基于UPLC-Q-Exactive Plus-Orbitrap MS 的丹參提取物成分表征及其抗血栓作用譜效相關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)解析

劉 悅 ，丁曉彥，王 娜，高 燕，楊龍飛，呂 婧，韓利文，傅春升，趙渤年*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥物研究院，黃河流域特色中藥生態(tài)保護(hù)和高質(zhì)量發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心 山東 濟(jì)南 250355

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250014

3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014

4.山東現(xiàn)代學(xué)院，山東 濟(jì)南 250104

5.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），藥學(xué)院（藥物研究所），山東 濟(jì)南 250024

6.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

血栓是引起缺血性疾病的主要原因，中醫(yī)認(rèn)為，血栓的形成與患者氣血運(yùn)行不暢、氣滯血瘀有關(guān)，因此，中醫(yī)臨床常用活血化瘀類(lèi)中藥治療血栓性疾病[1-2]，代表藥味有丹參、三七、川芎、桃仁、紅花、赤芍等。該類(lèi)藥物不僅可以抑制血小板活化和炎癥反應(yīng)，還可以改善纖溶系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)等，通過(guò)多種途徑共同發(fā)揮抗血栓作用[3]。

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根或根莖，為中醫(yī)活血化瘀的要藥，主要成分包括脂溶性的丹參酮I、丹參酮IIA、水溶性的丹酚酸類(lèi)與多酚酸類(lèi)等，具有抗血小板聚集、抑制黏附因子表達(dá)、抗氧化、抗癌等作用[4]。關(guān)于丹參抗血小板聚集作用的研究早在1982 年就有報(bào)道，不少臨床資料也證實(shí)丹參制劑對(duì)血栓性疾病有較好的療效[5-7]。故本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道阱-高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）建立丹參指紋圖譜，采用花生四烯酸誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)血栓模型，對(duì)不同產(chǎn)地丹參的抗血栓作用進(jìn)行考察，并運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法將指紋圖譜化學(xué)信息與藥效學(xué)信息進(jìn)行相關(guān)性研究，以期表征丹參的抗血栓效應(yīng)組分，為丹參抗血栓作用譜-效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，為丹參臨床治療血栓性疾病提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Hypersil GOLD 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；SB4200DTS 型超聲波雙頻清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BP211D 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；KDM 型可調(diào)控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；FDY1002-UV-P 型低有機(jī)物型超純水機(jī)（青島富勒姆科技有限公司）；DLSC05 型微型渦旋混懸儀（北京東陵昌盛生物科技公司）；IX83＋DP8 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；6 孔板（美國(guó)Corning 公司）；KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZSA0745 型連續(xù)變倍體式顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；Research plus 移液槍?zhuān)◤試?guó)Eppendorf 公司）；HPG-280BX 型恒溫光照培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)（五層單排，上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

乙腈（批號(hào)219087）、甲酸（批號(hào)193497）購(gòu)自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；對(duì)照品隱丹參酮（批號(hào)110852-201807）、丹參酮I（批號(hào)110867-201607）、丹參酮IIA（批號(hào)110766-202022）、丹參素（批號(hào)110855-201915）、丹酚酸B（批號(hào)111562-201716）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%；對(duì)照品丹酚酸A（批號(hào)Z23D10X106625）、原兒茶醛（批號(hào)TO1013FB14）、迷迭香酸（批號(hào)Y16A9K67403）和紫草酸（批號(hào)Y04J10H75487）由上海源葉生物科技有限公司提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%；二氫丹參酮I對(duì)照品（批號(hào)PRF7033101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；牛蒡子苷對(duì)照品（批號(hào)PRF7033101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；花生四烯酸（arachidonic acid，AA，批號(hào)D1827021）購(gòu)自上海Aladdin 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)39075）購(gòu)自上海Sangon 生物科技公司；玲聯(lián)茴香胺（批號(hào)MKCC7501）、阿司匹林（批號(hào)MKCD0957）購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；4%多聚甲醛（批號(hào)B35F001200）購(gòu)自武漢Servicebio 公司。

