中藥苦味成分的發(fā)現(xiàn)策略與方法研究進(jìn)展

劉 惠，宋 嬌，林俊芝，蘇 娟，柯秀梅，仇 敏，楊 明，張定堃*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，代謝性疾病中醫(yī)藥調(diào)控四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072

3.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016

4.江西中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

中藥苦味成分來(lái)源廣泛，結(jié)構(gòu)多樣，呈味特征復(fù)雜。如何精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)與辨識(shí)中藥苦味成分，是推動(dòng)中藥抑苦掩味技術(shù)精準(zhǔn)化發(fā)展的重要前提。經(jīng)過(guò)多年的現(xiàn)代研究，部分臨床常用苦味中藥的主要呈味物質(zhì)已相對(duì)清晰，基本擺脫了“黑箱”狀態(tài)。如黃連的主要苦味成分是小檗堿、表小檗堿、藥根堿等生物堿類(lèi)[1]；穿心蓮的主要苦味成分是穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等萜類(lèi)[2]；雞內(nèi)金的主要苦味成分是L型苦味氨基酸等[3]。然而，由于中藥苦味成分的靶向分離面臨技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致很多中藥的苦味成分仍有待闡明，整體研究尚處于“灰箱”狀態(tài)。具體表現(xiàn)在以下2 個(gè)方面。（1）挖掘苦味成分的導(dǎo)向性不夠：中藥苦味成分種類(lèi)多，包括生物堿、黃酮、萜類(lèi)、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽及雜醇等大類(lèi)成分，部分藥物可能同時(shí)含有多類(lèi)苦味成分，導(dǎo)致傳統(tǒng)苦味成分分離方法缺乏導(dǎo)向性。同時(shí)，各類(lèi)苦味成分的理化性質(zhì)并不完全相同，分離過(guò)程容易出現(xiàn)苦味部位分散的情形，增加苦味成分示蹤難度。（2）苦味驗(yàn)證的還原性不足：中藥的苦味呈現(xiàn)往往是多種同系物、同分異構(gòu)體等化合物的苦味疊加，成分濃度、成分種類(lèi)對(duì)口感影響大。此外，藥物中的酸味成分會(huì)增強(qiáng)苦味的感知、咸味成分會(huì)抑制苦味的感知[4]，這些影響因素使得苦味成分在單一狀態(tài)下與在中藥復(fù)雜體系下的呈味特征存在差異。

基于此，本文通過(guò)對(duì)中藥苦味成分的發(fā)現(xiàn)方法進(jìn)行總結(jié)，并進(jìn)一步提出辨識(shí)中藥苦味成分的新方法、研究苦味成分的新思路，推動(dòng)中藥苦味成分解析方法的傳承創(chuàng)新，為深入理解中藥苦味成分的結(jié)構(gòu)特征與呈味規(guī)律，科學(xué)制訂抑苦掩味技術(shù)方案提供支撐。

1 基于本草學(xué)知識(shí)發(fā)現(xiàn)苦味成分

1.1 基于中藥性能特征發(fā)現(xiàn)苦味成分

中藥傳統(tǒng)藥性理論中的“五味”理論，記載了藥物的酸、苦、甘、辛、咸5 種藥味。其中，苦味的性能特點(diǎn)為能泄、能燥，功效表現(xiàn)為清熱瀉火、通泄大便、燥濕堅(jiān)陰等，多集中于清熱藥、瀉下藥等。但長(zhǎng)久以來(lái)，傳統(tǒng)本草文獻(xiàn)中對(duì)于藥物性能藥味的記載與真實(shí)滋味的記載混雜，部分藥物作為性能的五味與真實(shí)滋味相同，如黃連、苦參等。也有部分藥物作為性能的五味與真實(shí)滋味并不完全一致，如雞內(nèi)金藥性為甘味，突出其健胃消食功效，但其真實(shí)滋味又為微苦味。文獻(xiàn)記載的藥性“五味”與口嘗滋味的混雜，為藥性理論研究帶來(lái)了困惑，但也為藥物真實(shí)滋味的研究提供了線(xiàn)索。對(duì)于一些臨床使用頻率較低、藥味研究較薄弱的中藥或民族藥，可通過(guò)文獻(xiàn)藥性記載或功效特點(diǎn)初步判斷其真實(shí)滋味，繼而尋找苦味成分。胡亞楠[5]建立了苦味性、效生物網(wǎng)絡(luò)，從現(xiàn)代科學(xué)的角度闡釋真實(shí)苦味和性能苦味相關(guān)靶點(diǎn)的一致性，探究苦味中藥與清熱解毒生物靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)程度，提示可遵循該線(xiàn)索發(fā)現(xiàn)中藥的苦味成分。

