基于HPLC 指紋圖譜及化學(xué)模式識別對比研究曲花紫堇及同屬藥材

李惠敏，李鳳超，高必興，郭佳晨，張 藝，蔣桂華, *，尹顯梅, *

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137

2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137

3.四川省藥品檢驗研究院/國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，四川 成都 611731

罌粟科紫堇屬藏藥始載于《月王藥診》，后續(xù)《宇妥本草》《晶珠本草》等藏醫(yī)藥經(jīng)典著作對其均有記載，多以全草入藥，性甘味寒，在藏醫(yī)中多用于清熱解毒、止血鎮(zhèn)痛、活血散瘀、祛風利氣，主治熱性病、肝熱、脈熱、血熱、肝炎、流感、疫癘、高血壓、癱瘓、跌打損傷、癰癤等[1]，在瘟病時疫中使用也較多，是藏醫(yī)臨床常用特色藥材，在南北各地均有分布，但以西南地區(qū)最集中，大部分藥用植物主要分布在青海、四川、西藏、甘肅及云南等西南高山，生長在海拔2 500～5 000 m 的灌叢、高山草地、流石灘等環(huán)境。紫堇屬植物含有豐富的化學(xué)成分，包含生物堿[2-4]、黃酮[5]、揮發(fā)油[6]，甾體[7]、苯丙酰胺類[8]、萜類[9]等活性成分，具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、保肝、殺蟲、抗瘧、抗腫瘤等作用，對心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌等具有藥理作用[10]。

因資源分布、用藥習慣差異等因素，紫堇屬藏藥的多基原、地域性現(xiàn)象十分突出，這類藏藥基原復(fù)雜，在歷代藏本草和標準中收載情況不盡相同，各地實際使用藥材基原大不相同，其來源涉及紫堇屬多種植物[10]。如藏藥“絲哇”在流通使用過程中，常出現(xiàn)地區(qū)習用品、替代品或混淆品，均作為清熱止痛藥入方劑或者單獨使用，性狀相似，難以明辨真?zhèn)?。如收載于《四川省藏藥材標準》（2020 版）的“玉珠絲哇”，是紫堇屬植物曲花紫堇Corydalis curvifloraMaxim.的干燥全草，功效為清熱利膽，止血鎮(zhèn)痛，止渴，用于“赤彩”病、膽囊炎、肝炎、瘟病、隱熱、“陳舊熱”、燒傷等[11]。同屬植物暗綠紫堇C.melanochloraMaxim.的干燥全草作為“德哇”也收載于該標準中，二者是傳統(tǒng)藏醫(yī)藥治療熱癥的藥材來源之一。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市售及藏醫(yī)臨床使用的“絲哇”藥材還來源于紫堇屬多種植物，如斑花黃堇C.conspersaMaxim.、粗糙黃堇C.scaberulaMaxim.、賽北紫堇C.impatiens(Pall.)Fisch.、灰綠黃堇C.aduncaMaxim.、條裂黃堇C.linarioidesMaxim.等，不同基原的紫堇屬藥材功效主治和用法用量有一定差異，眾多基原植物的“絲哇”藥材同等入藥，不利于市場監(jiān)管，也對質(zhì)量可控性及臨床使用規(guī)范性造成一定困擾。因此對紫堇屬混淆藥材進行鑒別研究，可為該屬藥材質(zhì)量控制提供參考。

中藏藥的多組分復(fù)雜體系以及化學(xué)成分的多樣性和復(fù)雜性是質(zhì)量評價的重點與難點。指紋圖譜可以整體表征被測樣品主要化學(xué)成分的特征，能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的信息及不同樣品間的相互關(guān)系，進而對藥品質(zhì)量進行整體描述和評價[12]，是目前公認的最適合中藥及天然藥物物質(zhì)群質(zhì)量控制的手段之一[13]?；瘜W(xué)模式識別方法能更全面和系統(tǒng)地對藥材進行評價，主要包括主成分分析、聚類分析、判別分析等[14]。指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計分析可以對復(fù)雜的化學(xué)數(shù)據(jù)信息進行整合，更加形象地反映不同樣品間的差異。因此，本研究主要針對化學(xué)成分，首次建立曲花紫堇藥材指紋圖譜，再通過建立的指紋圖譜方法與同屬14 種藥材進行對比鑒別；并對與其形態(tài)上極易混淆的暗綠紫堇進行化學(xué)模式識別研究，為優(yōu)選曲花紫堇質(zhì)量控制指標、完善紫堇屬藥材質(zhì)量評價體系提供參考，為紫堇屬藥材鑒別提供新方法，為該屬藥材資源的合理開發(fā)、市場的規(guī)范發(fā)展及臨床使用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀；BT125D 型十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；BP121S 型萬分之一天平（德國Sartorius 公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國Merck 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZBRTD-211 型電子恒溫水浴鍋（常州智博儀器有限公司）。