1.3 動(dòng)物

成年AB 系斑馬魚(yú)（山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供）培養(yǎng)于專(zhuān)業(yè)的養(yǎng)殖系統(tǒng)，保持恒溫（28.0±0.5）℃，14 h/10 h 光/暗循環(huán)。每天分別于9: 00 和16: 00 時(shí)投喂豐年蝦。需要用卵時(shí)，把成年雄雌斑馬魚(yú)按2∶1 的比例放在交配缸中分隔板的兩邊；次日早晨抽去隔板，斑馬魚(yú)受光照刺激自然交配產(chǎn)卵。在產(chǎn)卵后30 min 內(nèi)收集胚胎。收集的胚胎移入裝有養(yǎng)魚(yú)水（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4）的培養(yǎng)皿中，28.5 ℃培養(yǎng)72 h，備用。

1.4 藥材

不同產(chǎn)地60 批丹參飲片（表1）購(gòu)自安徽亳州中藥材交易中心，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院丁曉彥副研究員鑒定，均為丹參S.miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。粉碎過(guò)40 目篩，備用。

表1 丹參樣品信息Table 1 Information of S.miltiorrhiza samples

2 方法

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，90%～85% B；5～10 min，85%～80% B；10～23 min，80%～75% B；23～26 min，75%～40% B；26～36 min，40% B；36～40 min，40%～5% B；40～41 min，5%～90% B。體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；進(jìn)樣量6 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electric spray ion source，ESI），正、負(fù)離子檢測(cè)模式；掃描范圍m/z100～1 500；鞘氣體積流量1 132.67 L/h；輔助氣體積流量283.17 L/h；毛細(xì)管溫度350 ℃；輔助氣溫度320 ℃；噴霧電壓為＋3.50 kV（正離子模式）和?3.00 kV（負(fù)離子模式）；掃描模式為FullMs/dd-Ms2，F(xiàn)ullMs 分辨率70 000，dd-Ms2分辨率17 500。

2.1.3 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱(chēng)定原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B、咖啡酸、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA、二氫丹參酮I 對(duì)照品適量，加甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為1.200、1.730、1.450、1.260、1.150、0.950、0.020 4、0.108、0.100、1.200 mg/mL 的對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)定丹參素鈉對(duì)照品適量，加50%甲醇制備成質(zhì)量濃度為422.5 μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)定牛蒡子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為51.5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備

（1）凍干粉I 的制備：精密稱(chēng)定丹參粉末3 g，置圓底燒瓶中，加95%乙醇120 mL，回流提取1 h，放至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，制成凍干粉I，余濾液另器留存，殘?jiān)栏蓚溆谩?/p>

（2）凍干粉II 的制備：取“2.1.4（1）”項(xiàng)下的殘?jiān)?，置圓底燒瓶中，加50%乙醇90 mL，回流提取1.5 h，放至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液7.5 mL，制成凍干粉II，余濾液另器留存，殘?jiān)栏蓚溆谩?/p>

（3）凍干粉III 的制備：取“2.1.4（2）”項(xiàng)下的殘?jiān)?，置圓底燒瓶中，加水120 mL，回流提取0.5 h，放至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，制成凍干粉III，余濾液另器留存。

（4）UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 檢測(cè)用供試品溶液的制備：凍干粉I 用甲醇轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，定容、混勻得溶液a；凍干粉II 以50%甲醇為溶劑，同法操作得溶液b；凍干粉III 以水為溶劑，同法操作得溶液c；取a、b、c 3 種溶液等體積混合均勻后，與內(nèi)標(biāo)溶液等體積混勻，10 000 r/min 離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后作為供試品溶液。

（5）藥效實(shí)驗(yàn)用樣品溶液的制備：分別取“2.1.4（1）（2）（3）”項(xiàng)下的余濾液30、22.5、30 mL 合并凍干；用5 mL DMSO 將凍干粉轉(zhuǎn)移至EP 管中，加養(yǎng)魚(yú)水20 mL，超聲處理3 min，配成30 mg/mL 的母液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；藥效試?yàn)前用養(yǎng)魚(yú)水稀釋為所需質(zhì)量濃度。

2.1.5 方法學(xué)考察

（1）精密度考察：取丹參樣品（批號(hào)200601），按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下分析條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，采集圖譜并處理，計(jì)算各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD 值。

（2）重復(fù)性考察：取同一批丹參樣品，按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按照“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下分析條件，分別測(cè)定，采集圖譜并處理，計(jì)算各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD 值。

