中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在胰腺炎中的作用

邱秋 唐亮 劉凱軍 陳東風(fēng)

急性胰腺炎(AP)和慢性胰腺炎(CP)是消化科基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，目前認(rèn)為胰酶激活、白細(xì)胞招募、微循環(huán)灌注受損在AP的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，CP的發(fā)病機(jī)制涉及胰腺星形細(xì)胞激活、基因突變、免疫調(diào)節(jié)失衡等。中性粒細(xì)胞作為人體內(nèi)最豐富的免疫細(xì)胞，除了傳統(tǒng)的抗菌作用外，近年發(fā)現(xiàn)它還以另一種方式即產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)來(lái)調(diào)節(jié)炎癥、免疫和組織損傷。本文就NETs的產(chǎn)生、免疫作用和在胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用做一綜述。

一、NETs的產(chǎn)生

NETs是以染色質(zhì)為骨架的呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外復(fù)合體，其上布滿組蛋白和多種顆粒蛋白如髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、組織蛋白酶G、抗菌肽LL-37等。IL-8、脂多糖及蛋白激酶C的激活劑丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol myristate acetate, PMA)可激活中性粒細(xì)胞使其產(chǎn)生NETs。中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和釋放NETs的過(guò)程被命名為NETosis。NETs協(xié)助中性粒細(xì)胞捕獲細(xì)菌、真菌或病毒，使其更有效地清除病原體。不能產(chǎn)生NETs的小鼠更容易被感染，進(jìn)一步證明了NETs在抗感染中的重要作用。NETosis最初是指中性粒細(xì)胞在釋放NETs后裂解死亡即自殺式NETosis；后來(lái)發(fā)現(xiàn)病原體刺激中性粒細(xì)胞后可誘導(dǎo)另一種有活性的NETosis，即中性粒細(xì)胞釋放NETs后仍有完整的細(xì)胞膜，保持活性，繼續(xù)發(fā)揮噬菌功能[1]。PMA刺激中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)自殺式NETosis的過(guò)程需數(shù)小時(shí)，而細(xì)菌等病原體誘導(dǎo)活性NETosis僅需數(shù)分鐘，此過(guò)程受血小板Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和TLR4的調(diào)控?；钚缘腘ETosis比自殺式NETosis與感染的相關(guān)性更大，因?yàn)樵诟腥緺顟B(tài)下中性粒細(xì)胞釋放NETs后仍保持活性，繼續(xù)發(fā)揮趨化、噬菌等功能[2]。并非所有的中性粒細(xì)胞都可產(chǎn)生NETs，當(dāng)用IL-8、LPS或細(xì)菌刺激時(shí)，只有約20%的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs。中性粒細(xì)胞可能有不同的亞群，某些亞群具有促炎或抗炎功能，某些亞群具有修復(fù)功能，而炎癥條件下衰老的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs的概率較大[3]。

NETs的產(chǎn)生過(guò)程有3個(gè)重要酶：蛋白精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4, PAD4)、NE和MPO。鈣離子可激活PAD4[4]，PAD4催化組蛋白的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，減少組蛋白所帶強(qiáng)陽(yáng)性電荷，從而削弱組蛋白與DNA結(jié)合，促進(jìn)染色質(zhì)解聚，這是NETs在體內(nèi)形成的基礎(chǔ)；染色質(zhì)解聚后，核膜破裂，染色質(zhì)釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在顆粒蛋白的修飾下釋放到細(xì)胞外，形成NETs[5]。即使在細(xì)菌等病原體激活物的刺激下，PAD4基因敲除的小鼠仍不能形成NETs[6]。因此，PAD4引起的組蛋白去電荷是體內(nèi)NETs形成的先決條件。除了PAD4，NETs形成過(guò)程中需要NE將組蛋白分離出來(lái)，因此NE也是NETs形成必不可少的因素。NE屬于絲氨酸蛋白酶家族成員，由于帕皮永-勒菲弗綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome, PLS)患者的中性粒細(xì)胞缺乏絲氨酸蛋白酶，因此在PMA刺激下其仍不能產(chǎn)生NETs[7]，這進(jìn)一步支持NE在NETs形成中的作用。另外，MPO也是NETs形成的重要因素，MPO將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為次氯酸，次氯酸使組蛋白加氯，減少其正電荷，這種作用類(lèi)似于組蛋白的瓜氨酸化，MPO還協(xié)助NE促進(jìn)染色質(zhì)解聚。但人中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs依賴(lài)MPO，而MPO對(duì)于小鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs不是必需的[8]，這可能與小鼠和人中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)不同有關(guān)，小鼠中性粒細(xì)胞有一個(gè)環(huán)狀的圓形核，這可能會(huì)影響組蛋白對(duì)次氯酸鹽的敏感性。