1.2 基于苦味植物來(lái)源發(fā)現(xiàn)苦味成分

藥用植物親緣學(xué)在尋找替代藥源、開(kāi)發(fā)植物新類(lèi)群中具有重要的指導(dǎo)作用[6]，為挖掘苦味新成分和開(kāi)發(fā)中藥苦味新應(yīng)用拓展了思路。研究苦味中藥的植物來(lái)源，主要分布于菊科、蕓香科、百合科、豆科、唇形科、傘形科、五加科（圖1）等，苦味成分廣泛分布的類(lèi)群可能蘊(yùn)含更多的潛在苦味成分。在植物分類(lèi)學(xué)中，親緣相同或相近的物種表現(xiàn)出相似的外觀性狀，可能蘊(yùn)含相似的生物學(xué)信息，遺傳規(guī)律下可能具有相同或相近的次生代謝產(chǎn)物合成途徑，因此含有某些相同成分的幾率更大。以人參為例，苦味主要來(lái)源于人參皂苷類(lèi)成分，其同科同屬近種的西洋參與三七也具有類(lèi)似的苦味、含有相同的人參皂苷類(lèi)成分。此外，三七中人參皂苷含量顯著高于人參、西洋參，因此，三七的苦味更為強(qiáng)烈。挖掘苦味成分時(shí)，從中藥植物親緣性出發(fā)，可為判別苦味來(lái)源縮小篩選范圍、減少研究的盲目性，即優(yōu)先選擇與已知苦味中藥親緣相近的物種作為苦味研究的對(duì)象。

圖1 按主要苦味成分劃分的中藥分布Fig.1 Distribution of traditional Chinese medicine by main bitter components

2 苦味成分的分離與分析方法

2.1 苦味部位的逐步分離與精制

采用分離技術(shù)將苦味成分從中藥中逐步分離、濃集，是研究苦味成分的關(guān)鍵。系統(tǒng)分離法結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂分離是獲得苦味成分集中部位的常用方法。根據(jù)苦味成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，大多數(shù)苦味成分都有一定疏水性或疏水結(jié)構(gòu)[7]，主要存在于中低極性溶劑部位。根據(jù)“相似相溶”原理，系統(tǒng)溶劑分離法[8]可獲得相應(yīng)溶劑的提取部位。相較于離子交換色譜多應(yīng)用于分離具有離子官能團(tuán)的成分，凝膠濾過(guò)色譜主要用于分離存在相對(duì)分子質(zhì)量差異的成分，大孔樹(shù)脂吸附分離法應(yīng)用范圍更廣泛，更適用于各種天然產(chǎn)物的分離純化[9]，通過(guò)對(duì)初分離得到的苦味成分群進(jìn)行吸附和洗脫，可實(shí)現(xiàn)苦味成分的進(jìn)一步精制、富集。由于不同樹(shù)脂型號(hào)對(duì)不同化合物吸附能力不同，根據(jù)潛在苦味成分的結(jié)構(gòu)特征選擇合適的樹(shù)脂型號(hào)，可達(dá)到更好的分離效果。

