基于生物信息學分析活動期潰瘍性結(jié)腸炎銅死亡相關基因及調(diào)控中藥預測

高松林，覃 雁，張 鵬，謝蘭芳，徐 哲，梁 菲，黃貴華

1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000

2.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545000

3.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結(jié)腸、直腸炎癥為特征的慢性非特異性炎癥性疾病[1]。UC 是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的一種，在過去的30 年里，IBD 在我國的年發(fā)病率逐漸上升，達到3.01/10 萬，年患病率為47.06/10 萬[2]。2023 年全世界UC 的患病率估計為500 萬例，并且發(fā)病率呈上升趨勢[3]。UC 根據(jù)內(nèi)鏡下表現(xiàn)和臨床癥狀可分為活動期和緩解期，活動期UC 患者常有腹痛、腹瀉、黏液膿血便等典型臨床癥狀，是臨床治療的重點和難點[4]。UC 是結(jié)直腸癌的高風險致病因素之一，UC 患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風險是普通人群的2～3 倍[5-6]。目前，活動期UC 的治療方案旨在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和腸道炎癥以緩解癥狀，主要使用柳氮磺吡啶、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和其他生物制劑進行治療，但是療效有限、副作用明顯、復發(fā)率高或價格昂貴[7-10]。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的、更安全的和更有效的藥物。

銅是維持人體健康的重要微量元素，細胞內(nèi)銅濃度保持在一個相對較低的范圍內(nèi)，適度增加可引起細胞毒性，甚至導致細胞死亡[11-12]。銅死亡是一種由銅過量引發(fā)的新型細胞死亡方式，在這個過程中銅離子直接與線粒體呼吸中三羧酸循環(huán)中的脂肪?；M分結(jié)合，導致脂肪?；鞍拙奂丸F硫簇蛋白丟失，引起蛋白質(zhì)毒性應激，最終導致細胞死亡[13]。UC 患者中血清銅較正常人明顯升高[14]。銅代謝中含結(jié)構(gòu)域Murr1 蛋白（copper metabolism Murr1 domain，COMMD）1 是COMMD 蛋白家族中第1 個確定的成員，對銅穩(wěn)態(tài)起著重要的作用，COMMD1 的缺失會導致肝細胞銅累積[15-16]。COMMD1 的表達或功能降低可能與UC 的發(fā)病機制有關[17]。COMMD1 是核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的負性調(diào)節(jié)因子，在控制腸道炎癥和抑制結(jié)腸炎相關癌癥的進展方面具有重要作用[18]。多篇研究報道銅死亡在類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病等多種免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要的作用，UC 與這些疾病具有類似的發(fā)病機制[19-22]。目前尚缺乏活動期UC 中銅死亡相關的研究，本研究通過生物信息學方法探討活動期UC 中銅死亡相關基因的潛在調(diào)控機制和診斷生物標志物，并預測可以通過調(diào)節(jié)銅死亡治療活動期UC 的中藥，旨在為活動期UC 的診斷和個性化治療提供新思路。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和預處理

從GEO 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載活動期UC 的表達數(shù)據(jù)集（GSE11223、GSE87466、GSE87473 和GSE92415）。GSE11223 數(shù)據(jù)集中有132 個結(jié)腸樣本，包括63 例活動期UC 患者樣本和69 例健康受試者樣本（對照），作為訓練集。GSE87466 和GSE92415 數(shù)據(jù)集均有87 例活動期UC 患者樣本和21 例健康受試者樣本，GSE87473有106 例活動期UC 患者樣本和21 例健康受試者樣本，三者作為驗證集。使用“l(fā)imma” R 包對GSE11223、GSE87466、GSE87473 和GSE92415 數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)進行標準化處理，包括注釋和校正。從已發(fā)表的文獻中獲取與銅死亡相關的基因（cuproptosis-related genes，CRG），獲得了19 個基因[23-25]。技術路線流程如圖1 所示。