1.2 試藥

新綠原酸（批號 MUST-21030108）、綠原酸（批號 MUST-21030304）、原阿片堿（批號 MUST-19110711）、紫堇靈（批號MUST-19052702）、乙酰紫堇靈（批號MUST-20052703）、蘆?。ㄅ朚UST-21011510）、紫云英苷（批號MUST-21022410）、煙花苷（批號MUST-21040704）、槲皮素（批號MUST-20101104）、山柰酚（批號MUST-20082818）均購自成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98.0%；甲醇為色譜純；水為超純水；其他均為分析純。

60 批藥材樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定，分別為曲花紫堇C.curvifloraMaxim.ex Hemsl.、暗綠紫堇C.melanochloraMaxim.、斑花黃堇C.conspersaMaxim.、鉤距黃堇C.hamataFranch.、粗糙黃堇C.scaberulaMaxim.、密穗黃堇C.densispicaC.Y.Wu、條裂黃堇C.linarioidesMaxim.、紫堇C.edulisMaxim.、疊裂黃堇C.dasypteraMaxim.、白穗紫堇C.trachycarpavar.LeucostachyaC.Y.Wu et H.Chuang.、糙果紫堇C.trachycarpaMaxim.、灰綠黃堇C.aduncaMaxim.、草黃堇C.stramineaMaxim.ex Hemsl.、賽北紫堇C.impatiens(Pall.) Fisch.及小花黃堇C.racemosa(Thunb.) Pers.的干燥全草。樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 取新綠原酸、綠原酸、原阿片堿、紫堇靈、乙酰紫堇靈、蘆丁、紫云英苷、煙花苷、槲皮素及山柰酚對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.032、0.026、0.044、0.129、0.179、0.070、0.030、0.036、0.051、0.047 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取曲花紫堇（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～16%A；5～25 min，16%～20% A，25～32 min，20%～25% A；32～45 min，25% A；45～60 min，25%～35% A；60～70 min，35%～40% A；70～80 min，40%～60% A；80～85 min，60%～90% A；體積流量1.0 mL/min；檢測波長298 nm；柱溫30 ℃。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.1.3”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄指紋圖譜，以4 號峰（綠原酸）為參照峰，計算共有色譜峰的相對保留時間及相對峰面積度的RSD 小于1.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取同一批曲花紫堇粉末（Q1）6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進行測定，記錄指紋圖譜，以4 號峰（綠原酸）的保留時間和色譜峰面積為參照，計算各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 值均小于2.0%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取精密度試驗項下同一供試品溶液Q1，按照“2.1.3”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 測定，記錄指紋圖譜，以4 號峰（綠原酸）的保留時間和色譜峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有的相對保留時間及相對峰面積的RSD 值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 曲花紫堇指紋圖譜的建立 取10 批曲花紫堇粉末，分別精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別進樣測定，記錄85 min 的HPLC 色譜圖，將檢測波長為289 nm 處的色譜圖轉(zhuǎn)換成AIA 格式，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723 版本，以下簡稱“指紋圖譜軟件”），將Q1 號樣品的圖譜設(shè)為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)為0.5 min，進行多點校正和色譜峰全譜峰匹配，最終確定了18 個共有峰，得到指紋圖譜疊加圖，并生成對照指紋圖譜，見圖1。

圖1 曲花紫堇樣品和對照HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of C.curviflora