二、NETs的免疫作用

NETs是一種物理屏障，能夠限制病原體的播散和炎癥遞質(zhì)擴(kuò)散，避免對(duì)正常組織的破壞。NETs是重要的殺菌武器，依靠誘捕和直接殺滅病原體發(fā)揮抗菌作用，其能捕獲的病原體包括革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門(mén)菌、結(jié)核桿菌及真菌如白色念珠菌等[9]。NETs能夠殺滅病原體與DNA、NE、抗菌肽等組分有關(guān)，DNA骨架上的磷酸二酯鍵使其具有高度殺菌功能，組蛋白瓜氨酸化后，DNA與組蛋白結(jié)合放松，而與細(xì)菌相互作用達(dá)到抗菌目的[10]。唾液酸化路易斯-X抗原刺激唾液中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的NETs，嚴(yán)重的牙周病是由于伴放線放線桿菌等病菌感染，這些病菌能被NETs中的抗菌肽LL-37殺滅，故唾液可以預(yù)防牙周病或許與NETs有關(guān)。白塞病或反復(fù)阿弗他潰瘍患者的唾液不能產(chǎn)生NETs，這提示NETs對(duì)于維持口腔黏膜完整性有一定作用[11]。

Bianchi等[12]報(bào)道，1例慢性肉芽腫病合并曲霉菌感染的患者通過(guò)基因治療來(lái)恢復(fù)產(chǎn)生NETs的能力，可以清除曲霉菌的孢子和菌絲，從而治療肺曲霉菌感染，這被認(rèn)為是NETs在免疫防御中具有重要作用的依據(jù)。近來(lái)，NETs在免疫防御中的作用受到研究者的質(zhì)疑，原因是PAD4基因敲除的小鼠不能產(chǎn)生NETs，但這些小鼠并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)于微生物感染免疫防御受損[13]；用盲腸結(jié)扎穿刺的方法建立腹膜炎模型，PAD4基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，盡管血循環(huán)中DNA和瓜氨酸化的組蛋白水平有顯著差異，但并無(wú)更高的發(fā)病率和死亡率[13]。因此目前的證據(jù)尚不能表明NETs在固有免疫防御中有著必不可少的作用，相反，NETs所含有的DNA、組蛋白和顆粒蛋白通常是自身抗體作用的靶點(diǎn)，與自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。如在抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)的血管炎中，針對(duì)MPO的自身抗體具有致病性；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，循環(huán)中DNA抗體復(fù)合物沉積在腎臟、皮膚和關(guān)節(jié)，亦可造成病變[14]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的小鼠抑制PAD4減少了NETs形成后，可防止腎臟免疫復(fù)合物沉積、蛋白尿及血管病變[15]。因此，推測(cè)NETs在自身免疫反應(yīng)中的作用比在固有免疫中更為重要。

