?Beijing?Tcmages?Pharmaceutical?Co.，?Ltd.，?Beijing?101301，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?expression，?prognostic?value?of?acetyl-coa?carboxylase?1?（ACACA）?gene?in?liver?cancer，?its?correlation?with?immune?cells，?and?to?construct?a?prognostic?model.?Methods?Integrating?genotype-tissue?expression?（GTEx）?and?the?cancer?genome?atlas?（TCGA）?data?to?analyze?ACACA?expression?in?cancers?and?adjacent?tissues，?and?perform?prognosis?analysis.?Examine?the?correlation?between?ACACA?and?immune?cells.?Use?GSE156625?cell?RNA?seq?（scRNA-seq）?data?to?study?ACACA?expression?in?dendritic?cells?（DCs）.?Construct?an?hepatocellular?carcinoma?（HCC）?prognosis?model?based?on?apolipoprotein?c-Ⅰ（APOC1）?and?apolipoprotein?c-Ⅲ?（APOC3），?using?Kaplan-Meier?survival?curves?and?time-dependent?receiver?operator?characteristic?（ROC）?curves?to?evaluate?prognostic?capability，?and?analyze?the?effect?of?traditional?Chinese?medicine?components?on?APOC1?and?APOC3?through?molecular?docking.?Results?ACACA?shows?significant?differential?expression?in?various?cancers?and?is?associated?with?the?prognosis?of?liver?cancer.?High?expression?of?ACACA?reduces?the?content?of?dendritic?cells.?APOC1?and?APOC3，?the?major?DCs?marker?genes，?were?positively?correlated?with?ACACA?expression.?Using?Kaplan-Meier?curves，?we?predicted?the?1-year，?3-year，?and?5-year?overall?survival?（OS）?probabilities?for?HCC?patients?in?the?TCGA?cohort，?and?confirmed?the?reliability?through?calibration?curve?analysis.?Salvianolic?acid?B，?Asiaticoside，?and?Neohesperidin?may?have?potential?effects?on?APOC1?and?APOC3.?Conclusion?ACACA?is?closely?related?to?HCC?prognosis，?and?the?prognostic?model?based?on?APOC1?and?APOC3?can?serve?as?a?predictive?indicator.?Some?traditional?Chinese?medicine?components?may?hold?therapeutic?potential?for?HCC?treatment.

[Key?words]?Liver?cancer;?Acetyl-coa?carboxylase?1?（ACACA）;?Prognosis;?Immune?cells;?DCs?cell?marker?genes

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。隨著科技的進(jìn)步，肝癌研究的重點(diǎn)向分子水平轉(zhuǎn)化，人們也越來越關(guān)注肝癌治療的新方法，如靶向治療、免疫治療、基因治療等。乙酰輔酶A羧化酶?（acetyl-coa?carboxylase?1，ACACA）是一種參與調(diào)節(jié)脂肪酸合成和氧化代謝的平衡的酶。研究表明，ACACA的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其中包括肝癌[1-3]。ACACA的表達(dá)在肝癌組織中顯著增加，與肝癌的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。抑制ACACA的表達(dá)可以有效地抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移[4-5]。這提示，ACACA可能是肝癌治療的一個潛在靶點(diǎn)。然而，其具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入地研究來揭示。

樹突狀細(xì)胞（dendritic?cell，DC）是一類重要的抗原呈遞細(xì)胞，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的激活和增殖，從而發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[6]。研究表明，肝癌患者的DC細(xì)胞功能通常受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體對肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視降低。因此，增強(qiáng)DC細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，可以提高機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[7]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single?cell?RNA?seq，scRNA-seq）等生物信息學(xué)方法對數(shù)據(jù)庫中的肝癌細(xì)胞進(jìn)行研究，分析ACACA是否通過改變DC細(xì)胞浸潤水平影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展，在此基礎(chǔ)上尋找合適的治療靶點(diǎn)，以期為肝癌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1??資料與方法

1.1??一般資料

基因型組織表達(dá)（genotype-tissue?expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫（http：//commonfund.nih.gov/GTEx）用于研究不同組織之間以及正常組織和腫瘤組織之間的差異基因表達(dá)。癌癥基因組圖譜（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載肝細(xì)胞癌（hepatocellular?carcinoma，HCC）患者的高通量RNA-seq數(shù)據(jù)，基因表達(dá)譜通過每千個堿基對的片段/每百萬個圖讀（fragments?per?kilobase?of?exon?model?per?million?mapped?fragments，F(xiàn)PKM）歸一化估計(jì)和基于log2的轉(zhuǎn)化進(jìn)行定量。從基因表達(dá)綜合（gene?expression?omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫獲得225個肝癌樣本（GSE14520）的log2（rma-calculated?Signal?intensity）形式的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)。單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集來源于肝細(xì)胞癌樣本GSE156625，16 335個癌旁單細(xì)胞數(shù)量和57254肝癌單細(xì)胞數(shù)量。

