PACS-2在阿爾茨海默病發(fā)展中作用機制研究

王艷云 葉群英 錢軍 劉志鵬 羅紅波 李蕓

[摘要]?目的?探究磷酸呋喃酸性簇分選蛋白-2（phosphofurin?acidic?cluster?sorting?protein-2，PACS-2）在N2a/APP695swe細胞線粒體功能及細胞凋亡中的參與作用，進一步探討PACS-2在阿爾茨海默?。ˋlzheimers?disease，AD）發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。方法?CCK8法分析不同濃度的二苯乙烯苷（tetrahydroxy?stilbene?glycoside，TSG）處理N2a/APP695swe細胞48h后的細胞存活率，選擇合適濃度的TSG用于后續(xù)實驗。體外常規(guī)培養(yǎng)N2a/WT細胞和N2a/APP695swe細胞，實驗細胞分為3個組：空白對照組（WT組）：N2a/WT細胞；模型組（APP組）：N2a/APP695swe細胞；治療組（TSG組）：N2a/APP695swe細胞，合適濃度的TSG干預。TUNEL法熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，JC-1法流式檢測細胞線粒體膜電位，Western?blot（WB）檢測PACS-2的蛋白表達情況，RT-qPCR檢測PACS-2的mRNA表達情況。結(jié)果?CCK8法分析不同濃度的TSG作用細胞48h后的細胞存活率：100μmol/L的TSG保護作用最顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；TUNEL法熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，與WT組相比，APP組的凋亡率升高，與APP組相比，TSG組的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；JC-1法檢測細胞線粒體膜電位；與WT組相比，APP組的膜電位降低，與APP組相比，TSG組膜電位升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；WB檢測PACS-2的蛋白表達：與WT組相比，APP組的PACS-2表達升高，與APP組相比，TSG組的PACS-2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；RT-qPCR檢測PACS-2的mRNA表達：與WT組相比，APP組的PACS-2表達升高，與APP組相比，TSG組的PACS-2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論?PACS-2在AD的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，其上調(diào)可能促進AD的發(fā)生，腦保護藥物TSG可能通過下調(diào)PACS-2抑制AD模型細胞凋亡并改善線粒體功能發(fā)揮細胞保護作用。

[關鍵詞]?PACS-2；阿爾茨海默病；N2a/APP695swe細胞；線粒體功能障礙；細胞凋亡

[中圖分類號]?R741????[文獻標識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.05.003