2.1.8 特征峰的標定 根據(jù)10 批曲花紫堇的指紋圖譜檢測結(jié)果，共標定18 個特征峰。結(jié)合前期高分辨質(zhì)譜對曲花紫堇中化學(xué)成分的初步分析結(jié)果，再與對照品色譜峰的保留時間、紫外吸收光譜信息比對，共指認10 個峰，2 號峰為新綠原酸，4 號峰為綠原酸，9 號峰為原阿片堿，11 號峰為紫堇靈，12號峰為乙酰紫堇靈，13 號峰為蘆丁，14 號峰為紫云英苷，15 峰為煙花苷，17 號峰為槲皮素，18 號峰為山柰酚，對照指紋圖譜及混合對照品溶液的HPLC 圖見圖2。

圖2 曲花紫堇對照指紋圖譜 (A) 和混合對照品HPLC圖 (B)Fig.2 HPLC reference fingerprint of C.curviflora (A) and HPLC chromatogram of mixed reference substances (B)

圖3 曲花紫堇對照指紋圖譜和14 種紫堇的色譜圖比較Fig.3 Comparison of similarity between control fingerprint of C.curviflora and fourteen species

2.2 相似度分析

2.2.1 曲花紫堇相似度分析 10 批曲花紫堇藥材與對照指紋圖譜進行相似度比較分析，結(jié)果見表2，不同批次曲花紫堇藥材與對照指紋圖譜比較相似度均＞0.850，相似度良好，表明不同批次藥材的化學(xué)成分差異性較小，質(zhì)量相對穩(wěn)定。

表2 曲花紫堇指紋圖譜相似度Table 2 Comparison of reference fingerprint of C.curviflora

2.2.2 曲花紫堇及同屬其他藥材指紋圖譜相似度分析 取表1 中除曲花紫堇其他14 種紫堇屬藥材樣品50 批，按“2.1.2”項下方法處理后進樣，與曲花紫堇對照指紋圖譜進行相似度比較分析，結(jié)果見圖3、表3，曲花紫堇與其他14 種紫堇屬藥材有2 個共有峰，相似度在0.078～0.686；取15 種紫堇樣品共60 批，進行指紋圖譜相似度交叉比較，結(jié)果顯示相似度在0.021～0.849，說明各種之間化學(xué)成分差異較大。以上表明該指紋圖譜方法可以反映不同基原紫堇化學(xué)成分的差異，對紫堇屬15 種藥材進行初步鑒別。

表3 曲花紫堇對照指紋圖譜和14 種紫堇相似度比較Table 3 Comparison of similarity of fingerprints of C.curviflora and fourteen species

因暗綠紫堇與曲花紫堇原植物形態(tài)及藥材性狀上極其相似，僅憑外觀評價往往難以鑒別、極易混淆，故選取暗綠紫堇進行進一步指紋圖譜相似度比較分析和化學(xué)模式識別研究，結(jié)果見圖4、表3，曲花紫堇對照指紋圖譜與8 批暗綠紫堇有14 個共有峰，相似度在0.335～0.481。

圖4 曲花紫堇對照指紋圖譜和暗綠紫堇的色譜圖比較Fig.4 Comparison of similarity between control fingerprint of C.curviflora and C.melanochlora

2.3 化學(xué)模式識別

因暗綠紫堇與曲花紫堇原植物形態(tài)及藥材性狀極其相似，且難以鑒別、極易混淆，故選取暗綠紫堇進行進一步化學(xué)模式識別研究。

2.3.1 聚類分析（clustering analysis，CA） 以18批樣品（表1 中10 批曲花紫堇和8 批暗綠紫堇）的14 個指紋圖譜共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，采用Ward 聚類方法，平方歐式距離作為度量標準，Z得分進行數(shù)據(jù)標準化，得到聚類分析樹狀圖，見圖5。當分類距離為25 時，可分為2 類，曲花紫堇聚為一類（Q1～Q10），暗綠紫堇聚為一類（A1～A8）。

圖5 曲花紫堇及暗綠紫堇聚類分析樹狀圖Fig.5 Cluster analysis dendrogram of C.curviflora and C.melanochlora

2.3.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 主成分分析是在盡可能保持原有數(shù)據(jù)信息的前提下，通過降維處理達到簡化指標的計量學(xué)方法[15]。將18 批樣品的14 個共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件，進行主成分分析，結(jié)果見表4。由表4 可知，提取特征值大于1 的4 個成分，其方差的累積貢獻率為89.77%，表明這4 個成分能夠代表14 個指標在這批樣品中大部分的信息，該結(jié)果與PCA 分析結(jié)果相同。