圖1 技術路線流程Fig.1 Technical route flow

1.2 銅死亡基因的表達分析

以P＜0.05 為篩選條件，運用“l(fā)imma” R 包和Wilcox 檢驗分析GSE11223 數(shù)據(jù)集中活動期UC 和對照組中差異表達的銅死亡相關基因（differentially expressed cuproptosis-related genes，DECRGs）。運用“pheatmap”和“ggpubr” R 包對結(jié)果進行可視化。為了解銅死亡基因調(diào)節(jié)因子之間的相關性，運用“corrplot”和“circlize” R 包對DECRGs 進行相關性分析并展示。

1.3 DECRGs 的免疫細胞浸潤分析

運用CIBERSORT 算法計算活動期UC 組和對照組中的免疫細胞浸潤程度，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學意義，應用“ggpubr” R 包構(gòu)建箱線圖。應用“l(fā)imma”和“corrplot” R 包分析DECRGs 和免疫細胞之間的相關性，并運用“ggplot2” R 包繪制相關性熱圖。

1.4 共識聚類

“ConsensusClusterPlus”軟件包用于計算無監(jiān)督聚類的數(shù)量及其穩(wěn)定性[26]。為了分析活動期UC 患者中與DECRGs 相關的潛在亞型，根據(jù)DECRGs 的表達量運用“ConsensusClusterPlus” R 包進行無監(jiān)督共識聚類分析，使用k-means 算法將63 個活動期UC 樣本分類為集群，k值定義為從1 到9 以生成不同的子類型。通過判斷不同k值下的共識聚類、矩陣累積分布函數(shù)（uniform clustering cumulative distribution function，CDF）曲線和一致性聚類得分，得到最可靠的聚類分析結(jié)果。使用主成分分析（principal component analysis，PCA）對分型的結(jié)果進行評估，使用R 包“ggpubr”比較不同亞型中DECRGs 的基因表達譜，P＜0.05 代表具有顯著性，運用R 包作圖進行可視化。

1.5 亞型間DECRGs 相關免疫浸潤分析和基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）

應用CIBERSORT 算法和“l(fā)imma”“reshape2”“ggpubr”等R 包對不同亞型進行免疫浸潤分析，比較不同亞型之間免疫細胞浸潤的差異，并以熱圖和箱型圖進行展示。

GSVA 是一種通過表達譜計算基因集富集的非參數(shù)、無監(jiān)督方法，用于識別各種樣本群體中生物過程和途徑之間的差異[27]。運用“GSVA”和“GSEABase” R 包進行GSVA 富集分析，以闡明不同亞型之間基因富集集的差異。從MSigDB 數(shù)據(jù)庫下載“c2.cp.kegg.v7.4.symbols”文件，運用“l(fā)imma”包比較不同亞型之間的GSVA 評分來識別基因差異表達的途徑，P＜0.05 作為判斷差異有統(tǒng)計學意義的標準。

1.6 加權基因共表達網(wǎng)絡分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）

基于DECRGs 分型后的基因表達文件，使用“WGCNA” R 包對活動期UC 疾病基因表達矩陣中波動最大的前25%的基因進行WGCNA，篩選分型后GSE11223 數(shù)據(jù)集的核心模塊和基因。使用pickSoftThreshold 函數(shù)獲得相鄰函數(shù)中加權參數(shù)的最佳值，并用作后續(xù)網(wǎng)絡構(gòu)建的軟閾值。隨后建立加權鄰接矩陣，并將其轉(zhuǎn)換為拓撲重疊矩陣（topological overlap matrix，TOM），并通過基于1-TOM 相異矩陣的分層聚類創(chuàng)建基因模塊，找出模塊間的相似性，將相關檢驗P值最小的模塊確定為活動性UC 分型基因的關鍵基因模塊。