2.2 現(xiàn)代分析方法鑒定苦味成分

結(jié)合感官導(dǎo)向的現(xiàn)代分析技術(shù)是研究中藥苦味成分的重要手段，有助于提高發(fā)現(xiàn)苦味成分的效率。Pickrahn 等[10]通過(guò)二維液相色譜結(jié)合滋味稀釋分析方法，從茴香提取物的256 種組分中識(shí)別到苦味閾值最低的成分2-甲基丁酸反式假異戊烯醇，現(xiàn)代分析方法與感官導(dǎo)向方法有助于從復(fù)雜滋味成分中快速篩選關(guān)鍵苦味成分。超高效液相色譜聯(lián)合飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜是現(xiàn)代應(yīng)用最廣的分析技術(shù)之一[11]，能實(shí)現(xiàn)中藥組分的識(shí)別與鑒定。Yu 等[12]在感官引導(dǎo)下借助高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出杭白芷中的水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒酚、歐前胡素、異茴芹內(nèi)酯和氧化前胡素6 種苦味成分。Ke 等[13]通過(guò)溶劑萃取、色譜分離、感官分析、超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定等多種分析方法的聯(lián)用，從花椒中分離出了7-甲氧基香豆素和8-異戊烯基山柰酚2 種苦味成分。

2.3 主客觀方法聯(lián)用評(píng)價(jià)苦味特征

藥物口感評(píng)價(jià)包括感官評(píng)價(jià)等主觀分析方法和動(dòng)物偏好實(shí)驗(yàn)、電子舌評(píng)價(jià)、電生理實(shí)驗(yàn)等客觀分析方法[14]，其中，感官評(píng)價(jià)和電子舌應(yīng)用較多。感官評(píng)價(jià)是經(jīng)典的苦味評(píng)價(jià)方法，運(yùn)用范圍最廣、時(shí)間最久、最能反映真實(shí)味覺(jué)，志愿者可準(zhǔn)確描述藥物的苦味特征及其他感官特征。但由于志愿者個(gè)體差異大，評(píng)價(jià)結(jié)果受志愿者生理、心理及環(huán)境因素的影響[15]，評(píng)價(jià)結(jié)果差異較大；此外，對(duì)于部分存在毒性、刺激性樣品難以適用。電子舌是味覺(jué)評(píng)價(jià)的重要方法，采用膜電位傳感器模擬人體的味覺(jué)感受器，將苦味化合物濃度信號(hào)轉(zhuǎn)換為電勢(shì)信號(hào)予以量化表征，具有檢測(cè)靈敏、樣品消耗量少等優(yōu)點(diǎn)。Zhang 等[16]采用電子舌評(píng)價(jià)輔助發(fā)現(xiàn)穿心蓮的4 種關(guān)鍵苦味成分——穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯。但電子舌傳感電極工作原理始終不同于人體真實(shí)的味覺(jué)細(xì)胞，評(píng)價(jià)結(jié)果與真實(shí)的味覺(jué)感受存在一定差異[17]。感官評(píng)價(jià)與電子舌評(píng)價(jià)各有所長(zhǎng)，滋味研究中通常將2 種方法聯(lián)用以彌補(bǔ)不足，相互佐證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。張璞等[18]以不同苦味中藥水煎液為研究對(duì)象，將感官評(píng)價(jià)與電子舌評(píng)價(jià)相結(jié)合，探究了不同種類(lèi)苦味成分的苦度疊加規(guī)律。

2.4 成分敲入法還原驗(yàn)證苦味

對(duì)于分離出的單一苦味成分，其苦味特征可能與中藥材或水煎液的整體苦味特征有明顯差異。因此，潛在苦味成分既需要單一口感驗(yàn)證，也需要置于整體背景下進(jìn)行驗(yàn)證。成分敲入法是指將潛在苦味成分按照不同濃度梯度分別加入到藥液樣品中，通過(guò)比較敲入前后不同組別樣品的口感差異，評(píng)價(jià)潛在苦味成分對(duì)于整體口感的貢獻(xiàn)度，探究其“含量-苦味強(qiáng)度”關(guān)系[19-20]。成分敲入法[21]符合中藥復(fù)雜體系組成特征，能在整體背景下還原驗(yàn)證潛在成分苦味，是一種較好的驗(yàn)證方法。丁涌波等[22]在挖掘花椒精油苦味來(lái)源的研究中，通過(guò)減壓蒸餾份離出各餾份，在感官導(dǎo)向下定位苦味餾份，利用氣相色譜-質(zhì)譜法鑒定出了花椒中芳樟醇、崖伯酮、香芹酮、隱品酮4 種主要的苦味成分，最后采用對(duì)照品加入法結(jié)合苦味閾值相關(guān)性分析驗(yàn)證其苦味?？辔冻煞址蛛x、分析、評(píng)價(jià)、驗(yàn)證過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 苦味成分分離、分析、評(píng)價(jià)、驗(yàn)證過(guò)程Fig.2 Process of separating, analyzing, evaluating, and verifying of bitter components

