黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響及機(jī)制研究

蘆凌羽，王林洪

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞[1]，其被激活后大量表達(dá)白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6），而IL-6 介導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)[2]，在許多炎癥反應(yīng)中表達(dá)升高[3]，并將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）通路激活，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加強(qiáng)，可促進(jìn)視網(wǎng)膜變性及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。IL-6/STAT3 是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，而該通路可進(jìn)一步促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，形成了一個(gè)正反饋循環(huán)，加重了視神經(jīng)變性及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡[4]。近年來(lái)，中藥在慢性疾病的治療中被廣泛應(yīng)用[5]，黃芩苷是從中藥黃芩中提煉出來(lái)的黃酮類(lèi)化合物，有抗炎、抗氧化作用[6]。有研究[7]表明，天然黃酮類(lèi)化合物有改善糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）的作用，并且對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠神經(jīng)病變也有預(yù)防作用。本研究旨在討論黃芩苷對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，及作用機(jī)制是否與IL-6/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只雄性SD 大鼠，6 周齡，體重200～250 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)[SCXK（京）2021-0001]。所有大鼠在恒溫恒濕的環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，室溫20～22 ℃，晝夜循環(huán)照明，定期檢查大鼠眼部健康狀況。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)所用條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥品、試劑與儀器

鏈脲佐菌素（上海柯意哲科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，SS9500），黃芩苷（西安圣青生物科技有限公司，S31635），蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色劑（南京建成生物工程研究所有限公司，20210102），冰醋酸（天津市化學(xué)試劑公司，20201122），STAT3 引物、IL-6 引物（上海弗元生物科技有限公司，GS0830、KT1340），鼠抗簇分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）抗體、鼠抗STAT3 抗體（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，SC20020、SC8019），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，BL698A）。多功能智能顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司，BX-64、CKX53），石蠟切片機(jī)、烤片機(jī)（科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-202A、KDTHII），PCR 儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，ABI7500）。

1.3 糖尿病大鼠模型建立

選取40 只大鼠，單次腹腔注射STZ 建立糖尿病模型。將STZ 溶于檸檬酸鈉溶液中，以60 mg/kg 的劑量腹腔注射，其余20只大鼠腹腔注射等劑量檸檬酸鈉溶液。連續(xù)3 d 測(cè)定大鼠空腹血糖，將每次血糖均≥16.7 mmol/L 的大鼠判斷為糖尿病模型建立成功[8]。若造模過(guò)程中出現(xiàn)死亡或者血糖不達(dá)標(biāo)的大鼠不計(jì)算在內(nèi)，繼續(xù)選取同批大鼠進(jìn)行造模，確保最后造模成功的大鼠總數(shù)為40只。

1.4 分組與給藥

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組（model group，MG）和黃芩苷組（baicalin group，BG），另將對(duì)照的20 只大鼠設(shè)為對(duì)照組（control group，CG），每組20 只。BG 組大鼠給予黃芩苷水溶液（50 mg/kg）每日清晨灌胃，CG 組、MG 組大鼠給予同體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥12 周。在整個(gè)研究過(guò)程中，密切觀(guān)察大鼠的生理狀態(tài)，剔除生理狀態(tài)差、體重差異大以及在實(shí)驗(yàn)中死亡的大鼠后，在12 周時(shí)發(fā)現(xiàn)BG組剩余17 只、MG 組剩余14 只、CG 組剩余19 只，于每組中再次采用隨機(jī)抽樣的方法各選取12 只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 標(biāo)本取材

所有大鼠在12 周時(shí)先禁食12 h，然后測(cè)量血糖并記錄。麻醉后立即摘取大鼠右眼眼球，浸入固定液中固定30 min 后取出眼球，在眼球左右對(duì)稱(chēng)開(kāi)口，再次放入固定液中固定24 h，進(jìn)行石蠟切片，用于組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.6 HE染色

切片常規(guī)脫蠟后水化，分別使用蘇木素和伊紅進(jìn)行染色，然后進(jìn)行梯度濃度乙醇和二甲苯浸泡，最后向切片滴入中性樹(shù)膠封片，靜置于通風(fēng)處24 h。自然風(fēng)干后放入切片盒中，使用光學(xué)顯微鏡檢查視網(wǎng)膜形態(tài)，選取合適視野進(jìn)行拍攝。

1.7 免疫組織化學(xué)法測(cè)量CD68蛋白表達(dá)

切片常規(guī)脫蠟后水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉10 min。重復(fù)洗滌3 次后，滴加鼠抗CD68 抗體（稀釋比例1∶200），放入4 ℃冰箱24 h。次日洗滌3 次后，加入試劑B，放置入濕盒中20 min，再次洗滌3次。然后加入試劑C，室溫下反應(yīng)10 min，洗滌3 次。顯色后放入蘇木素中30 s 進(jìn)行復(fù)染，洗滌后再加至梯度濃度乙醇和二甲苯中浸泡。最后滴加中性樹(shù)膠風(fēng)干，在顯微鏡下拍照。以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色的細(xì)胞為陽(yáng)性表達(dá)，使用Image-Pro Plus 軟件測(cè)量光密度值。

1.8 免疫熒光法測(cè)量STAT3蛋白表達(dá)

切片常規(guī)脫蠟后水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉10 min。重復(fù)洗滌3 次后，滴加鼠抗STAT3 抗體（稀釋比例1∶200），放入4 ℃冰箱24 h。次日洗滌3 次后，滴加羊抗鼠二抗（稀釋比例1∶200），室溫下避光孵育60 min，再次洗滌后，進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