1.7 機器學習模型的構(gòu)建和驗證

結(jié)合“caret”“randomForest”“kernlab”“ggplot2”和“xgboost” R 包構(gòu)建隨機森林（random forest，RF）、支持向量機（support vector machine，SVM）、極限梯度上升（eXtreme gradient boosting，XGB）模型和廣義線性模型（generalized linear models，GLM）4 種機器學習模型。提取了WGCNA 中核心基因的表達量，并用4 種模型對結(jié)果進行了預測。通過繪制殘差箱線圖、累積殘差分布圖和接收器工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線來評價模型的準確性，以確定最佳機器學習模型。對每個模型基因進行重要性評分，篩選重要性排名前5 的基因作為活動期UC 疾病的特征基因。

提取最佳機器學習模型中5 個疾病特征基因的表達量，使用“rms”和“rmda” R 包構(gòu)建列線圖對每個特征基因進行評分，最后基于綜合評分評估患者患病的概率。通過校準曲線評估預期概率和實際結(jié)果之間的一致程度，使用決策曲線評估列線圖的臨床實用性和優(yōu)勢。根據(jù)最佳機器學習模型中疾病特征基因的表達量，在GSE87466、GSE87473 和GSE92415 3 個數(shù)據(jù)集上進行驗證，繪制ROC 曲線驗證預測結(jié)果。

1.8 DECRGs 與疾病特征基因的相關性分析

運用“l(fā)imma”“corrplot”和“circlize” R 包分析疾病特征基因和DECRGs 之間的表達相關性。

1.9 中藥預測

將 DECRGs 和活動期 UC 特征基因輸入Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫（https://www.coremine.com/），以P＜0.05 為閾值檢索對應的中藥。將檢索到的中藥根據(jù)《中國藥典》2020 年版對中藥名稱進行規(guī)范化，未收錄的中藥不進行統(tǒng)計，再導入中醫(yī)傳承計算平臺（V3.5）中進行分析。

2 結(jié)果

2.1 活動期UC 銅死亡基因的表達分析

通過Wilcox 檢驗確定活動期UC 組中有11 個CRG 的表達與對照組中的表達差異顯著。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）在活動期UC 患者樣本中顯著上調(diào)，而核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-like-2，NFE2L2）、溶質(zhì)載體家族31 成員1（solute carrier family 31 member 1，SLC31A1）、鐵氧還蛋白1（ferredoxin 1，F(xiàn)DX1）、硫辛酸合成酶（lipoic acid synthase，LIAS）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD）、二氫硫辛酰轉(zhuǎn)乙?；福╠ihydrolipoyl acetyltransferase，DLAT）、丙酮酸脫氫酶E1 α1 亞基（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1）、谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）、二氫硫辛胺支鏈轉(zhuǎn)酰基酶E2（dihydrolipoamide branched chain transacylase E2，DBT）和甘氨酸裂解系統(tǒng)H 蛋白（glycine cleavage system protein H，GCSH）在活動期UC 患者樣本中顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖2-A、B）。隨后，對這些基因進行了相關性分析發(fā)現(xiàn)PDHA1與LIAS、DLAT，DBT與PDHA1，DLD與GCSH、DLAT、PDHA1、DBT，NFE2L2與PDHA1、DBT、DLD，F(xiàn)DX1與DLAT、PDHA1、SLC31A1、DBT、DLD、NFE2L2呈顯著的正相關（圖3）。NLRP3與其他基因呈負相關，其中與DBT負相關性最顯著。

圖2 活動期UC 中的DECRGsFig.2 DECRGs in active UC

圖3 DECRGs 間的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of DECRGs

2.2 免疫浸潤分析

為了研究活動期UC 的免疫微環(huán)境，使用CIBERSORT 算法評估活動期UC 組與對照組之間的免疫細胞浸潤水平（圖4-A）。與對照組相比，活動期UC 組激活的記憶性CD4+T 細胞（T cells CD4 memory activated）、靜息NK 細胞（NK cells resting）、M0 巨噬細胞（macrophages M0）、激活的肥大細胞（dendritic cells activated）和中性粒細胞（neutrophils）上調(diào)；靜息記憶性CD4+T 細胞（T cells CD4 memory resting）、激活的NK 細胞（NK cells activated）、M2巨噬細胞（macrophages M2）、激活的樹突狀細胞（dendritic cells activated）下調(diào)（圖4-B）。