（3）穩(wěn)定性考察：取同一批丹參樣品，按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下分析條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，采集圖譜并處理，計(jì)算各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD 值。

2.1.6 指紋圖譜的建立 取60 批丹參樣品，按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。選取峰純度較高、分離較好的色譜峰為共有峰。根據(jù)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)Pubchem Compound 以及丹參化學(xué)成分、質(zhì)譜研究相關(guān)文獻(xiàn)，收集丹參中各種化學(xué)成分信息，導(dǎo)入Xcalibur 軟件，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量誤差＜1×10?5，并結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片信息、保留時(shí)間、對(duì)照品的信息以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，對(duì)共有峰進(jìn)行定性、相對(duì)定量分析。

2.2 丹參抗血栓藥效學(xué)研究

2.2.1 AA 對(duì)斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積的影響選用受精后72 h（72 h post fertilization，72 hpf）的AB 系斑馬魚(yú)，脫膜后在熒光顯微鏡下篩選發(fā)育正常的幼魚(yú)于6 孔板中，設(shè)置對(duì)照組（0.1% DMSO）、模型組（AA 質(zhì)量濃度分別為20、24、28 μg/mL），每組1 孔，每孔15 條斑馬魚(yú)，給藥后放入28.5 ℃的恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h[8]造成血栓，之后用玲聯(lián)茴香胺染液避光染色15 min，移除染色液，用養(yǎng)魚(yú)水清洗2 次，4%多聚甲醛于4 ℃固定過(guò)夜。每組隨機(jī)選取8 條斑馬魚(yú)在熒光顯微鏡下采集圖像，利用Image Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積，GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，各組結(jié)果均以±s表示，以確定最佳建模濃度。

2.2.2 不同質(zhì)量濃度丹參提取物對(duì)斑馬魚(yú)尾靜脈血栓的影響 取72 hpf AB 系斑馬魚(yú)于培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)于6 孔板中，每孔15 條。設(shè)置對(duì)照組（0.1% DMSO）、模型組（0.1%DMSO 培養(yǎng)6 h 后加入24 μg/mL AA）、陽(yáng)性對(duì)照組（25 μg/mL 阿司匹林培養(yǎng)6 h 后加入24 μg/mL AA）和丹參給藥組（分別給予50、100、150 μg/mL 的丹參提取物預(yù)處理6 h 后加入24 μg/mL AA），置28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，之后用玲聯(lián)茴香胺染液避光染色15 min，移除染色液，用養(yǎng)魚(yú)水清洗2 次，4%多聚甲醛于4 ℃固定過(guò)夜。每組隨機(jī)選取8 條斑馬魚(yú)拍攝心臟和尾部位，利用Image Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量心臟紅細(xì)胞染色面積，GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.3 60 批不同產(chǎn)地丹參提取物抗血栓藥效學(xué)研究 設(shè)置空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和60 批丹參提取物組（質(zhì)量濃度均為150 μg/mL），各組均按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理。

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

將不同產(chǎn)地丹參提取物指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中進(jìn)行層次聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘-判別分析（ orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）。

2.4 譜效關(guān)系研究

采用在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)SPSSPRO，以不同產(chǎn)地丹參提取物共有峰相對(duì)峰面積為自變量（X），斑馬魚(yú)心臟相對(duì)紅細(xì)胞染色面積為因變量（Y），進(jìn)行偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

在重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性考察中，以牛蒡子苷為參照峰，各共有峰的相對(duì)峰面積值RSD 為0.16%～4.99%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.02%～2.45%，說(shuō)明該法重復(fù)性良好，儀器的精密度良好，樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，可用于建立丹參提取物的指紋圖譜。

3.2 指紋圖譜解析

3.2.1 指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果 丹參提取物總離子流圖見(jiàn)圖1，根據(jù)總離子流圖中的保留時(shí)間，把一級(jí)質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子峰及二級(jí)質(zhì)譜提供的碎片離子信息與對(duì)照品及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[9-19]比對(duì)，共識(shí)別39 個(gè)化合物，見(jiàn)表2。以牛蒡子苷為內(nèi)標(biāo)峰（峰40），計(jì)算39 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積值。

圖1 正 (A)、負(fù) (B) 離子模式下丹參提取物總離子流圖Fig.1 Total ion flow chromatograms of S.miltiorrhiza extracts in positive (A) and negative (B) modes