1.9 RT-qPCR法測(cè)定IL-6、STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

提取視網(wǎng)膜組織中RNA，RNA 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照說(shuō)明書(shū)配置及設(shè)計(jì)引物（表1），將試劑在管內(nèi)混勻，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)副孔，放入PCR 儀中，進(jìn)行擴(kuò)增。首先94 ℃反應(yīng)3 min，然后94 ℃反應(yīng)20 s→60 ℃反應(yīng)20 s→72 ℃反應(yīng)30 s，循環(huán)40次，最后72 ℃反應(yīng)5 min。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參照蛋白，以相對(duì)定量法2-△△Ct計(jì)算IL-6、STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物信息

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的影響

與CG 組相比，MG 組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retina ganglion cell，RGC）丟失明顯增多，而經(jīng)黃芩苷治療后的BG 組大鼠RGC數(shù)量增加；MG組大鼠視網(wǎng)膜厚度較CG 組薄，而B(niǎo)G 組大鼠視網(wǎng)膜厚度較MG組厚（圖1）。

圖1 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的影響（HE染色，×200）

2.2 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響

CG 組小膠質(zhì)細(xì)胞局限在內(nèi)核層；MG 組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，且分布在視網(wǎng)膜的每一層中；BG 組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較MG 組少，且小膠質(zhì)細(xì)胞遷移受限（圖2）。3組間大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)比較（表2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.000，P=0.000）。MG 組CD68 表達(dá)高于CG 組（t=7.348，P=0.000），BG 組CD68 表達(dá)低于MG 組（t=2.449，P=0.019），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響（免疫組織化學(xué)染色，×200）

表2 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜CD68和STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=12）

表2 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜CD68和STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=12）

注：* 與CG 組比較，P＜0.05；# 與MG 組比較，P＜0.05；CG 對(duì)照組；MG 模型組；BG 黃芩苷組；CD68 簇分化抗原68；STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；IL-6 白細(xì)胞介素-6。

IL-6 mRNA 1.00±0.52 3.78±0.18*2.43±0.17#209.75 0.000組別CG組MG組BG組F值P值CD68 0.09±0.01 0.12±0.01*0.11±0.01#28.000 0.000 STAT3 mRNA 1.00±0.49 2.19±0.10*1.18±0.09#57.365 0.000

2.3 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜STAT3、IL-6 表達(dá)的影響

CG 組視網(wǎng)膜STAT3 表達(dá)主要分布在內(nèi)叢狀層，而MG 組視網(wǎng)膜各層均有大量STAT3陽(yáng)性表達(dá)，BG 組視網(wǎng)膜各層中STAT3 表達(dá)明顯弱于MG 組（圖3）。3 組間大鼠視網(wǎng)膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)比較（表2），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FSTAT3=57.365、FIL-6=209.75，均P=0.000）。MG 組視網(wǎng)膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA 表達(dá)高于CG 組（tSTAT3=9.935、tIL-6=17.501，均P=0.000），BG 組視網(wǎng)膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)低于MG組（tSTAT3=8.432、tIL-6=9.944，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 黃芩苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜STAT3表達(dá)的影響（免疫熒光染色，×200）

3 討論

在健康的視網(wǎng)膜中，小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放神經(jīng)保護(hù)因子和抗炎因子參與視網(wǎng)膜防御免疫系統(tǒng)。然而，如果持續(xù)面對(duì)炎癥刺激，長(zhǎng)期激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放過(guò)量的細(xì)胞因子而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥[9]，致使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。因此，針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的藥物治療以減輕慢性神經(jīng)炎癥，可能是保護(hù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的一種有效的方法。

黃芩苷是一種多靶點(diǎn)藥物，具有抗氧化和抗炎等多種保護(hù)作用。IGNACIO S 等[10]發(fā)現(xiàn)，使用黃芩苷干預(yù)肌萎縮側(cè)索硬化癥模型小鼠，使CD68 等小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào)。還有研究[11]表明，黃芩苷可能是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的藥物。因此，為了評(píng)估黃芩苷是否可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，本研究對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD68進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以定量定位觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)CG組大鼠視網(wǎng)膜上只有在視網(wǎng)膜內(nèi)核層中可以檢測(cè)到小膠質(zhì)細(xì)胞，而MG 組大鼠除了內(nèi)核層中小膠質(zhì)細(xì)胞增多外，其余各層中也出現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞。值得注意的是，黃芩苷治療后的BG 組大鼠視網(wǎng)膜各層中的小膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少，幾乎阻止了DR 導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，表明經(jīng)黃芩苷干預(yù)后，在一定程度上可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

IL-6 是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)的炎癥因子，而IL-6 與其受體復(fù)合物的結(jié)合可導(dǎo)致STAT3 的激活，并激活細(xì)胞內(nèi)外2 條促凋亡信號(hào)通路。研究[12]表明，受體結(jié)合后通過(guò)直接的凋亡作用或者采用間接干擾生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulinlike growth factors-1，IGF-1）和胰島素受體的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。而這些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的最可能來(lái)源是視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，引起促炎細(xì)胞因子的分泌增加，進(jìn)一步使視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)加劇，導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡[13]。在本實(shí)驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芩苷治療后的BG 組大鼠視網(wǎng)膜中STAT3 mRNA 及IL-6 mRNA 的表達(dá)量較MG 組大鼠下降，表明黃芩苷抑制了STAT3和IL-6的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制DR 大鼠模型視網(wǎng)膜的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，降低了各項(xiàng)炎癥指標(biāo)，該作用機(jī)制可能與抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究可為DR藥物研發(fā)提供新的方向。