3 基于結(jié)構(gòu)相似性的苦味成分發(fā)現(xiàn)策略

結(jié)構(gòu)相似性是發(fā)現(xiàn)新成分或現(xiàn)有成分新活性的重要識(shí)別手段，通過(guò)對(duì)“模板”成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)對(duì)比，推測(cè)具有一定結(jié)構(gòu)相似性的未知成分可能具有“模板”成分的相同或相似性質(zhì)，結(jié)構(gòu)上的差異性又導(dǎo)致該成分表現(xiàn)出不同于“模版”成分的性質(zhì)。以黃連為例，其化學(xué)成分小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿的合成前體物都是苯丙氨酸，類(lèi)別上均屬于異喹啉類(lèi)生物堿，結(jié)構(gòu)中都含有異喹啉環(huán)、氮堿基，使其均具有相似的苦味[23]。但由于這幾種生物堿在供氫體數(shù)量、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、疏水性等結(jié)構(gòu)參數(shù)上存在差異，苦味強(qiáng)度總體呈現(xiàn)出黃連堿＞表小檗堿＞小檗堿＞巴馬?。舅幐鶋A[24]。

大量研究表明，苦味成分的苦味強(qiáng)度受到相關(guān)連接基團(tuán)的影響?？Х葔A、柚皮苷、膽汁因含重氮基團(tuán)而呈現(xiàn)苦味，生物堿的苦味強(qiáng)度受氮元素雜化狀態(tài)影響[25]；無(wú)機(jī)鹽因含鋰、鈣、銣、銫等堿金屬離子可與某些成分絡(luò)合從而產(chǎn)生苦味[26]；蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸因暴露的疏水性基團(tuán)而呈現(xiàn)苦味[27]；酚類(lèi)成分的苦味與相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)[28]。此外，糖苷類(lèi)、萜類(lèi)成分的苦味與化學(xué)鍵有關(guān)，含硫苷鍵、氮苷鍵、氰苷鍵的苷類(lèi)成分大多具有苦味，萜類(lèi)成分因其內(nèi)酯、內(nèi)縮醛、內(nèi)氫鍵、糖苷羥基等可形成螯合物而呈現(xiàn)苦味[29]。綜上，各類(lèi)成分的苦味主要與官能團(tuán)、相對(duì)分子質(zhì)量及化學(xué)鍵有關(guān)（表1）。BitterPredict 是一個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法的苦味分類(lèi)器，主要以BitterDB 數(shù)據(jù)庫(kù)為苦味分子數(shù)據(jù)集，以現(xiàn)有文獻(xiàn)中檢索到的非苦味分子為非苦味分子數(shù)據(jù)集，在機(jī)器算法下通過(guò)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其是否味苦，在一些外部測(cè)試集和感官驗(yàn)證中正確分類(lèi)了70%～90%的化合物[32]。此外，BitterPredict 在苦味分類(lèi)過(guò)程中突出了總電荷、表面相關(guān)性質(zhì)和毒性等分子性質(zhì)作為區(qū)分苦味與非苦味的重要依據(jù)，為深入理解苦味分子的結(jié)構(gòu)特征和呈味規(guī)律提供參考?；诮Y(jié)構(gòu)相似性或苦味基團(tuán)發(fā)現(xiàn)苦味成分的重要前提是化學(xué)結(jié)構(gòu)已知，故此法多應(yīng)用于結(jié)構(gòu)已知成分的苦味判斷。

表1 苦味種類(lèi)及其代表性苦味成分、呈苦原因Table 1 Bitter types and their representative bitter components, cause of bitter