表2 丹參提取物指紋圖譜共有峰解析結(jié)果Table 2 Results of common peak analysis in fingerprint of S.miltiorrhiza extracts

3.2.2 HCA 結(jié)果 將39 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積值作為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 數(shù)據(jù)分析軟件，采用HCA，60 批丹樣品聚為2 類(lèi)（距離＝100，除去異常點(diǎn)），山西、河北、安徽、江蘇產(chǎn)地的聚為一類(lèi)，山東、四川的聚為一類(lèi)（圖2）。

圖2 60 批丹參樣品的HCA 結(jié)果圖Fig.2 HCA result graph of 60 batches of S.miltiorrhiza samples

圖3 丹參樣品OPLS-DA 模型圖Fig.3 OPLS-DA of S.miltiorrhiza samples

3.2.3 OPLS-DA 結(jié)果 為分析引起不同產(chǎn)地丹參樣品差異的色譜峰，對(duì)安徽、江蘇、河北、山東、山西和四川6 個(gè)產(chǎn)地的丹參樣品進(jìn)行OPLS-DA。OPLS-DA 模型可以使樣本之間的差異最大化，以確定樣本之間的差異成分[17]。由圖3-A 可見(jiàn)，剔除異常值后安徽、河北、江蘇和山西產(chǎn)地的丹參（A 組）分布在圖的右側(cè)，山東、四川產(chǎn)地（B 組）的丹參分布在左側(cè)，表明A 組和B 組產(chǎn)地的丹參化學(xué)成分存在一定的差異，與聚類(lèi)分析結(jié)果相一致。變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）較大的成分即VIP 值＞1 的變量，通常與樣本分類(lèi)更相關(guān)。所有成分的VIP 值見(jiàn)圖3-B，VIP 值大于1 的變量有15 個(gè)，分別為峰9（15,16-二氫丹參二醇B）、峰18（4-甲基丹酚酸酯B 或異構(gòu)體）、峰8（迷迭香酸）、峰15（丹酚酸B 同分異構(gòu)體）、峰17（丹酚酸B）、峰14（丹酚酸A 異構(gòu)體）、峰16（丹酚酸A）、峰4（丹參素）、峰3（咖啡酸）、峰2（L-苯丙氨酸）、峰7（saprionide）、峰6（丹酚酸F）、峰38（丹參酮IIA）、峰13（丹參酚醌I(xiàn) 及其同分異構(gòu)體）和峰5（原兒茶醛），它們是區(qū)分A 組和B 組最為相關(guān)的變量，可初步推測(cè)為引起2 組丹參樣品差異的物質(zhì)。

3.3 丹參提取物抗血栓藥效學(xué)研究

3.3.1 AA 對(duì)斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積的影響由圖4 可知，與對(duì)照組比較，不同質(zhì)量濃度的AA處理后斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積均顯著減?。≒＜0.001），故本實(shí)驗(yàn)選取24 μg/mL AA 作為建模條件。

圖4 AA 對(duì)斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積的影響 (±s, n = 8)Fig.4 Effect of AA on staining area of red blood cells of zebrafish hearts (±s , n = 8)

3.3.2 不同質(zhì)量濃度丹參提取物對(duì)斑馬魚(yú)尾靜脈血栓的影響 由圖5 可知，AA 可導(dǎo)致斑馬魚(yú)尾部血栓形成，表現(xiàn)為與對(duì)照組比較，AA 處理后心臟紅細(xì)胞染色面積顯著減小（P＜0.001）；陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林干預(yù)后，心臟紅細(xì)胞染色面積顯著增大（P＜0.001），尾部靜脈血栓明顯改善，表明阿司匹林對(duì)于AA 誘導(dǎo)的血栓具有改善作用；丹參提取物（50、100、150 μg/mL）組心臟紅細(xì)胞染色面積與模型組相比均顯著增大（P＜0.05），且150 μg/mL 丹參提取物對(duì)尾靜脈血栓的改善作用最佳，故選擇150 μg/mL 丹參提取物進(jìn)行后續(xù)的抗血栓作用實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同質(zhì)量濃度丹參提取物對(duì)斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積的影響 (±s, n = 8)Fig.5 Effects of different concentrations of S.miltiorrhiza extracts on staining area of red blood cells of zebrafish hearts(±s , n = 8)