圖4 DECRGs 免疫浸潤相關性分析Fig.4 Correlation analysis of immune infiltration in DECRGs

對免疫細胞與NLRP3、NFE2L2、SLC31A1、FDX1、LIAS、DLD、DLAT、PDHA1、GLS、DBT和GCSH進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)初始B 細胞（B cells naive）與LIAS，M1 巨噬細胞（macrophages M1）與DLD、GCSH，M2 巨噬細胞與GCSH，激活的肥大細胞、靜息NK 細胞與DLD，γδT 細胞（T cells gamma delta）與FDX1、GLS呈正相關；M0 巨噬細胞與DLAT、FDX1、LIAS，中性粒細胞與LIAS，激活的NK 細胞與DLD，漿細胞（plasma cells）與LIAS，靜息記憶性CD4+T 細胞與NLRP3呈負相關（P＜0.01）（圖4-C）。

2.3 共識聚類分析

根據(jù)DECRGs 的表達量對活動期UC 患者進行共識聚類分型，通過綜合分析共識聚類、CDF 曲線和一致性聚類得分的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，k＝2 時分類最佳（圖5-A、B、C、E）。因此，活動期UC 組的63 例患者被分為C1 和C2 2 個亞組。PCA 顯示C1 和C2樣本之間具有明顯的差異，分類效果較好（圖5-D）。圖5-F 顯示了活動期UC 組中2 種亞型中DECRGs表達水平的熱圖。在C1 和C2 之間觀察到不同的CRG 表達譜，NFE2L2、SLC31A1、FDX1、LIAS、DLD、DLAT、PDHA1、GLS、DBT和GCSH在C1中的表達高于C2，NLRP3在C2 中的表達高于C1（圖5-G）。

圖5 共識聚類分型情況Fig.5 Consensus clustering classification

2.4 亞型間DECRGs 相關免疫浸潤和GSVA 分析

22 種免疫細胞在不同亞組之間的相對百分比見圖6-A。與C1 相比，C2 中M0 巨噬細胞數(shù)量更高（圖6-B）。GSVA 用于評估不同亞組之間的生物學功能差異，高親和性免疫球蛋白E 受體（highaffinity immunoglobulin E receptor，F(xiàn)cεRI）信號通路、趨化因子信號通路、T 細胞受體信號通路等通路在C1 亞組中上調(diào)。此外，丁酸代謝、萜類骨架的生物合成、脂肪酸代謝和組氨酸代謝等途徑在C2 亞組中上調(diào)（圖6-C）。

圖6 亞型間DECRGs 相關免疫浸潤分析和GSVA 分析Fig.6 Analysis of DECRGs related immune infiltration and GSVA among subtypes

2.5 WGCNA

應用WGCNA 算法根據(jù)活動期UC 分型基因建立加權基因共表達網(wǎng)絡，以識別與DECRGs 聚類密切相關的關鍵基因模塊。共有9 個重要的共表達模塊，藍色模塊與C1 呈最強的正相關（相關系數(shù)r＝0.85，P＝ 2×10?18），與C2 呈最強的負相關（r＝0.85，P＝ 2×10?18），見圖7。以“geneSig Filter＝0.5，moduleSig Filter＝0.8”為條件，經(jīng)Wilcox 檢驗且P＜0.05 表示有統(tǒng)計學意義，從藍色模塊篩選出234 個核心基因。

圖7 分型WGCNA 確定活動期UC 相關模塊和核心基因Fig.7 WGCNA of genotyping to determine active UC related modules and core genes