表4 特征根、各主成分的貢獻率Table 4 Contribution rate of characteristic roots and principal components

同時將18 批樣品指紋圖譜的14 個共有色譜峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，采用非監(jiān)督識別方法進行主成分分析，觀察樣品的自然聚集，建立PCA 模型，采用自標度化法（UV）進行縮放[16]，提取4 個主成分，得到模型解釋率參數(shù)R2X為0.89，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.429，表明提取的主成分可解釋89.0%的原始變量，模型的預(yù)測能力為49.2%。18 批樣品的PCA 得分圖見圖6，結(jié)果顯示樣品可分為2 類，一類為曲花紫堇，另一類為暗綠紫堇，與相似度評價和聚類分析結(jié)果相一致，說明2 種紫堇的化學(xué)成分有一定差異。

圖6 18 批紫堇樣品PCA 得分圖Fig.6 PCA score chart of 18 batches of Corydalis

2.3.3 正交偏最小二乘法-判別式分析（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） OPLSDA 是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法。將18 批紫堇的14 個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA14.1 軟件，建立有監(jiān)督模式識別法OPLS-DA 模型進行分析，獲得相應(yīng)模型。其中R2X和R2Y分別為0.863 和0.964，模型預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.823，表示所建模型對X和Y 矩陣的解釋率分別為86.3%和96.4%，模型預(yù)測能力為82.3%，說明該模型穩(wěn)定、可靠。從OPLSDA 得分矩陣圖（圖7）可看出，2 組樣品聚類良好，分離顯著，與PCA 結(jié)果相比，2 組樣品進一步聚集。運用統(tǒng)計推斷分析進一步驗證鑒別模型，圖8 為OPLS-DA 模型置換驗證圖，圖中Q2為累積交叉有效性，Q2值越大表示模型預(yù)測能力越好；R2為累積方差值，表示原始數(shù)據(jù)被用于建立新的OPLS-DA判別模型的解釋率，R2值越大模型解釋能力越強[15]。置換檢驗參數(shù)R2和Q2的截距值分別為0.412 和?1.18，位于右邊的OPLS-DA 模型原始R2和Q2值均大于其左邊隨機排列后的R2和Q2，說明建立的OPLS-DA 模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。

圖7 18 批紫堇樣品OPLS-DA 得分圖Fig.7 OPLS-DA score plots of 18 batches of Corydalis

圖8 18 批紫堇樣品OPLS-DA 模型的置換驗證Fig.8 OPLS-DA permutation test of 18 batches of Corydalis

變量重要性投影值（variable importance in projection scores，VIP）是篩選差異性化合物的重要指標，VIP 值越高，對組間差異的影響越大[15]。結(jié)合VIP 法，以變量VIP 值＞1.0 為顯著影響，共找到兩種基原藥材的6 個差異性標志物，結(jié)果見圖9，分別為峰7、峰3（綠原酸）、峰8（蘆?。?、峰5、峰2（新綠原酸）以及峰1，根據(jù)VIP 值大小進行排序，為峰7＞綠原酸＞蘆?。痉?＞新綠原酸＞峰1，這些峰是引起曲花紫堇和暗綠紫堇之間差異的主要變量，其余峰VIP 值小于1，對區(qū)分樣品影響較小。

圖9 18 批紫堇樣品14 個共有峰的VIP 值Fig.9 VIP values of 14 common peaks of 18 batches of Corydalis

3 討論

本研究建立了曲花紫堇HPLC 指紋圖譜方法，并對紫堇屬藥材進行對比研究，同時結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)對暗綠紫堇的準確區(qū)分及反映差異標志物，能夠有效地鑒別曲花紫堇及同屬藥材，為紫堇屬藥材質(zhì)量評價提供方法及科學(xué)依據(jù)。

