新腎病1 號方調(diào)控miR-199b-5p 抑制腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化改善腎纖維化的作用研究

曾聰聰，俞文秀，王成功，姜程曦，程錦國*

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325000

2.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325000

3.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325000

慢性腎臟疾?。╟hronic renal disease，CKD）作為全球健康面臨的一大難題，其發(fā)病率呈上升趨勢，已成為常見的死亡原因[1]。腎纖維化作為一種慢性病理過程，是CKD 進(jìn)展的主要病理特征。在CKD的早期階段，腎纖維化主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，隨著病情的進(jìn)展，腎纖維化程度逐漸加重，最終導(dǎo)致腎功能衰竭[2]。因此，腎纖維化在CKD 的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，為疾病的預(yù)后和診斷提供了重要指標(biāo)。然而腎纖維化進(jìn)展的機制尚未完全闡明，臨床治療腎纖維化仍缺乏有效的方法。

越來越多的證據(jù)表明，腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵事件，其特征是成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）產(chǎn)生與降解之間的不平衡。在CKD 的發(fā)展過程中，腎小管細(xì)胞通過EMT 途徑轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，這一過程伴隨著纖維化的發(fā)生。EMT 不僅參與了腎纖維化的形成，還通過旁分泌機制進(jìn)一步加劇了纖維化的進(jìn)程[3-4]。因此，抑制腎小管細(xì)胞的EMT 可能是一種潛在的治療策略，有助于延緩或逆轉(zhuǎn)腎纖維化，從而改善CKD 的預(yù)后。

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼RNA，它們在多種生物進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[5]。近年來，miRNAs 在腎小管EMT 中的作用也逐漸被重視。如miR-21、miR-29、miR-30 等可以通過調(diào)節(jié)與EMT 相關(guān)的基因（如Snail、Slug、Twist等）的表達(dá)水平，影響腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能[6-8]。miRNA 除可以正向或負(fù)向影響腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，還可通過直接結(jié)合到靶基因的3’-UTR 區(qū)，抑制或促進(jìn)靶基因的表達(dá)[9]。此外，miRNA還可以通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性[10]，影響EMT的進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血清miR-199b-5p水平升高，提示其參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[11]；雷偉等[12]發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p 在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷中表達(dá)升高；miR-199b-5p 還通過激活周期蛋白依賴性激酶9（cyclin-dependent kinases 9，CDK9）/Smad3 軸促進(jìn)心肌纖維化[13]；此外，miR-199b-5p 在多種腫瘤EMT 進(jìn)程中表達(dá)下調(diào)[14-15]。但關(guān)于miR-199b-5p 在腎小管EMT 及腎纖維化進(jìn)程中的研究甚少，因此，進(jìn)一步探究miR-199b-5p 在腎臟纖維化中的作用和調(diào)控機制，將為開發(fā)新的治療方法提供更多思路。

新腎病1 號方（Improved-Nephropathy Formula 1，N1F）是第六批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作項目指導(dǎo)老師程錦國治療慢性腎纖維化的經(jīng)驗方，臨床療效良好，前期實驗研究了其抗腎纖維化的作用[16-17]，但能否通過影響miRNAs 表達(dá)發(fā)揮對腎纖維化的治療作用尚未見報道。故本項目以中醫(yī)臨床療效確實的中藥復(fù)方N1F 為研究對象，旨在觀察N1F 調(diào)控miR-199b-5p、抑制腎小管EMT、發(fā)揮抗腎纖維化的作用，探討治療腎纖維化的新靶點。

1 材料

1.1 動物

36 只SPF 級雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自浙江維通利華實驗動物有限公司，許可證號SYXK（浙）2021-0020。所有大鼠均安置在SPF 環(huán)境中，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光照和黑暗循環(huán)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。動物實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號wydw2022-0633）。