2.6 機器學習模型的構(gòu)建

為了進一步識別具有高診斷價值的關鍵標志物，基于藍色模塊234 個核心基因，建立了4 個機器學習模型進行訓練。從殘差箱線圖可以看出GLM、XGB和SVM 的殘差在0～0.125，RF 的殘差在0.125～0.250（圖8-A）。從累積殘差分布圖得出的結(jié)論與上述結(jié)果一致（圖8-B）。ROC 曲線中XGB 模型的曲線下面積為0.911（圖8-C），大于GLM、RF 和SVM，故XGB 模型是最佳機器學習模型。中胚層特異性轉(zhuǎn)錄基因（mesoderm-specific transcript，MEST）、跨膜蛋白98（transmembrane protein 98，TMEM98）、晶狀體蛋白λ1（crystallin lambda 1，CRYL1）、染色體14開放閱讀框（chromosome 14 open reading frame 147，C14orf147）和跨膜蛋白141（transmembrane protein 141，TMEM141）是XGB 模型中重要性得分最高的前5 位基因（圖8-D）。

圖8 活動期UC 機器學習模型的構(gòu)建Fig.8 Construction of active UC machine learning model

2.7 機器學習模型的驗證

選擇XGB 模型重要性得分最高的前5 位基因作為疾病特征基因，并構(gòu)建列線圖以預測活動期UC 的發(fā)病風險（圖9-A）。校準曲線顯示實線和虛線在圖中彼此很接近，表明模型預測能力較好（圖9-B）。決策曲線紅線表示的模型遠離全部（all）曲線，再次表明模型效果較好（圖9-C）。以3 個驗證數(shù)據(jù)集GSE87466、GSE87473 和GSE92415 從外部來驗證模型的預測能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型的準確率可以達到91.7%、95.7%和94.9%（圖9-D～F）。

圖9 活動期UC 機器學習模型的驗證Fig.9 Verification of machine learning model of active UC

2.8 DECRGs 與疾病特征基因的相關性分析

相關性分析顯示，NLRP3與疾病特征基因存在著較強的負相關性，其他DECRGs 中的1個或者多個基因與5 個疾病特征基因有較強的正相關性，它們之間可能存在著相互調(diào)控作用，見圖10。

圖10 DECRGs 與5 個疾病特征基因間的相關性分析Fig.10 Correlation analysis between DECRGs and five disease characteristic genes

2.9 中藥預測結(jié)果

共篩選出338 味中藥，其中《中國藥典》2020年版收錄206 味藥，根據(jù)中醫(yī)傳承計算平臺（V3.5）對這206 味藥進行出現(xiàn)頻次統(tǒng)計、四氣五味、歸經(jīng)統(tǒng)計，根據(jù)第10 版《中藥學》進行功效類別統(tǒng)計。白術、丹參、莪術、紫草、桑葉、青風藤、桑枝均出現(xiàn)在3 個銅死亡基因中，可見其在調(diào)節(jié)銅死亡治療活動期UC 中發(fā)揮著重要的作用。四氣以溫、寒和平為主，五味以苦、甘、辛為主，主歸肝、脾經(jīng)，肺經(jīng)和胃經(jīng)次之（圖11）。中藥功效以清熱類、補虛類和活血化瘀類為主，清熱類中以清熱解毒藥和清熱燥濕最多（表1）。

表1 中藥功效分類統(tǒng)計Table 1 Classified statistics of efficacy of traditional Chinese medicines

圖11 中藥的四氣、五味和歸經(jīng)統(tǒng)計Fig.11 Statistics of four qi, five flavor and meridian tropism of traditional Chinese medicines

3 討論

UC 是一種炎癥性腸病，近年來UC 的發(fā)病率和患病率逐漸上升，給我國的醫(yī)療系統(tǒng)帶來了重大的負擔和挑戰(zhàn)[28-29]。然而，UC 確切的機制尚不清楚，多種因素參與了UC 的發(fā)病機制，包括免疫反應紊亂、腸屏障損傷、遺傳易感性、腸道生態(tài)失調(diào)和環(huán)境應激[30-31]。UC 不易治愈，復發(fā)率高，與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關，雖然有許多藥物可用于抑制結(jié)腸炎，但常規(guī)治療具有一定的局限性和嚴重的不良反應[32]。銅死亡參與多種免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生和進展[33-34]，然而，目前尚缺乏銅死亡在活動期UC 中的研究。