4 基于苦味受體的苦味成分發(fā)現(xiàn)策略

苦味受體對(duì)苦味成分的識(shí)別作用是判斷化合物苦味的重要依據(jù)?？辔斗肿蛹せ羁辔妒荏w，引起苦味細(xì)胞膜去極化、釋放神經(jīng)遞質(zhì)，信號(hào)傳導(dǎo)至大腦皮層形成苦味的認(rèn)知?？辔陡兄獙?shí)際是苦味物質(zhì)與苦味受體在結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)、能量互補(bǔ)。三點(diǎn)接觸理論是目前公認(rèn)度最高的苦味成分結(jié)構(gòu)理論，認(rèn)為苦味化合物分子與苦味受體均應(yīng)具有AH（親電性基團(tuán)）、B（親核性基團(tuán)）及X（疏水基團(tuán)），其中，化合物AH 與受體A′結(jié)合，化合物X 與受體X′結(jié)合，而B(niǎo)′位置懸空，方能形成苦味[33]?；诳辔妒荏w的識(shí)別作用，梳理出分子對(duì)接、藥效團(tuán)模型等虛擬篩選方法，細(xì)胞膜色譜法、親和超濾法等生物垂釣篩選方法[34]，及等溫滴定量熱法、鈣離子測(cè)定等理化檢測(cè)篩選方法（表2）。

表2 苦味物質(zhì)研究方法Table 2 Research methods for bitter components

分子對(duì)接和藥效團(tuán)模型基于苦味受體理論快速篩選潛在苦味成分，為苦味分子與苦味受體的結(jié)合作用提供重要信息，輔助苦味成分的結(jié)構(gòu)分析；細(xì)胞膜色譜法和親和超濾法基于苦味受體對(duì)苦味成分的識(shí)別作用，利用苦味受體篩選中藥混合組分中的苦味物質(zhì)；等溫滴定量熱法測(cè)量反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中的熱量變化，檢測(cè)苦味分子的存在，判斷成分的苦味強(qiáng)弱；鈣離子測(cè)定是苦味信號(hào)的間接表征，鈣離子信號(hào)的強(qiáng)弱反映苦味成分的多少。相較于依據(jù)成分的結(jié)構(gòu)相似性判別苦味，基于苦味受體對(duì)苦味分子的結(jié)合作用，采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選、生物化學(xué)檢測(cè)方法，判別苦味成分與苦味受體的結(jié)合能、反應(yīng)熱、反應(yīng)信號(hào)，利用超濾膜、生物柱色譜濾過(guò)篩選苦味成分，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具象，也更具說(shuō)服力。