Effect?of?PACS-2?on?the?development?of?Alzheimers?disease

WANG?Yanyun1，?YE?Qunying1，?QIAN?Jun1，?LIU?Zhipeng1，?LUO?Hongbo1，?LI?Yun2

1.Department?of?Neurology，?the?Fifth?Affiliated?（Zhuhai）?Hospital?of?Zunyi?Medical?University，?Zhuhai?519000，?Guangdong，?China;?2.Department?of?Nephrology?and?Rheumatology，?the?Fifth?Affiliated?（Zhuhai）?Hospital?of?Zunyi?Medical?University，?Zhuhai?519000，?Guangdong，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?involvement?of?phosphofurin?acidic?cluster?sorting?protein-2?（PACS-2）?in?mitochondrial?function?and?apoptosis?in?N2a/APP695swe?cells?and?further?explore?the?role?and?significance?of?PACS-2?in?the?development?of?Alzheimers?disease?（AD）.?Methods?The?CCK8?method?was?used?to?analyze?the?cell?survival?rate?of?N2a/APP695swe?cells?treated?with?different?concentrations?of?tetrahydroxy?stilbene?glycoside?（TSG）?for?48h?and?to?select?the?appropriate?concentration?of?TSG?for?subsequent?experiments.?N2a/WT?cells?and?N2a/APP695swe?cells?were?routinely?cultured?in?vitro，?and?the?experimental?cells?were?divided?into?3?groups：?blank?control?group?（WT?group）：?N2a/WT?cells;?model?group?（APP?group）：?N2a/APP695swe?cells;?treatment?group?（TSG?group）：?N2a/APP695swe?cells?with?appropriate?concentrations?of?TSG?intervention.?TUNEL?method?to?observe?apoptosis?by?fluorescence?microscopy;?JC-1?method?for?flow?detection?of?cellular?mitochondrial?membrane?potential;?WB?to?detect?protein?expression?of?PACS-2;?RT-qPCR?to?detect?PACS-2?mRNA?expression.?Results?CCK8?method?was?used?to?analyze?the?cell?survival?rate?of?different?concentrations?of?TSG?acting?on?cells?after?48h：?the?protective?effect?of?100?μmol/L?TSG?was?the?most?significant?and?the?difference?was?statistically?significant?（P<0.01）.?The?TUNEL?method?of?fluorescence?microscopy?observed?the?apoptosis：?compared?with?the?WT?group，?the?apoptosis?rate?of?APP?group?was?increased，?compared?with?the?APP?group，?the?apoptosis?rate?of?TSG?group?was?decreased，?and?the?differences?were?statistically?significant?（P<0.05）.?The?JC-1?method?was?used?to?detect?the?mitochondrial?membrane?potential?of?cells：?compared?with?the?WT?group，?the?membrane?potential?of?APP?group?was?decreased，?compared?with?the?APP?group，?the?membrane?potential?of?TSG?group?was?increased，?and?the?differences?were?statistically?significant?（P<0.05）;?Western?blot?（WB）?detection?of?PACS-2?protein?expression：?compared?with?the?WT?group，?PACS-2?expression?was?significantly?higher?in?the?APP?group，?and?compared?with?the?APP?group，?PACS-2?expression?was?significantly?lower?in?the?TSG?group，?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）;?The?RT-qPCR?detected?the?mRNA?expression?of?PACS-2：?the?expression?of?PACS-2?was?elevated?in?the?APP?group?compared?with?the?WT?group?and?decreased?in?the?TSG?group?compared?with?the?APP?group，?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Conclusion?PACS-2?has?an?important?role?in?the?development?of?AD，?and?its?upregulation?may?promote?the?development?of?AD.?The?cerebroprotective?drug?TSG?may?exert?cytoprotective?effects?by?downregulating?PACS-2?to?inhibit?apoptosis?and?improve?mitochondrial?function?in?AD?model?cells.

[Key?words]?Phosphofurin?acidic?cluster?sorting?protein-2;?Alzheimers?disease;?N2a/APP695swe?cell;?Mitochondrial?dysfunction;?Apoptosis