三、NETs在AP中的作用

研究顯示NETs在AP的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用，它可通過(guò)多種途徑來(lái)促進(jìn)胰腺組織損傷。首先，AP患者的血漿游離DNA(cell free-deoxyribonucleic acid, cf-DNA)水平明顯升高[16]；在牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)的急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠模型，胰腺組織中有大量NETs和組蛋白沉積，且血漿中cf-DNA水平升高，清除中性粒細(xì)胞可顯著減少胰腺組織中NETs沉積和降低血漿cf-DNA水平。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ, DNase Ⅰ)可使NETs中的DNA骨架解聚，從而破壞NETs的結(jié)構(gòu)。SAP小鼠在給予DNase Ⅰ后胰腺組織中組蛋白表達(dá)水平下降、胰腺水腫程度明顯減輕、血淀粉酶水平亦有所下降[16]。由于NETs中的蛋白質(zhì)近70%為組蛋白，而組蛋白可損傷上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，甚至可致細(xì)胞死亡[17]，因此組蛋白可能是NETs導(dǎo)致胰腺組織損傷的原因之一。其次，ANP小鼠胰腺組織的MPO活性增高、血管外中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，給予DNase Ⅰ后MPO活性下降、中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，提示NETs可調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞招募，促進(jìn)胰腺組織損傷，該過(guò)程與NETs上調(diào)趨化因子CXCL2和巨噬細(xì)胞1抗原的表達(dá)有關(guān)。再者，用NETs與胰腺腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，NETs可促進(jìn)胰酶激活，且水平與雨蛙肽誘導(dǎo)的胰酶激活水平相當(dāng)，DNase I可抵消NETs誘導(dǎo)的胰酶激活[16]。NETs促進(jìn)胰酶激活可能有3方面原因：第一，NETs可顯著增加胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)活性，此主要依賴(lài)組蛋白提高STAT3磷酸化水平，而STAT3是腺泡細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子，故NETs可能通過(guò)STAT3誘導(dǎo)胰酶激活；第二，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是胰腺腺泡細(xì)胞胰酶激活的有效誘導(dǎo)劑[18]，抑制NETs生成可降低血漿MMP-9水平，故NETs可能是通過(guò)MMP-9來(lái)促進(jìn)胰酶激活；第三，NETs中的其他蛋白成分如酶和抗菌肽等也可能參與了腺泡細(xì)胞胰酶激活。因此，與血管炎、關(guān)節(jié)炎等非感染性疾病一樣，AP時(shí)NETs對(duì)機(jī)體的作用似乎是有害的，靶向作用于NETs可能是改善SAP炎癥的有效方法。

SAP時(shí)機(jī)體釋放大量的促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活內(nèi)、外源性凝血途徑，導(dǎo)致高凝狀態(tài)，使靜脈血栓或動(dòng)脈栓塞形成的風(fēng)險(xiǎn)增加[19]。NETs可促進(jìn)血栓形成，McDonald等[20]建立敗血癥小鼠模型證實(shí)NETs中網(wǎng)羅了大量聚集的血小板、激活的凝血酶和纖維蛋白凝塊，可檢測(cè)到組織因子表達(dá)；利用DNase I去除NETs，可使血管內(nèi)凝血酶活性顯著下降、血小板聚集減少、微血管通透性改善。該研究還證明，NETs誘導(dǎo)的血管內(nèi)凝血是微血管低灌注的基礎(chǔ)，抑制NETs可減輕血管內(nèi)凝血和器官損傷。NETs誘導(dǎo)血栓形成的原因是多方面的，首先，NETs為血栓形成提供支架[21]；其次，NETs的組分參與了凝血因子的激活，NETs結(jié)合并激活Ⅻ因子，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑；NETs中的NE能夠降解組織因子途徑抑制物、促進(jìn)Xa活化，NE和組織蛋白酶G通過(guò)蛋白酶激活受體激活血小板，組蛋白可上調(diào)組織因子、激活血小板、減少蛋白C活化，中和NETs內(nèi)的組蛋白H4可顯著減輕血管內(nèi)凝血和微血管功能障礙[9,21]。因此，NETs是連接炎癥和血栓之間的橋梁，SAP時(shí)機(jī)體處于重度炎癥狀態(tài)，推測(cè)NETs在SAP高凝狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮了重要作用。