3.3.3 60 批丹參提取物的抗血栓藥效學(xué)研究 如表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積明顯減小（P＜0.001），表明建模成功；與模型組比較，阿司匹林組和60 批丹參提取物組斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色面積顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），均表現(xiàn)出不同程度的抑制斑馬魚(yú)尾靜脈血栓形成的作用。丹參提取物由于產(chǎn)地及批次不同，抑制斑馬魚(yú)尾靜脈血栓形成的作用不同，各產(chǎn)地10 批丹參平均相對(duì)紅細(xì)胞染色面積排序?yàn)樯綎|＞江蘇＞山西＞安徽＞河北＞四川（圖6），相對(duì)紅細(xì)胞染色面積越大表明抗尾靜脈血栓形成的能力越強(qiáng)。OPLSDA 發(fā)現(xiàn)山東四川產(chǎn)地的丹參化學(xué)成分差異較小，但藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)2 產(chǎn)地丹參抗血栓作用存在顯著性差異（P＜0.001），由此可見(jiàn)OPLS-DA 僅能分析不同產(chǎn)地丹參樣品的成分信息，若要評(píng)價(jià)丹參的抗血栓效果，須將成分信息與藥效指標(biāo)相結(jié)合。

圖6 不同產(chǎn)地丹參對(duì)斑馬魚(yú)心臟相對(duì)紅細(xì)胞染色面積的影響 (±s, n = 8)Fig.6 Effects of S.miltiorrhiza from different origins on relative staining area of red blood cell of zebrafish hearts(±s, n = 8)

表3 60 批丹參提取物的抗血栓作用 (±s, n = 8)Table 3 Antithrombotic activity of 60 batches of S.miltiorrhiza extracts (±s , n = 8)

表3 60 批丹參提取物的抗血栓作用 (±s, n = 8)Table 3 Antithrombotic activity of 60 batches of S.miltiorrhiza extracts (±s , n = 8)

與對(duì)照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001。###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group.

組別 藥材編號(hào)心臟紅細(xì)胞染色面積/μm2相對(duì)心臟紅細(xì)胞染色面積 組別 藥材編號(hào)心臟紅細(xì)胞染色面積/μm2相對(duì)心臟紅細(xì)胞染色面積對(duì)照 — 4 338.88±87.34 1.000 0 丹參提取物 JS-9 3 014.57±201.61*** 0.694 8模型 — 717.10±39.96### 0.165 3 SD-0 3 549.07±187.12*** 0.818 0阿司匹林 — 3 306.85±172.30*** 0.762 1 SD-1 3 828.32±314.54*** 0.882 3丹參提取物 AH-0 2 710.79±119.92*** 0.624 8 SD-2 3 639.63±177.87*** 0.838 8 AH-1 2 940.07±179.98*** 0.677 6 SD-3 3 256.00±129.43*** 0.750 4 AH-2 2 784.14±212.85*** 0.641 7 SD-4 3 392.38±195.74*** 0.781 9 AH-3 3 339.16±158.65*** 0.769 6 SD-5 3 727.68±170.17*** 0.859 1 AH-4 2 828.29±172.20*** 0.651 8 SD-6 3 106.85±190.25*** 0.716 0 AH-5 2 775.94±145.75*** 0.639 8 SD-7 3 517.59±212.81*** 0.810 7 AH-6 3 009.59±381.51*** 0.693 6 SD-8 3 420.88±185.40*** 0.788 4 AH-7 2 969.93±293.77*** 0.684 5 SD-9 3 517.62±96.50*** 0.810 7 AH-8 3 106.43±175.71*** 0.716 0 SX-0 3 047.15±245.61*** 0.702 3 AH-9 3 038.36±121.45*** 0.700 3 SX-1 2 851.14±204.25*** 0.657 1 HB-0 1 377.56±92.51* 0.317 5 SX-2 3 645.60±249.24*** 0.840 2 HB-1 1 642.74±125.77* 0.378 6 SX-3 3 070.68±207.62*** 0.707 7 HB-2 1 968.66±166.84*** 0.453 7 SX-4 3 128.37±265.48*** 0.721 0 HB-3 2 452.30±42.80*** 0.565 2 SX-5 2 997.77±163.36*** 0.690 9 HB-4 1 746.36±73.57** 0.402 5 SX-6 3 298.86±180.13*** 0.760 3 HB-5 1 627.55±71.58* 0.375 1 SX-7 2 646.34±131.61*** 0.609 9 HB-6 1 660.55±146.28* 0.382 7 SX-8 2 968.64±208.73*** 0.684 2 HB-7 2 796.96±166.09*** 0.644 6 SX-9 3 330.19±137.65*** 0.767 5 HB-8 1 703.48±102.88** 0.392 6 SC-0 1 791.65±103.90** 0.412 9 HB-9 2 265.96±69.39*** 0.522 2 SC-1 1 889.98±97.99*** 0.435 6 JS-0 3 288.80±211.57*** 0.758 0 SC-2 1 646.60±48.18* 0.379 5 JS-1 3 314.98±219.50*** 0.764 0 SC-3 1 930.13±104.80*** 0.444 8 JS-2 3 191.34±217.94*** 0.735 5 SC-4 1 868.08±38.43*** 0.430 5 JS-3 2 685.77±260.61*** 0.619 0 SC-5 1 691.94±62.10** 0.389 9 JS-4 2 712.32±251.85*** 0.625 1 SC-6 1 971.07±140.27*** 0.454 3 JS-5 3 501.32±200.67*** 0.807 0 SC-7 1 750.99±62.31** 0.403 6 JS-6 3 291.41±178.45*** 0.758 6 SC-8 1 653.62±56.56* 0.381 1 JS-7 3 538.82±422.36*** 0.815 6 SC-9 1 865.83±91.92*** 0.430 0 JS-8 3 285.78±273.40*** 0.757 3