阿爾茨海默?。ˋlzheimers?disease，AD）是一種以認知功能障礙和記憶力減退為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性變性疾病，主要病理改變?yōu)棣碌矸蹣拥鞍祝╝myloid-β?peptides，Aβ）沉積、Tau蛋白（Tau?protein，Tau）高度磷酸化，以及它們所形成的老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)[1]。AD的發(fā)病人數(shù)逐年上升，在未來30年中國AD的患病人數(shù)將大幅度上升[2]。然而目前并無有效的預防或治療措施，因此尋找AD的有效治療藥物刻不容緩。研究報道，在AD的典型病理改變發(fā)生之前AD患者存在一些與線粒體相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（mitochondria-associated?endoplasmic?reticulum?membrane，MAM）結(jié)構(gòu)和功能異常相關的早期病理變化，如線粒體動力學改變、細胞凋亡等[3]。MAM是線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間距離約為10～30nm的物理連接，調(diào)節(jié)MAM上存在的蛋白質(zhì)及其相關蛋白復合物可參與細胞生命活動過程及MAM的形成，如磷酸呋喃酸性簇分選蛋白-2（phosphofurin?acidic?cluster?sorting?protein-2，PACS-2）、線粒體融合蛋白2（mitofusion2，Mfn2）、三磷酸肌醇受體（inositol?1，4，5-triphosphate?receptor，IP3R）等[4-5]。MAM如何參與并影響AD的發(fā)生、發(fā)展的機制目前研究尚未完全闡明。近年來MAM及其上的蛋白及蛋白復合物成為神經(jīng)退行性變性疾病研究中的熱點，但PACS-2在阿爾茨海默病中的報道目前相對少見。PACS-2是MAM上的一種多功能分選蛋白，在細胞穩(wěn)態(tài)和細胞凋亡中發(fā)揮一定作用[6]。研究報道通過抑制PACS-2可以阻止線粒體裂變及細胞凋亡[7]。AD患者同樣表現(xiàn)出線粒體功能障礙及細胞凋亡，是否PACS-2在AD的發(fā)生、發(fā)展中有一定的意義呢？二苯乙烯苷（tetrahydroxy?stilbene?glycoside，TSG）是中藥何首烏特有的關鍵活性成分，化學名為2，3，5，4-四羥基二苯乙烯2-O-β-D-葡萄糖苷，相對分子質(zhì)量為406.39[8]。相關報道及課題前期研究表明，TSG具有顯著且明確的神經(jīng)保護作用[9–13]。因此，本研究使用TSG干預細胞作為治療對照組。在AD的多種發(fā)病機制假說中被大量的研究者普遍認可的假說是淀粉樣蛋白級聯(lián)反應，N2a/APP695swe細胞具有很好的Aβ堆積和淀粉樣斑塊沉積特點[14]。因此，本研究使用N2a/APP695swe細胞作為模型細胞，通過分析?N2a/APP695swe細胞與N2a細胞的凋亡情況、膜電位變化、PACS-2的蛋白和基因表達情況，初步探究PACS-2在阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展中的作用及意義，為AD的防治藥物研究提供新理論及新靶點。

1??材料與方法

1.1??實驗細胞

小鼠腦神經(jīng)瘤細胞（neuro-2a，N2a）野生型（wildtype，N2a/WT）購自武漢益普生物科技有限公司，穩(wěn)定表達Swedish家族突變基因人APP695的N2a細胞（N2a/APP695swe）由河南文特爾生物技術有限公司構(gòu)建（倫理審查批件編號[2023]?2023ZH0050號）。

1.2??主要藥品、試劑及儀器

二苯乙烯苷（純度98%）購自南京道斯夫生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（一步法）、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自廣州碧云天生物科技公司；Takara?RNAiso?Plus（Total?RNA?提取試劑）購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；FlexCycler?PCR儀購自德國耶拿公司。

1.3??細胞的培養(yǎng)與分組

完全培養(yǎng)基比例為40ml?DMEM基礎培養(yǎng)基：4ml胎牛血清：400μl青鏈霉素，細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)。將實驗分為3組，WT組：N2a/WT細胞；APP組：N2a/APP695swe細胞；TSG組：N2a/APP695swe細胞，CCK8篩選出最適濃度的TSG進行干預。

1.4??檢測方法

按照CCK8試劑盒進行實驗，用酶標儀檢測樣本在450nm處的A值，計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組A值?空白組A值）/（對照組A值?空白組A值）?100（%）。按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒進行實驗，熒光顯微鏡下觀察并計算細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=Cy3與DAPI重合細胞數(shù)/DAPI細胞數(shù)（%）。按照線粒體膜電位檢測試劑盒檢測膜電位，線粒體膜電位較高時產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較低時產(chǎn)生綠色熒光，檢測完成后使用Flow?Jo軟件分析，膜電位變化水平=紅/綠。采用Western?blot（WB）法檢測蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參，按照說明書裂解細胞，提蛋白，蛋白定量、變性，制膠，跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗和二抗，取適量ECL發(fā)光液滴于膜上（注意避光），曝光成像并采集，用Image?J軟件對條帶進行灰度值分析測定。采用實時定量熒光RT-qPCR檢測mRNA表達，反應條件：95℃?5min，95℃?15s，60℃?30s，總共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算PACS-2的mRNA相對表達量。設計引物序列見表1。