1.2??方法

1.2.1??ACACA基因表達(dá)數(shù)據(jù)提取和泛癌差異分析

根據(jù)組織來源，本研究分析了ACACA基因在???31個正常組織中的表達(dá)水平。其次，從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載33種腫瘤數(shù)據(jù)。根據(jù)以下數(shù)值確定閾值，以分析33腫瘤中ACACA基因的表達(dá)差異，由于TCGA數(shù)據(jù)庫中正常樣本較少，本研究將GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合比較，以分析ACACA基因在不同腫瘤中的差異性表達(dá)。

1.2.2??ACACA基因泛癌預(yù)后分析??利用加州大學(xué)圣克魯斯分校（university?of?california?santa?cruz，UCSC）（https：//xenabrowser.net/）數(shù)據(jù)庫獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中不同ACACA對腫瘤患者總生存期（overall?survival，OS）的影響，使用R軟件包survival的coxph函數(shù)建立Cox比例風(fēng)險回歸模型以分析基因表達(dá)與每個腫瘤中的預(yù)后關(guān)系，使用時序檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)獲得預(yù)后顯著性，設(shè)定臨界值-高（50%）和臨界值-低（50%）作為拆分高表達(dá)組和低表達(dá)組的表達(dá)閾值，探索ACACA基因表達(dá)與腫瘤患者生存因素之間的表達(dá)模式。

1.2.3??ACACA與免疫浸潤細(xì)胞分析??通過ssGSEA算法計(jì)算每個樣本的免疫浸潤程度，使用R包GSVA對TCGA和GSE14520中的測序樣本進(jìn)行免疫評分。然后根據(jù)ACACA中位值將免疫細(xì)胞評分分為高、低表達(dá)2組，分析ACACA與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。

1.2.4??單細(xì)胞分析??Seurat軟件包用于分析scRNA-?seq數(shù)據(jù)并且篩選掉所有出現(xiàn)次數(shù)少于3次的基因特征，使用Wilcox算法提取每個集群的差異基因，篩選掉P>0.05的數(shù)據(jù)。使用sctransform進(jìn)行再聚類，使用harmony根據(jù)樣品間差異做去批次效應(yīng)，通過尋找elbow?plot上的拐點(diǎn)決定使用多少個PC進(jìn)行分群，使用umap降維，根據(jù)Wilcox算法找出高表達(dá)的差異基因，查看各個基因在樣本中的分布作為分群依據(jù)，注釋樣本。

1.2.5??ACACA相關(guān)樹突細(xì)胞（dendritic?cell，DCs）標(biāo)記基因的鑒定??以log2

1.2.6??預(yù)后模型的構(gòu)建??肝癌樣本納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性HCC的患者；②完整的臨床病理特征；③OS設(shè)定為主要終點(diǎn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?HCC以外的腫瘤的患者；②生存狀態(tài)和臨床病理參數(shù)缺失。首先進(jìn)行多變量Cox回歸分析，生成風(fēng)險評分模型。隨后，使用“survminer”軟件包，獲得最佳臨界值。將TCGA數(shù)據(jù)庫中的原發(fā)HCC患者聚類為高風(fēng)險和低風(fēng)險組，通過Kaplan-Meier測試兩組之間的生存差異，繪制了時間依賴的受試者操作特征（receiver?operator?characteristic，ROC）。最后，使用“complex?heatmap”?R程序包在熱圖中顯示了特征基因與HCC患者個人風(fēng)險評分的相關(guān)性。

1.2.7??模型的預(yù)后價值評估??使用單因素和多因素Cox回歸分析來評估HCC患者的預(yù)后模型是否可以獨(dú)立于其他臨床病理變量（包括年齡、性別、組織分級、病理分期，T分期和風(fēng)險評分）。選擇臨床特征作為自變量，并選擇OS作為因變量，并計(jì)算危險比（hazard?ratio，HR）、95%置信區(qū)間和P值。

1.2.8??肝癌生存預(yù)測列線圖的建立及模型評估??將復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)預(yù)測模型簡化為用于評估個別患者OS可能性的列線圖。本研究納入了從Cox回歸分析中選擇的所有獨(dú)立的臨床病理預(yù)后因素，以構(gòu)建能夠評估HCC患者1年、3年和5年OS可能性的列線圖。通過校準(zhǔn)曲線、C指數(shù)、多指標(biāo)ROC和臨床決策曲線對預(yù)測模型進(jìn)行效能評估。