本研究通過比較CRG 在活動期UC 組和對照組結(jié)腸中的表達，發(fā)現(xiàn)與正常人群相比，有11 個CRGs 在活動期UC 結(jié)腸中的表達異常，活動期UC患者的NLRP3顯著上調(diào)，其他的DECRGs 均下調(diào)，表明DECRGs 在活動期UC 的發(fā)展中起重要作用?；顒悠赨C 患者和小鼠模型中均檢測到NLRP3 水平升高[35-36]。Zhang 等[37]通過對56 例UC 患者和274 例對照組進行基因分型發(fā)現(xiàn)rs10754558 和rs10925019 在中國漢族人群中與UC 的易感性顯著相關，這表明NLRP3可能在UC 的發(fā)病機制中起重要作用。通過對這些基因進行了相關性分析發(fā)現(xiàn)活動期UC 中DECRGs 之間存在著顯著的相關性，NLRP3與其他DECRGs 均呈負相關，其中與DBT負相關性最顯著。活動期UC 和對照組之間的免疫細胞浸潤結(jié)果顯示，活動期UC 患者中激活的記憶性CD4+T 細胞、靜息NK 細胞、M0 巨噬細胞、激活的肥大細胞和中性粒細胞上調(diào)，與以往研究結(jié)果一致[38-43]。同時，DECRGs 與免疫浸潤細胞的相關性分析顯示M1 巨噬細胞與DLD、GCSH呈正相關，M0 巨噬細胞與DLAT、FDX1、LIAS呈顯著的負相關，這些結(jié)果表明DECRGs 可能與活動期UC 進展和免疫浸潤有關。

此外，基于DECRGs 使用無監(jiān)督聚類分析將63例活動期UC 患者分為2 個亞型，以更好地了解CRG 的表達模式。在不同的亞型中DECRGs 的表達存在差異，其中在C2 亞型中NLRP3的表達高于C1 亞型，其他DECRGs 的表達均低于C1 亞型。NLRP3 是核苷酸結(jié)合域樣受體家族的一員，被激活后與凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和效應分子半胱氨酸蛋白酶-1 前體（pro-caspase-1）組成NLRP3 炎性小體[44]。NLRP3 炎癥小體是炎癥反應系統(tǒng)的重要組成部分和腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，其異常激活后通過釋放炎性細胞因子、損傷腸上皮細胞、破壞腸黏膜屏障，誘導參與UC 的發(fā)生發(fā)展的炎癥級聯(lián)反應[45-46]。NFE2L2 是一種重要的傳感器蛋白，可能通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子和誘導II期解毒酶在預防UC 方面發(fā)揮潛在的重要作用[47]。FDX1 是銅離子載體誘導細胞死亡的關鍵調(diào)節(jié)因子，也是細胞蛋白脂?；纳嫌握{(diào)節(jié)因子，通過結(jié)合LIAS 促進其與脂酰載體蛋白GCSH 的功能性結(jié)合來直接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)脂?；痆48]。FDX1 表達與腫瘤細胞靜止和炎癥呈正相關，與腫瘤侵襲呈負相關，F(xiàn)DX1 的高表達在抑制結(jié)腸腫瘤中起著至關重要的作用[49]。PDHA1 是葡萄糖代謝過程中必不可少的成分，其失活被認為與腫瘤中的代謝重編程和乳酸過量產(chǎn)生有關[50]。NLRP3 炎癥小體的激活需要乳酸發(fā)酵[51]。不同亞型的免疫學分析顯示C2 亞型中M0巨噬細胞數(shù)量更高。在不同誘導因子的作用下，巨噬細胞可分為M1 和M2 極化型，在UC 患者中巨噬細胞極化表型以M1 型為主，誘導局部炎癥反應，加重腸道炎癥和黏膜屏障損傷[52]?？梢姡珻2 亞型可能比C1 亞型的預后更差。GSVA 分析表明，C1 亞型在FcεRI 信號通路、趨化因子信號通路、T 細胞受體信號通路等通路中富集。C2 亞型在丁酸代謝、萜類骨架的生物合成、脂肪酸代謝和組氨酸代謝等途徑中顯著富集。