1.5??統(tǒng)計學方法

采用SPSS?26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。實驗獨立重復3次，計量資料先進行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析（one-way?ANOVA）和LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2??結(jié)果

2.1??二苯乙烯苷的最適濃度

通過CCK8法檢測N2a/APP695swe細胞的存活率，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的TSG（0、5、10、20、50、100、200、400μmol/L）處理細胞48h后，細胞的相對存活率均在100%以上，其中100μmol/L的TSG對細胞存活率的影響最顯著（P<0.01，圖1），因此筆者選擇100μmol?/L的TSG進行后續(xù)實驗。

2.2??細胞凋亡程度比較

與WT組相比，APP組的凋亡率升高，與APP組相比，TSG組的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2～3。

2.3??線粒體膜電位的比較

與WT組相比，APP組膜電位降低，與APP組相比，TSG組膜電位升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。

2.4??PACS-2蛋白表達比較

與WT組相比，APP組的PACS-2表達升高；與APP組相比，TSG組的PACS-2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5。

2.5??PACS-2的mRNA表達比較

與WT組相比，APP組的PACS-2表達增加，與APP組相比，TSG組的PACS-2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖6。

3??討論

AD是國際上重大的醫(yī)學和社會問題，威脅老年人的生命和健康、降低老年人的生命質(zhì)量、給每個家庭以及社會帶來沉重負擔，然而當前并無有效的預防或治療措施。大量研究證明通過調(diào)節(jié)線粒體功能障礙誘導的細胞凋亡是中藥治療神經(jīng)退行性疾病的潛在治療策略之一[15]。線粒體是一個不斷的移動、融合和分裂的動態(tài)細胞器，通過融合和分裂改變其形狀以適應其代謝環(huán)境維持線粒體功能，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)環(huán)境平衡并維持細胞活力[16]。研究報道，在MAM上，淀粉樣前體蛋白被γ分泌酶切割形成Aβ，Aβ與多種蛋白質(zhì)相互作用破壞線粒體膜電位使其下降，引起線粒體功能障礙并釋放大量細胞色素C，誘導細胞凋亡[17]。PACS-2是MAM形成的關鍵調(diào)節(jié)因子[18]。PACS-2基因敲除的糖尿病小鼠出現(xiàn)MAM破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，線粒體自噬與分裂，線粒體功能不良及腎凋亡，其過表達可通過穩(wěn)定MAM完整性減輕糖尿病腎小管損傷[19]。PACS-2的敲低破壞了?MAM接觸并損害了線粒體的形成和線粒體自噬，增強了血管平滑肌細胞的凋亡[20]。PACS-2的高表達有助于富集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體相互作用[21]。PACS-2的基因突變型PACS-2?e209K?改變了PACS-2蛋白的抑制作用，增加細胞死亡增加[22]。PACS-2通過介導抗凋亡Bcl-xL促進細胞存活[23]。另有研究報道，PACS-2可作為一個促凋亡蛋白，抑制PACS-2后能夠阻止Caspases觸發(fā)的細胞凋亡[7]。以上提示不同研究者之間存在差異，可能是由于不同實驗條件及PACS-2在不同疾病中的作用及意義不同所致。

本研究結(jié)果提示，與N2a細胞相比，N2a/APP695swe細胞凋亡程度增加、線粒體膜電位降低、PACS-2的蛋白和基因表達增加，而經(jīng)過腦保護藥物TSG處理后，細胞的凋亡程度降低、線粒體膜電位升高、PACS-2的蛋白和基因表達降低，提示PACS-2上調(diào)可能引起線粒體功能障礙、加重細胞凋亡，進一步促進AD的發(fā)生、發(fā)展。但這僅僅是初步的探索結(jié)果，后期課題組將增加PACS-2的過表達及抑制組，進一步探究PACS-2在AD中的作用通路，為防治AD的提供有效作用靶點，為后期開發(fā)針對分子連接結(jié)構(gòu)的靶向性療法提供新的研究思路和治療策略。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–04–19）

（修回日期：2023–11–24）