1.2 藥材

N1F 由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，由黃芪30 g、鱉甲12 g、貓人參30 g、三七12 g、附子6 g、土鱉蟲15 g、黨參30 g、柴胡12 g、桂枝12 g、制大黃6 g、黃柏10 g、片姜黃12 g、鐵樹葉30 g 組成，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房陳曉城副主任分別鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao 的干燥根、鱉科動物鱉TrionyxsinensisWiegmann 的背甲、獼猴桃科獼猴桃屬植物對萼獼猴桃ActinidiavalvataDunn 的根、五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根莖、毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx 的子根的加工品、鱉蠊科昆蟲地鱉EupolyphagasinensisWalker、桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.的干燥根、傘形科植物柴胡的干燥根BupleurumchinenseDC.、樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl 的干燥嫩枝、蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根和根莖、蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮、姜科植物姜黃CurcumalongaL.的干燥根莖和蘇鐵科植物蘇鐵CycasrevoluteThunb.的干燥葉。課題組采用UPLC-Q-TOF-MS 對N1F 水煎劑的成分進(jìn)行了分析，鑒定出其水提取物含有97 種化學(xué)成分。N1F 中以柴胡、黃芪、黃柏為主，主要藥效成分為柴胡皂苷、黃芪甲苷和鹽酸小檗堿，質(zhì)量濃度分別為0.024、0.117、0.032 mg/mL。

1.3 藥品與試劑

氯沙坦鉀片（國藥準(zhǔn)字號J20180006，批號0037482）由浙江華海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，購自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號RR036A）、TB Green Premix EX TaqTM II 試劑盒（批號RR820A）購自日本Takara 公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號G1340）、Masson 染色試劑盒（批號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠血清肌酐（serum creatinine，SCr）測定試劑盒（批號C011-2-1）、大鼠血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測定試劑盒（批號C013-2-1）購自南京建成生物工程研究所；PVDF 膜（批號IPVH00010、ISEQ00010）購自美國Millipore 公司；兔抗波形蛋白（Vimentin）抗體（批號5741）、兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號19245）購自美國CST 公司；兔抗GAPDH抗體（批號ab128915）、兔抗E-鈣黏蛋白（Ecadherin）抗體（批號ab231303）、兔抗緊密連接蛋白（Zonula occludens-1，ZO-1）抗體（批號ab96587）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號ab205718）、Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號150077）、DAPI（批號ab104139）購自英國Abcam 公司。

1.4 儀器

CFX 熒光定量PCR 儀、165-8001 型電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；TGL-16g R 型低溫離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BSA224S 型電子分析天平（賽多利斯公司）；Spectra Max 190 型全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；JS-M6P 型凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技生物公司）；Histo Core Arcadia 型石蠟包埋機、RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司）；TI-S 型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 腎纖維化模型建立、分組和給藥

36 只SPF 級雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為假手術(shù)組、模型組及N1F 低、中、高劑量（9.69、19.38、38.76 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的0.5、1、2 倍[18]）組和氯沙坦（50 mg/kg）組，每組6 只。除假手術(shù)組外，其余30 只大鼠均行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，將動物固定在手術(shù)臺上，消毒后，在腹部正中作1 個小的切口，分離出左側(cè)輸尿管并將其結(jié)扎，從而造成梗阻。假手術(shù)組大鼠僅開腹游離左側(cè)輸尿管不結(jié)扎。術(shù)后第1 天開始，每日給藥1 次，連續(xù)14 d。各給藥組每日早晨ig 相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組ig 等體積蒸餾水。

2.2 生化指標(biāo)檢測

末次給藥2 h 后，以1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）ip 大鼠。提前備好抗凝管，大鼠麻醉后腹主動脈取血，血液樣本置于抗凝管中，搖勻，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，?80 ℃冰箱保存。按照試劑盒說明書檢測SCr 和BUN 水平。

2.3 腎臟組織病理學(xué)變化

取出的腎組織經(jīng)過固定、脫水、浸蠟、包埋等步驟后，被切成薄片。然后行HE 染色、Masson 染色，于顯微鏡下觀察腎組織的病理學(xué)改變。

2.4 大鼠腎組織差異表達(dá)miRNA 的分析

2.4.1 腎組織RNA 的提取、制備文庫和測序 分別從假手術(shù)組、模型組和N1F 高劑量組隨機選取3只大鼠的腎臟組織，使用TRIzol 法提取組織樣本的總RNA。實驗流程按照Illumina 公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行，包括制備文庫和測序?qū)嶒灐iRNA 測序文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits 試劑盒[19]。文庫制備工作完成后，對構(gòu)建好的文庫使用Illumina Hiseq2000/2500 進(jìn)行測序，測序讀長為單端50 bp。

2.4.2 基因鑒定與表達(dá)分析 此部分實驗委托聯(lián)川生物公司完成。每個具有miRNA 序列的樣品讀長與已有miRNA 數(shù)據(jù)庫和新miRNA 的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較，對各樣本中miRNA 進(jìn)行表達(dá)量分析，并對表達(dá)量進(jìn)行歸一化，得到norm 值。以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞2 或FC＜0.5（即|log2FC|＞1）、P＜0.05 為閾值。使用edgeR 軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得不同樣本之間的差異表達(dá)miRNA。