近年來，WGCNA 算法和機器學習模型越來越多地用于UC 相關基因的篩選和疾病患病率的預測[53-56]，但均未涉及到活動期UC。本研究運用WGCNA 篩選出234 個與DECRGs 聚類密切相關的核心基因，通過4 種機器學習發(fā)現(xiàn)，XGB 模型是最佳機器學習模型，MEST、TMEM98、CRYL1、C14orf147和TMEM141是活動期UC 的特征基因。然后，構(gòu)建了列線圖模型，使用MEST、TMEM98、CRYL1、C14orf147和TMEM141診斷活動期UC，GSE87466、GSE87473 和GSE92415 數(shù)據(jù)集用于評價5 個基因的預測效能，ROC 結(jié)果表明該模型具有良好的預測性能和一定的臨床應用價值，可作為活動期UC 的診斷生物標志物。

通過預測疾病特征基因和DECRGs 的中藥，總結(jié)發(fā)現(xiàn)調(diào)控DECRGs 治療活動期UC 的中藥功效以清熱類、補虛類、活血化瘀類為主，清熱類中以清熱解毒藥和清熱燥濕藥最多，體現(xiàn)了活動期UC 以脾胃虛弱為本，濕熱毒瘀蘊結(jié)為標，與活動期UC常見的大腸濕熱、熱毒熾盛等證型相符[57-59]。四氣以溫、寒和平為主，五味以苦、甘、辛為主，甘溫健脾能補益脾胃，苦寒燥濕能清脾胃、大腸濕熱，辛能散能行，可調(diào)氣行血以通腸腑。歸經(jīng)方面主歸肝、脾、肺、胃經(jīng)，與疾病的歸經(jīng)基本相同[60]，體現(xiàn)了微觀銅死亡基因調(diào)節(jié)活動期UC 層面與宏觀整體調(diào)節(jié)層面的方向相符。頻次統(tǒng)計顯示白術、丹參、莪術、紫草、桑葉、青風藤、桑枝在銅死亡基因預測中出現(xiàn)的頻次最高，可見它們在其中發(fā)揮著重要的作用。白術多糖和揮發(fā)油可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和宿主代謝來治療UC[61-63]。丹參提取物能夠通過抑制Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路改善UC 的炎癥[64]。莪術提取物中的姜黃素可以通過抑制炎癥介質(zhì)和細胞因子、清除氧自由基等過程發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用治療UC[65]。紫草素及其衍生物通過抑制NLRP3 炎癥小體和NF-κB 信號通路的激活，減輕結(jié)腸上皮緊密連接的破壞，從而改善UC 的炎癥和黏膜屏障損傷[66]。

綜上所述，本研究通過生物信息學揭示了銅死亡相關基因在活動期UC 中的表達模式。通過機器學習，確定了MEST、TMEM98、CRYL1、C14orf147和TMEM141是參與活動期UC 發(fā)病機制的核心基因，可作為活動期UC 的診斷生物標志物。本研究還建立了1 個預測模型，可以準確評估活動期UC的患病風險。本研究系統(tǒng)地評估了活動期UC 與銅死亡之間的關系，并預測了能夠調(diào)節(jié)銅死亡治療活動期UC 的中藥，這不僅有助于提高對活動期UC銅死亡的認識，也有利于活動期UC 的診斷和治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突