4.1 虛擬篩選

4.1.1 分子對(duì)接 分子對(duì)接是基于受體結(jié)構(gòu)篩選配體分子的虛擬篩選方法，在中藥活性成分篩選中發(fā)揮著重要作用。分子對(duì)接法借助化合物數(shù)據(jù)庫(kù)、對(duì)接軟件對(duì)化合物分子和生物受體進(jìn)行對(duì)接模擬，利用機(jī)器算法對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)[35]，以評(píng)價(jià)結(jié)果判斷化合物分子與生物受體親和力，以此篩選高親和力的目標(biāo)成分。對(duì)接過(guò)程主要包括數(shù)據(jù)庫(kù)選擇化合物分子、化合物與受體三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化、對(duì)接方法選擇、對(duì)接結(jié)果評(píng)價(jià)等。BitterDB 是應(yīng)用較多的公共苦味分子數(shù)據(jù)庫(kù)，涵蓋700 多種苦味成分的名稱(chēng)、結(jié)構(gòu)、能激活的苦味受體及苦味成分間的相似度[36]，為苦味分子對(duì)接提供了數(shù)據(jù)平臺(tái)。韓彥琪等[37]利用同源建模、分子對(duì)接，初步推測(cè)延胡索中原小檗堿型化合物可能是其主要的苦味成分。李軒豪等[38]采用分子對(duì)接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)翼首草中的苦味成分主要是8-表馬錢(qián)苷酸、馬錢(qián)苷酸等環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分和新綠原酸、咖啡酸等酚酸類(lèi)成分。需要注意的是，分子對(duì)接結(jié)果的準(zhǔn)確性主要依賴(lài)于對(duì)接方法及評(píng)價(jià)打分，對(duì)接分?jǐn)?shù)高不代表分子配體與生物受體結(jié)合作用一定好，后續(xù)還需進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4.1.2 藥效團(tuán)模型 藥效理論認(rèn)為相同活性的分子有結(jié)構(gòu)相同的藥效團(tuán)。藥效團(tuán)模型在苦味成分篩選中發(fā)揮著重要作用，是應(yīng)用較多的虛擬篩選方法之一。該方法的重點(diǎn)是構(gòu)建藥效團(tuán)模型和篩選候選物。構(gòu)建藥效團(tuán)主要內(nèi)容包括生成數(shù)據(jù)集、構(gòu)建藥效團(tuán)、驗(yàn)證藥效團(tuán)。目前已知人類(lèi)的苦味受體有25 種，不同苦味受體結(jié)構(gòu)存在差異，任何一種苦味受體都無(wú)法識(shí)別所有的苦味分子。Meyerhof 等[39]驗(yàn)證了人體內(nèi)25 個(gè)苦味受體與苦味成分間并非“一對(duì)一”識(shí)別，如典型的苦味成分——咖啡因[40]，可以同時(shí)被TAS2R7、10、43、46 多個(gè)苦味受體識(shí)別，TAS2R39可以同時(shí)識(shí)別茶黃素和茶黃素-3,3′-O-雙沒(méi)食子酸酯[41]。為提高篩選苦味成分成功率的同時(shí)減少工作量，一般選擇具有苦味廣譜性的 TAS2R10、TAS2R14[42-43]、TAS2R46[39]受體來(lái)構(gòu)建藥效團(tuán)模型。Zhang 等[44]通過(guò)構(gòu)建TAS2R14 藥效團(tuán)模型，從柴胡主要活性成分柴胡皂苷的3 種亞型（柴胡皂苷a～c）中鑒定出柴胡皂苷b 為T(mén)AS2R14 的直接激動(dòng)劑。Ke 等[45]建立了TAS2R10、14、46 受體的藥效團(tuán)模型，分別從黃連解毒湯中篩選出二氫木脂素A、黃芩黃酮II、黃柏酮等15 或16 種苦味成分。分子對(duì)接、藥效團(tuán)模型是應(yīng)用最廣泛的虛擬篩選方法，2 種方法常在數(shù)據(jù)平臺(tái)和計(jì)算機(jī)軟件結(jié)合使用。此外，藥效團(tuán)模型與化學(xué)計(jì)量方法聯(lián)用可用于推測(cè)苦味分子構(gòu)象、計(jì)算配體與受體結(jié)合能量。

4.2 生物垂釣

4.2.1 親和超濾法 親和超濾法是一種基于生物受體親和作用篩選配體分子的方法[46]，與分析方法聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)活性成分的快速篩選與識(shí)別。分離苦味受體細(xì)胞并培養(yǎng)，將其固定在超濾膜上來(lái)過(guò)濾篩選潛在的苦味物質(zhì)（圖3）。篩選苦味成分主要有2 部分：（1）親和識(shí)別、濾過(guò)篩選苦味成分；（2）解析成分、驗(yàn)證活性。在親和識(shí)別成分中，需對(duì)親和條件如苦味受體的用量進(jìn)行考察。若苦味受體過(guò)多，無(wú)親和力或弱親和力的成分可能會(huì)通過(guò)物理作用與空白受體結(jié)合，造成假陽(yáng)性結(jié)果；倘若苦味受體過(guò)少，活性成分可能會(huì)因無(wú)靶標(biāo)受體可結(jié)合而流失，造成假陰性結(jié)果。在成分分析部分，親和超濾法常聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)或液質(zhì)技術(shù)用于中藥活性成分的篩選[46-47]。相較于傳統(tǒng)的提取、分離、鑒定再活性驗(yàn)證的分析方法，親和超濾法在篩選苦味活性成分的同時(shí)，剔除了無(wú)苦味活性的成分，達(dá)到富集苦味成分的效果，有利于苦味成分的高效發(fā)現(xiàn)。