1.2.9??載脂蛋白C（apolipoprotein?c，APOC1）和APOC3對應(yīng)中藥成分預(yù)測??從中藥數(shù)據(jù)庫中獲取蛋白分子的sdf文件，并使用openbabel進(jìn)行加氫。在autoDock?Tools中對蛋白模型，進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷；利用Autodock?vina進(jìn)行小分子對接計(jì)算，每個分子共對接100次，選擇構(gòu)象最佳的對接結(jié)果，最后保留APOC1和APOC2虛擬篩選的共同的3個結(jié)果，使用Pymol?2.2軟件進(jìn)行分析。

2??結(jié)果

2.1??ACACA基因泛癌表達(dá)差異分析

在33癌癥中有18種癌癥ACACA高表達(dá)（P<0.05），分別為膀胱尿路上皮癌（bladder?urothelial?carcinoma，BLCA）、宮頸鱗癌和腺癌（cervical?squamous?cell?carcinoma?and?adenocarcinoma，CECS）、膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、結(jié)腸癌（colon?cancer，COAD）、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse?large?B-cell?lymphoma，DLBC）、食管癌（esophageal?cancer，ESCA）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head?and?neck?squamous?cell?carcinoma，HNSC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（renal?papillary?cell?carcinoma，KIRP）、腦低級別膠質(zhì)瘤（low?grade?gliomas?of?the?brain，LGG）、肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular?carcinoma，LIHC）、肺腺癌（lung?adenocarcinoma，LUAD）、肺鱗癌（lung?squamous?carcinoma，LUSC）、胰腺癌（pancreatic?cancer，PAAD）、前列腺癌（prostatic?cancer，PRAD）、直腸腺癌（rectal?adenocarcinoma，READ）、胃癌（gastric?cancer，STAD）、胸腺癌（thymic?carcinoma，THYM）和子宮內(nèi)膜癌（endometrial?cancer，UCEC）；在腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical?carcinoma，ACC）、腎透明細(xì)胞癌（renal?clear?cell?carcinoma，KIRC）、卵巢漿液性囊腺癌（serous?cystadenocarcinoma，OV）和甲狀腺癌（thyroid?cancer，THCA）低表達(dá)（P<0.05）。

2.2??ACACA基因泛癌預(yù)后分析

在7個腫瘤類型：LIHC?[P<0.001，HR=1.56（1.24～1.94）]、葡萄膜黑色素瘤（uveal?melanoma，UVM）[P=0.004，HR=3.022（1.395～6.549）]、腎嫌色細(xì)胞癌（chromophobe?renal?cell?carcinoma，KICH）[P=0.020，HR=1.253（1.032～1.521）]、ACC?[P=0.007，HR=1.779（1.163～2.72）]、急性髓細(xì)胞樣白血?。╝cute?myeloid?leukemia，LAML）[P=0.020，HR=1.253（1.032～1.521）]、間皮瘤（mesothelioma，MESO）[P=0.030，HR=1.453（1.036～2.036）]中高表達(dá)預(yù)后差，在LGG?[P=0.010，HR=0.644（0.458～?0.906）]中低表達(dá)預(yù)后差。

2.3??ACACA與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

根據(jù)ACACA基因表達(dá)的中位值將免疫細(xì)胞評分分為高低表達(dá)2組，分析ACACA與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)相較于ACACA低表達(dá)組，ACACA高表達(dá)組樹突狀細(xì)胞含量降低（P<0.01）。通過分析GSE156625隊(duì)列的scRNA-seq數(shù)據(jù)，確認(rèn)了116個DCs標(biāo)記基因前10個差異基因，其中，2個DCs相關(guān)基因在TCGA數(shù)據(jù)集中被確定為與ACACA顯著相關(guān)。Cox模型篩選得到APOC1和APOC3。風(fēng)險評估顯示，APOC1和APOC3高表達(dá)預(yù)后較差。

2.4??生存分析

TCGA數(shù)據(jù)集集中高風(fēng)險和低風(fēng)險組之間的OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），1、3和5年生存期相對應(yīng)的2基因模型的ROC曲線下面積（area?under?curve，AUC）為0.69、0.60和0.62，表明該預(yù)測模型具有中等的敏感度和特異性。多因素Cox回歸分析表明，未發(fā)現(xiàn)與OS相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素。