2.5 差異表達(dá)miRNA 的qRT-PCR 驗證

選擇miR-199b-5p 這個差異表達(dá)miRNA 進(jìn)行qRT-PCR 驗證。取各組大鼠 miRNA，使用TransScriptⅡAll-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)TransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物序列見表1。

表1 miRNA 引物序列Table 1 miRNA primer sequences

2.6 miR-199b-5p 靶基因的功能分析

通過dbEMT、Genecard、String 等數(shù)據(jù)庫對miR-199b-5p 的靶基因進(jìn)行富集，包括基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。同時，初步篩選miR-199b-5p 通過EMT 影響腎纖維化的靶基因。

2.7 免疫熒光染色檢測腎組織α-SMA 及ZO-1 表達(dá)情況

將腎組織樣本石蠟包埋、切成薄片，脫蠟、水化，檸檬酸緩沖液中加熱，滴加3%的H2O2孵育15 min，血清37 ℃封閉30 min，分別滴加α-SMA（1∶600）及ZO-1（1∶500）抗體，4 ℃孵育過夜；滴加熒光二抗（1∶800），避光37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染10 min 后，滴加防熒光淬滅劑封片，利用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

2.8 Western blotting 檢測腎組織 α-SMA、Vimentin、E-cadherin 和ZO-1 蛋白表達(dá)

腎組織加入RIPA 蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，取上清提取總蛋白。使用BCA 法測定蛋白含量，蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入α-SMA（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、ZO-1（1∶2 000）及GAPDH（1∶20 000）抗體，孵育后洗膜；加入二抗孵育、洗膜，滴加發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶灰度。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析（One way ANOVA）法進(jìn)行多組間差異分析。

3 結(jié)果

3.1 N1F 對腎纖維化大鼠腎功能的影響

如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SCr、BUN 水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組SCr、BUN 水平均明顯降低（P＜0.05、0.01），且N1F 高劑量組作用最佳。

表2 N1F 對腎纖維化大鼠腎功能的影響 (±s, n = 6)Table 2 Effect of N1F on renal function in rats with renal fibrosis (±s , n = 6)

表2 N1F 對腎纖維化大鼠腎功能的影響 (±s, n = 6)Table 2 Effect of N1F on renal function in rats with renal fibrosis (±s , n = 6)

與假手術(shù)組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01.**P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group.

組別 劑量/(g·kg?1) SCr/(μmol·L?1) BUN/(mmol·L?1)假手術(shù) — 40.23±3.43 5.57±0.46模型 — 79.05±3.89** 13.64±2.13**N1F 9.69 62.98±4.92# 9.32±1.78#19.38 63.25±4.43# 8.53±1.28##38.76 60.10±3.67## 7.83±1.31##氯沙坦 0.05 64.10±3.90# 9.31±1.13#

3.2 N1F 對腎纖維化大鼠腎臟病理變化的影響

如圖1 所示，假手術(shù)組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管及間質(zhì)均無異常改變。與假手術(shù)組比較，模型組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量變性壞死，管腔擴張，間質(zhì)增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管萎縮，腎間質(zhì)膠原纖維沉積明顯增多；與模型組比較，各給藥組大鼠腎臟組織的炎性細(xì)胞浸潤有一定程度減輕，膠原纖維沉積減少，其中N1F 高劑量組膠原纖維沉積明顯減少。

圖1 N1F 對腎纖維化大鼠腎臟病理變化的影響 (×200)Fig.1 Effect of N1F on pathological changes of renal tissue in rats with renal fibrosis (× 200)

3.3 基因表達(dá)譜變化

如圖2 和表3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組共篩選出339 個差異表達(dá)miRNA，其中218 個miRNA 下調(diào)、121 個miRNA 上調(diào)；與模型組比較，N1F 高劑量組共篩選出41 個差異表達(dá)miRNA，其中39 個miRNA下調(diào)、2 個miRNA 上調(diào)。其中rno-miR-199b-5p、rnomiR-127-5p、rno-miR-103-2-5p和rno-PC-3p-39464在模型組表達(dá)上調(diào)，而在N1F 高劑量組表達(dá)下調(diào)。

圖2 模型組vs 假手術(shù)組 (A)、N1F 高劑量組vs 模型組 (B) 腎臟組織差異表達(dá)miRNA 的散點圖Fig.2 Scatter plot of differentially expressed miRNA in renal tissue of model group vs sham group (A), N1G high-dose group vs model group (B)