圖3 親和超濾法和細(xì)胞膜色譜法篩選苦味成分Fig.3 Affinity ultrafiltration method and cell membrane chromatography method screen bitter components

4.2.2 細(xì)胞膜色譜法 細(xì)胞膜色譜法是一種基于膜受體與配體分子親和作用識(shí)別、分離活性成分的生物色譜方法[48]。根據(jù)目標(biāo)成分選用相關(guān)活性的細(xì)胞，可分離相應(yīng)活性成分。在以苦味成分作為目標(biāo)成分的細(xì)胞膜色譜法篩選實(shí)驗(yàn)中，將苦味細(xì)胞膜嵌合到色譜柱中作為固定相，含有潛在苦味成分的中藥提取液流經(jīng)色譜柱模擬服藥后中藥成分的體內(nèi)過(guò)程，色譜柱可有效保留與苦味受體親和程度高的藥物分子，達(dá)到苦味受體親和識(shí)別苦味成分和色譜柱分離苦味成分的雙重作用。細(xì)胞膜存在活性周期，可能因?yàn)榍逗喜环€(wěn)固而脫落，影響篩選成分的效率。為提高細(xì)胞膜色譜柱的使用周期，通常會(huì)在傳統(tǒng)細(xì)胞膜色譜法的基礎(chǔ)上做出改進(jìn)，如利用磁性納米顆粒輔助穩(wěn)定細(xì)胞膜[49]。細(xì)胞膜色譜法利用苦味細(xì)胞膜的特異性識(shí)別苦味成分，利用高效率的色譜柱分離苦味成分，有望為分離中藥苦味成分提供一種生物垂釣結(jié)合化學(xué)分離的篩選方法。Tang 等[50]將小鼠胚胎成纖維3t3-l1 細(xì)胞與黃連粗提物共孵化，再結(jié)合高效液相色譜分析技術(shù)，應(yīng)用此法成功篩選出黃連中的小檗堿成分。

4.3 理化檢測(cè)

4.3.1 等溫滴定量熱法 等溫滴定量熱法是基于化合物分子與生物蛋白相互作用產(chǎn)生的微量熱變化來(lái)識(shí)別成分，是一種通過(guò)物理檢測(cè)識(shí)別生物反應(yīng)來(lái)篩選苦味物質(zhì)的方法[51]。分子間發(fā)生作用會(huì)產(chǎn)生熱量信息，測(cè)定反應(yīng)過(guò)程的焓、熵、自由能等熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合解離常數(shù)、結(jié)合常數(shù)等可推測(cè)反應(yīng)物的化學(xué)計(jì)量比。此法還可直接測(cè)量反應(yīng)速率[52]，一定程度上反映化合物的濃度和活性。采用此法篩選苦味成分，計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)苦味受體結(jié)合苦味成分時(shí)的熱量變化，以此表征是否存在苦味成分及其結(jié)合強(qiáng)弱（圖4）。Ogi 等[53]采用等溫滴定量熱法檢測(cè)苦味成分與脂肪酸發(fā)生作用時(shí)的熱量變化，發(fā)現(xiàn)熱量變化強(qiáng)度與脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度有關(guān)，為脂肪酸掩蔽苦味機(jī)制研究提供重要參考。柚皮素是一種苦味的類(lèi)黃酮，與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物可有效掩蓋苦味，Nunes 等[54]采用等溫滴定量熱法表征柚皮素與乳鐵蛋白1∶1復(fù)合物的熱力學(xué)結(jié)合，結(jié)果表明該復(fù)合物的形成主要由焓和熵驅(qū)動(dòng)。相較于其他苦味成分篩選方法，該法無(wú)需固定或標(biāo)記苦味受體，穩(wěn)定性好、靈敏度高，可用于檢測(cè)苦味成分的初步篩選。

圖4 等溫滴定量熱法和鈣離子測(cè)定法檢測(cè)苦味成分Fig.4 Isothermal titration calorimetry method and calcium ion measurement method detect bitter components