2.5??模型的預(yù)后價值評估

為了建立可預(yù)測HCC患者生存可能性的臨床適用方法，本研究開發(fā)了列線圖來預(yù)測TCGA隊(duì)列中肝癌患者1年、3年和5年OS的可能性。列線圖的預(yù)測因素包括六個預(yù)后因素（年齡，性別，病理分期、病理分級、T分期和風(fēng)險評分）（圖1A）。通過校準(zhǔn)曲線分析，本研究發(fā)現(xiàn)由列線圖預(yù)測的1年、3年和5年生存概率與觀察到的生存概率密切相關(guān)，這證實(shí)了列線圖的可靠性（圖1B）。列線圖的C指數(shù)為0.698（0.670～0.725），具有中等的判別能力。多指標(biāo)ROC顯示模型具有中等的臨床預(yù)測性能（圖1C）。臨床決策曲線表明，當(dāng)納入風(fēng)險評分時，肝癌患者凈收益顯著提升（圖1D）。

2.6??中藥成分預(yù)測與分子對接

通過虛擬篩選，獲得Salvianolic?acid?B、Asiaticoside、Neohesperidin?3個結(jié)果。Salvianolic?acid?B在APOC1和APOC3中的對接打分分別為?7.225kcal/mol和?4.344kcal/mol。在APCO1中，Salvianolic?acid?B與Val17和Lys36形成氫鍵；在APOC3中，Salvianolic?acid?B和Ser49，Gln54?and?Gln58形成氫鍵。Asiaticoside在APOC1和APOC3中的對接打分分別為?6.795kcal/mol和?4.247kcal/mol。在APCO1中，Asiaticoside與Gly26?Val17?Asp35和Glu39形成氫鍵；在APOC3中，Asiaticoside和Ser49形成氫鍵。Neohesperidin在APOC1和APOC3中的對接打分分別為?6.656kcal/mol和?4.025kcal/mol，在APCO1中，Neohesperidin與Ala24?Gly26和Val17形成氫鍵；在APOC3中，Neohesperidin與Ser49和Gln58形成氫鍵。

3??討論

肝癌的發(fā)病率和死亡率在不斷上升，已經(jīng)成為威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。對肝癌的相關(guān)性研究已經(jīng)成為當(dāng)前熱門的研究領(lǐng)域之一。ACACA對于維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡起著重要的作用。研究表明，ACACA可能通過參與脂質(zhì)代謝過程、抑制肝癌細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)肝癌發(fā)展。ACACA的高表達(dá)水平與肝癌的免疫浸潤程度相關(guān)，對免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能有直接的影響[10-11]。本研究通過整合GTEx數(shù)據(jù)庫中正常組織的數(shù)據(jù)和TCGA腫瘤組織的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在33種腫瘤及癌旁組織中，ACACA在18種癌癥中高表達(dá)，其中包括肝癌，且ACACA高表達(dá)在肝癌中預(yù)后差。這些結(jié)果表明ACACA在肝癌中具有潛在的預(yù)后和治療作用。

DCs細(xì)胞是一類重要的抗原提呈細(xì)胞，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和攻擊[12]。研究表明，肝癌患者的DC細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其功能也受到抑制[13]。DCs細(xì)胞的缺陷導(dǎo)致肝癌患者對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除能力降低，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在ACACA高表達(dá)的肝癌組織中，DCs細(xì)胞含量顯著降低，且ACACA在DCs細(xì)胞中表達(dá)顯著降低。提示ACACA可能通過降低DCs細(xì)胞含量，參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

APOC1和APOC3是兩個與高密度脂蛋白相關(guān)的基因，對心血管疾病有保護(hù)作用[15]。APOC1和APOC3與肝癌的發(fā)生和發(fā)展也密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，APOC1和APOC3的表達(dá)水平在肝癌組織中顯著高于正常組織，并且與肝癌的分級和預(yù)后相關(guān)[16]。此外，APOC1和APOC3的表達(dá)水平升高會促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[17]。本研究中，通過肝癌中ACACA相關(guān)的DCs細(xì)胞篩選得到了APOC1和APOC3這兩個標(biāo)志物，并且預(yù)測到APOC1和APOC3高風(fēng)險組的預(yù)后較差。分子對接的結(jié)果表明，中藥成分如Salvianolic?acid?B、Asiaticoside和Neohesperidin能夠與APOC1和APOC3相互作用。結(jié)果提示，APOC1和APOC3可能成為肝癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物，并為開發(fā)新型肝癌治療方法提供了新的思路。

本研究存在一些限制。首先，雖然本研究使用了多個公共數(shù)據(jù)庫對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，但是還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究來驗(yàn)證這些標(biāo)志物的可靠性和預(yù)測能力。其次，目前的樣本規(guī)模仍然相對較小，因此可能無法充分考慮患者之間的異質(zhì)性和個體差異。綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)系統(tǒng)性研究了ACACA相關(guān)DCs和APOC1、APOC3在肝癌中的作用，為肝癌的預(yù)后和治療提供了一些新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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