3.4 PLSR 分析結(jié)果

中藥指紋圖譜與藥效的譜效關(guān)系需要通過(guò)一定的數(shù)據(jù)處理才能實(shí)現(xiàn)，故選擇適合的數(shù)據(jù)處理方法至關(guān)重要。PLSR 集相關(guān)分析、主成分分析、多元回歸分析優(yōu)勢(shì)于一體，具有無(wú)須剔除樣本、預(yù)測(cè)精度高、計(jì)算量小等特點(diǎn)，已逐漸成為中藥譜效關(guān)系構(gòu)建的主要數(shù)據(jù)處理方法[20-22]。本研究利用SPSSPRO在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析軟件，把丹參指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積作為自變量，斑馬魚(yú)相對(duì)心臟紅細(xì)胞染色面積作為因變量，進(jìn)行PLSR 分析。根據(jù)PLSR 原理，VIP 值越大表示其對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng)。由分析結(jié)果可知，當(dāng)主成分個(gè)數(shù)為t[5]時(shí)，累計(jì)的X方差為100%，代表對(duì)自變量信息的提?。焕塾?jì)的Y方差為60.2%，代表對(duì)因變量信息的提??；39 個(gè)共有峰中有18 個(gè)峰與抗血栓活性呈正相關(guān)，18 個(gè)峰中VIP＞1 的成分有8 個(gè)，分別為峰1（二糖）、峰31（新隱丹參酮）、峰26（丹參醛）、峰34（隱丹參酮）、峰39（二氫隱丹參酮）、峰8（迷迭香酸）、峰18（4-甲基丹酚酸酯B 或異構(gòu)體）和峰17（丹酚酸B），計(jì)算得到的模型系數(shù)和VIP 值，見(jiàn)圖7。據(jù)此推測(cè)與丹參抗血栓活性最相關(guān)的化合物可能為二糖、新隱丹參酮、丹參醛、隱丹參酮、二氫隱丹參酮、迷迭香酸、4-甲基丹酚酸酯B 或異構(gòu)體和丹酚酸B。先前的研究也報(bào)道了相關(guān)化合物的抗血栓作用，與本研究結(jié)論相一致。唐惠蘭[23]通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)篩選出了丹參中可能具有抗血栓效應(yīng)的活性成分，包括丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸等，并發(fā)現(xiàn)它們可能都是通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮抗血栓效應(yīng)；李丹丹等[24]研究發(fā)現(xiàn)西洋參、丹參組方中有16 個(gè)活性成分作用于血小板活化通路，包括隱丹參酮、新隱丹參酮等。