3.1 供試品溶液制備方法考察和色譜條件優(yōu)化

本實驗考察冷浸、超聲、回流3 種提取方法，結(jié)果表明超聲提取效率最高。同時對提取溶劑（甲醇、70%甲醇、甲醇、鹽酸-70%甲醇（1∶100）、乙醇），提取時間（15、30、60 min）進行考察，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇為提取溶劑，超聲處理30 min 提取效果佳；考察了不同色譜柱，確定以Agilent ZORBAX Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）所得到的色譜圖峰形最好，峰數(shù)多。檢測波長經(jīng)DAD 全波長圖譜對比，同時考慮基線，發(fā)現(xiàn)289 nm 下色譜峰信息全面，基線平穩(wěn)，因此選擇檢測波長為289 nm。對流動相（甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水），體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）進行考察，以流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃為佳。

3.2 曲花紫堇及同屬藥材指紋圖譜分析

質(zhì)量控制研究一直是中藥研究與發(fā)展的關(guān)鍵[17]。指紋圖譜能比較全面地反映出中藥所含的化學(xué)成分種類和數(shù)量，體現(xiàn)藥材的整體質(zhì)量和臨床的整體療效[13]。目前對于紫堇屬藏藥的鑒別研究較少，多種混用品的區(qū)分不夠全面，同等入藥使用影響該屬藏藥的臨床規(guī)范使用。以《四川省藏藥材標準》2020版收載的曲花紫堇藥材為主建立指紋圖譜，可為紫堇屬藥材的基原鑒定和質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。因此本研究首次建立了曲花紫堇藥材HPLC 對照指紋圖譜，標定18 個共有峰，識別了其中10 種成分，能全面反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量；曲花紫堇對照指紋圖譜與紫堇屬其他藥材相似度在0.078～0.686，說明該指紋圖譜方法可以顯示出不同紫堇的化學(xué)成分差異，可以有效區(qū)分曲花紫堇和同屬其他混淆藥材；對紫堇屬15 種藥材的指紋圖譜進行相似度交叉比較，相似度在0.021～0.849，表明上述藥材化學(xué)成分存在較大差異，是否可以同等入藥使用，有待后續(xù)藥效進一步研究。所建立的指紋圖譜方法適用于區(qū)別紫堇屬大部分藥材，可為紫堇屬藥材提供有效可行的指紋圖譜鑒別方法。

3.3 曲花紫堇及暗綠紫堇的模式識別分析

曲花紫堇和暗綠紫堇藥材及易混淆，鑒別研究較少，缺乏指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)層面的區(qū)分鑒別，且尚未提出差異標志物。因此本實驗基于HPLC 指紋圖譜和化學(xué)模式識別對兩者進行區(qū)分研究，實驗數(shù)據(jù)表明，曲花紫堇與暗綠紫堇的指紋圖譜中具有14 個共有峰，含有的化學(xué)成分種類大體基本一致。但相似度計算結(jié)果卻有明顯差異，說明2 種藥材在化學(xué)成分上還是存在一定的差異。為進一步區(qū)分2 種基原，尋找差異性成分，使用化學(xué)模式識別研究，對曲花紫堇和暗綠紫堇的指紋圖譜進行聚類分析和主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 種紫堇化學(xué)成分存在差異，模式識別分析可很好的區(qū)分2 個種。并利用所建立的OPLS-DA 模型分析，找到了6 個差異性成分，其中綠原酸、蘆丁、新綠原酸3 個成分經(jīng)對照品比對確認，說明藥材中含有的黃酮類和酚酸類成分具有差異，能夠作為區(qū)分2種藥材的依據(jù)，為后期質(zhì)量標志物的確定提供研究思路。實驗結(jié)果證明該方法準確可靠，專屬性強，為2種藥材的區(qū)分和質(zhì)量控制提供分析方法和參考依據(jù)。

目前只收集到8 批暗綠紫堇，該種的指紋圖譜樣本量不足。6 個差異性標志物，目前只指認出綠原酸、蘆丁、新綠原酸，另外3 個差異性標志物所代表的化學(xué)成分及其藥理活性有待后續(xù)進一步研究。

本研究采用HPLC 指紋圖譜結(jié)合相似度評價以及化學(xué)計量學(xué)識別方法對紫堇屬不同藥材綜合分析，可對曲花紫堇及紫堇屬其他易混淆藥材進行有效區(qū)分，為紫堇屬不同藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價提供依據(jù)和參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突