四、NETs在CP中的作用

CP的危險(xiǎn)因素分類(lèi)可概括為T(mén)IGAR-O(toxic-metabolic, idiopathic, genetic autoimmune, recurrent severe, obstructive)，即毒性代謝產(chǎn)物、特發(fā)性、遺傳性、自身免疫性、復(fù)發(fā)性AP和SAP、梗阻性。其組織病理學(xué)特點(diǎn)是慢性炎癥、間質(zhì)纖維化、實(shí)質(zhì)重塑，病理改變可能呈局灶性分布，病變周?chē)耐夥置诮M織仍可保持正常。胰管堵塞是CP的原因之一，其可導(dǎo)致胰腺局部炎癥，堵塞時(shí)間長(zhǎng)短決定了胰腺炎的嚴(yán)重程度。AP時(shí)胰腺組織炎癥部位有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著組織纖維化，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減少，在胰腺導(dǎo)管內(nèi)和導(dǎo)管周?chē)＜?xì)胞聚集體是2型自身免疫性胰腺炎的標(biāo)志性改變。NETs對(duì)自身免疫性胰腺炎也至關(guān)重要，研究顯示IgG4相關(guān)的自身免疫性胰腺炎患者的血漿NETs水平較健康對(duì)照組高，患者的胰腺組織中有NETs沉積，且NETs激活漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞使其分泌大量TNF-α是引起自身免疫性胰腺炎的主要原因[22]。

McAllister等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞分泌的IL-17A在胰腺惡性腫瘤之前的炎癥階段有促炎和促癌作用。IL-17A本身的生物學(xué)作用較弱，但可增強(qiáng)TNF-α、IL-1β、IL-6的生物學(xué)作用。向小鼠尾靜脈注入帶有IL-17A的載體，小鼠并未出現(xiàn)血淀粉酶、脂肪酶升高等AP的特征，反而出現(xiàn)體重下降等慢性消耗性疾病的表現(xiàn)，注入載體后10 d胰腺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，之后逐漸減少，到28 d時(shí)出現(xiàn)明顯的胰腺纖維化和結(jié)構(gòu)重塑，胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平升高，而其他器官如脾臟等只有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，病理改變不明顯[24]。雨蛙素誘導(dǎo)胰腺炎模型的原理是其細(xì)胞毒性，因此雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺炎胰膽管內(nèi)未發(fā)現(xiàn)NETs聚集體。IL-17A誘導(dǎo)CP原理與雨蛙素不同，IL-17A可促進(jìn)粒細(xì)胞生成和遷移，中性粒細(xì)胞被趨化進(jìn)入胰膽管管腔內(nèi)，在胰液刺激下形成NETs聚集體。10例胰腺良性腫瘤和10例惡性腫瘤相關(guān)性胰腺炎患者的胰液標(biāo)本中分別有4例和6例可檢測(cè)到NETs聚集體，而3例胰管擴(kuò)張和胰腺假性囊腫患者的胰液標(biāo)本中均可檢測(cè)到NETs聚集體[24]。NETs聚集體降低胰腺導(dǎo)管所分泌的胰液的流動(dòng)性，進(jìn)而胰管堵塞，在堵塞部位，NETs中的絲氨酸蛋白酶使胰蛋白酶原過(guò)早激活，啟動(dòng)胰腺自身消化，腺泡破壞，從而促進(jìn)胰腺局灶性炎癥和實(shí)質(zhì)重塑，這個(gè)過(guò)程依賴(lài)PAD4，PAD4是NETs聚集體形成的關(guān)鍵，PAD4基因敲除可減緩CP疾病進(jìn)展[24]。具體來(lái)說(shuō)，是胰液中某些成分如碳酸氫根離子和碳酸鈣晶體刺激中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)NETs形成。由此推測(cè)，減少胰液中碳酸氫根離子和碳酸鈣晶體成分可減少NETs形成或許是治療CP的有效手段。

總之，NETs除了抗菌作用外，還在自身免疫性疾病中有重要作用。對(duì)于AP，NETs可誘導(dǎo)胰酶激活、加重胰腺組織損傷，促進(jìn)血栓形成，與SAP的高凝狀態(tài)有關(guān)。對(duì)于CP，NETs聚集體堵塞胰管，促進(jìn)胰腺局灶性炎癥和實(shí)質(zhì)重塑。因此，NETs對(duì)于AP和CP的疾病進(jìn)展均發(fā)揮重要的作用，如果能抑制NETs產(chǎn)生，或許能控制胰腺炎疾病進(jìn)展，有利于臨床治療。