4.3.2 鈣離子測(cè)定法 鈣離子是苦味受體上鈣敏感體的內(nèi)源性配體，可作為反映苦味成分激活苦味受體的重要信號(hào)[55]。苦味信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中會(huì)引起鈣離子內(nèi)流、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，苦味細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度會(huì)發(fā)生顯著變化。鈣離子量化手段成熟，鈣離子測(cè)定、鈣離子成像[56]可以量化胞內(nèi)鈣離子變化。Abbas 等[57]通過(guò)鈣成像反應(yīng)，輔助啤酒花苦酸（matured hop bitter acids，MHBA）篩選能誘導(dǎo)MHBA刺激腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）的苦味受體，結(jié)果表明，人TAS2R1、8、10和小鼠TAS2R119、130、105 有助于MHBA 誘導(dǎo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生CCK。鈣成像技術(shù)可以記錄胞內(nèi)鈣離子的動(dòng)態(tài)變化，鈣離子熒光探針[58]可將受體細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度變化通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)化以熒光的形式展現(xiàn)出來(lái)（圖4）。雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子的流動(dòng)、細(xì)胞膜上鈣離子的進(jìn)出并非僅由苦味沖動(dòng)引發(fā)，但該法可用于潛在苦味成分的快速篩查。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

譜-效關(guān)聯(lián)法利用數(shù)據(jù)分析方法將指紋圖譜與藥效學(xué)信息關(guān)聯(lián)，常應(yīng)用于中藥活性與成分關(guān)系研究和中藥質(zhì)量控制[59]，為苦味成分發(fā)現(xiàn)提供了新思路——譜-味關(guān)聯(lián)。譜-味關(guān)聯(lián)以中藥化學(xué)成分指紋圖譜和口感評(píng)價(jià)為研究?jī)?nèi)容，以數(shù)據(jù)分析方法為研究手段，構(gòu)建譜-味數(shù)學(xué)模型，揭示成分-苦味的相關(guān)性。現(xiàn)代技術(shù)支撐下的中藥化學(xué)指紋圖譜、中藥生物指紋圖譜能全面反映苦味中藥的整體組分和藥效活性，灰色關(guān)聯(lián)度分析、多元線(xiàn)性回歸分析、主成分分析等單一分析方法使用或多種分析方法聯(lián)用等數(shù)據(jù)分析方法將為苦味成分的篩選提供有力支撐。課題組以譜-味關(guān)聯(lián)為研究思路，解析了12 批不同來(lái)源三七水提液化學(xué)指紋圖譜與苦味強(qiáng)度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了人參皂苷Rg1等3 種主要苦味成分[60]，為其他苦味成分的發(fā)現(xiàn)提供了方法參考。

本文根據(jù)中藥苦味特點(diǎn)結(jié)合當(dāng)下研究手段綜述了中藥苦味成分的發(fā)現(xiàn)策略，為從中藥復(fù)雜體系中分離分析苦味成分提供了方法參考。本草學(xué)知識(shí)可通過(guò)文獻(xiàn)性效記載、植物親緣關(guān)系初步判斷藥物的整體苦味，減少苦味成分篩選的盲目性。傳統(tǒng)分離手段逐步分離富集苦味成分，定性定量分析手段可輔助實(shí)現(xiàn)苦味成分的精準(zhǔn)辨識(shí)。利用苦味成分的結(jié)構(gòu)相似性或特征性苦味基團(tuán)，是發(fā)現(xiàn)苦味成分的重要途徑。基于苦味受體的識(shí)別作用，發(fā)展出分子對(duì)接等虛擬篩選方法、親和超濾等生物垂釣篩選方法、等溫滴定量熱等理化檢測(cè)方法?；跀?shù)據(jù)挖掘和機(jī)器算法的發(fā)展，譜-味分析法可為發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵苦味成分提供參考方法。上述方法在挖掘苦味成分方面各有優(yōu)勢(shì)，但也存在一定局限性，多法聯(lián)用可取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高苦味成分的發(fā)現(xiàn)幾率，將成為未來(lái)中藥苦味成分發(fā)現(xiàn)的重要思路。中藥苦味成分的精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于深入理解中藥的苦味呈味特征與機(jī)制具有理論價(jià)值，對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)性的掩苦抑味方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突