圖7 PLSR 分析結(jié)果Fig.7 Results of PLSR analysis

4 討論

4.1 斑馬魚(yú)血栓模型的特色優(yōu)勢(shì)

斑馬魚(yú)作為一種體外發(fā)育、胚胎透明的新型模式生物，具有給藥方便、實(shí)驗(yàn)周期短、用藥量少、可實(shí)現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)疾病模型的構(gòu)建及中藥活性成分的研究[25-27]等領(lǐng)域。人類(lèi)與血栓形成相關(guān)的基因在斑馬魚(yú)中均存在，斑馬魚(yú)的血栓形成及凝血機(jī)制與人類(lèi)相似[28-29]，可以模擬人類(lèi)血栓形成的過(guò)程，這為斑馬魚(yú)血栓模型的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。史永平[30]利用AA 構(gòu)建的斑馬魚(yú)血栓模型，發(fā)現(xiàn)了梔子中的3 個(gè)抗血栓關(guān)鍵化合物，其中包括以前未報(bào)道的新化合物。樊?huà)蓩蒣31]選用鹽酸腎上腺素構(gòu)建的斑馬魚(yú)在體血栓模型，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于中藥抗血栓活性成分的篩選與研究。本課題利用AA 作為誘導(dǎo)劑構(gòu)建的斑馬魚(yú)血栓模型，實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)指標(biāo)客觀(guān)可靠。

4.2 中藥譜效學(xué)在丹參質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

丹參臨床應(yīng)用廣泛，是常用的大宗藥材。四川是丹參的道地產(chǎn)區(qū)，但山東的丹參產(chǎn)量最大，占全國(guó)丹參產(chǎn)量的50%以上[32]。此外河南、陜西、湖北、河北、安徽、山西、江蘇、云南和貴州等地也在栽培，由于各產(chǎn)地的地理、氣候、環(huán)境等因素，不同產(chǎn)地的丹參質(zhì)量差異大[33]，臨床療效不穩(wěn)定，如何科學(xué)地評(píng)價(jià)丹參藥材的質(zhì)量一直是一個(gè)難題。2002年李戎等[34]首次提出了中藥譜效學(xué)，該理論能較好地體現(xiàn)中醫(yī)藥整體觀(guān)的理念[35]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的研究中。中藥譜效學(xué)中的指紋圖譜與藥效需要通過(guò)一定的數(shù)據(jù)處理才能構(gòu)建真正意義上的譜效關(guān)系，目前常用的數(shù)據(jù)處理方法有相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、多元回歸分析、PLSR 法、典型相關(guān)分析等[36]。王雅莉[37]采用典型相關(guān)分析將藥效數(shù)據(jù)與丹參-紅花藥對(duì)液相圖譜進(jìn)行譜效相關(guān)分析，可快速、有效地篩選出丹參-紅花藥對(duì)中主要的活血成分，并利用斑馬魚(yú)血栓模型驗(yàn)證了藥對(duì)中的抗血栓活性成分及譜效篩選的可行性。彭麗穎等[38]采用PLSR 法將丹參醇提物指紋圖譜與抗氧化活性進(jìn)行譜效相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)丹參中13 個(gè)共有成分對(duì)總抗氧化能力均有影響，符合中藥多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

本研究為了更加全面地了解不同產(chǎn)地丹參樣品的成分以及抗血栓療效的差異，采用譜效學(xué)相關(guān)研究思路，結(jié)合HPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，借助OPLS-DA，尋找不同產(chǎn)地丹參樣品的差異化學(xué)成分；為了進(jìn)一步探討丹參指紋圖譜與抗血栓作用之間的關(guān)系，將丹參指紋圖譜與抗血栓藥效指標(biāo)相關(guān)聯(lián)，采用PLSR 分析，較大程度地反映了各成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)作用。接下來(lái)將整合譜效相關(guān)研究與分子對(duì)接技術(shù)，旨在進(jìn)一步縮小物質(zhì)基礎(chǔ)范圍，從構(gòu)效關(guān)系層面揭示活性成分可能發(fā)揮藥效的作用機(jī)制，對(duì)整合研究獲得的藥效物質(zhì)進(jìn)行抗血栓活性驗(yàn)證，進(jìn)一步挖掘丹參抗血栓活性的質(zhì)量標(biāo)志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突