表3 各組大鼠腎組織差異表達(dá)的miRNATable 3 Differentially expressed miRNA in renal tissue of rats in each group

3.4 miR-199b-5p 差異表達(dá)的qRT-PCR 驗證

通過文獻(xiàn)查閱[11-15]，miR-199b-5p 可能與腎臟病及EMT 進(jìn)程相關(guān)，且RNA 測序部分提示miR-199b-5p 為差異表達(dá)miRNA。因此，以miR-199b-5p 為研究對象，進(jìn)行qRT-PCR 驗證，如圖3 所示，miR-199b-5pmRNA 相對表達(dá)量的驗證結(jié)果與測序結(jié)果趨勢一致，提示miRNA 測序結(jié)果真實可靠，可用于進(jìn)一步的深層次數(shù)據(jù)分析。

圖3 miR-199b-5p 的qRT-PCR 驗證 (±s, n = 6)Fig.3 qRT-PCR validation of miR-199b-5p (±s, n = 6)

3.5 miR-199b-5p 的靶基因的功能分析

miR-199b-5p 的GO 功能富集分析（圖4-A）顯示，靶基因主要富集在蛋白連接、細(xì)胞遷移、對生長因子的反應(yīng)、細(xì)胞對生長因子刺激的反應(yīng)、染色質(zhì)結(jié)合、DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等條目。KEGG 通路富集分析（圖4-B）顯示，主要富集于表皮生長因子受體2（receptor tyrosine protein kinase erbB2，ErbB）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、病毒感染及腫瘤等。隨后，對miR-199b-5p 影響腎纖維化的可能機制EMT 進(jìn)行篩選，結(jié)合Targetscan 預(yù)測和韋恩分析，鑒定了miR-199b-5p 靶基因中與EMT、腎纖維化相關(guān)功能的90 個基因（圖5）；根據(jù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）中度值提取排名前20 名的核心靶點，并分析其對應(yīng)的可能作用機制（表4）。

圖4 miR-199b-5p 靶基因的GO 功能 (A) 和KEGG 通路 (B) 富集分析Fig.4 GO function (A) and KEGG pathway (B) enrichment analysis of miR-199b-5p target genes

圖5 與EMT、腎纖維化相關(guān)的功能基因篩選Fig.5 Screening of functional genes related to EMT and renal fibrosis

表4 miR-199b-5p 靶基因中與EMT、腎纖維化相關(guān)的功能基因Table 4 Functional genes related to EMT and renal fibrosis in miR-199b-5p-target genes

3.6 N1F 對腎纖維化大鼠腎組織EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中ZO-1、E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），α-SMA 和Vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組α-SMA蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.001），N1F 中、高劑量組和氯沙坦組Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），N1F 低、中劑量組和氯沙坦組E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。免疫熒光染色結(jié)果（圖7）與Western blotting 結(jié)果一致，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織ZO-1 陽性表達(dá)減少，α-SMA 陽性表達(dá)增多；與模型組比較，N1F 各劑量組ZO-1 陽性表達(dá)增多，α-SMA 陽性表達(dá)減少。

圖6 N1F 對腎纖維化大鼠EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s , n = 3)Fig.6 Effect of N1F on EMT related proteins expressions in rats with renal fibrosis (±s , n = 3)

圖7 N1F 對腎纖維化大鼠EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (免疫熒光, ×20)Fig.7 Effect of N1F on EMT related proteins expressions in rats with renal fibrosis (immunofluorescence, × 20)

4 討論

腎纖維化是一個發(fā)展過程，是所有CKD 病情進(jìn)展的共同途徑。目前，對于腎纖維化機制及通路的探討存在多樣性，隨著對腎小管上皮細(xì)胞在CKD進(jìn)程中作用的認(rèn)識加深，人們已經(jīng)越來越注意到腎小管EMT 是腎纖維化非常重要的一個核心。miRNAs 作為參與基因調(diào)節(jié)的重要分子，已逐漸被證實在腎小管EMT 中的作用，但miRNAs 數(shù)量眾多，篩選出合適的miRNA，對EMT 進(jìn)行有效調(diào)控，仍需更多的研究工作。

左側(cè)單側(cè)輸尿管梗阻法復(fù)制腎纖維化動物模型，具有簡單易行、結(jié)果可靠的優(yōu)點，是經(jīng)典的制備腎纖維化模型的方法。本研究通過測序發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p 在UUO 大鼠腎組織中顯著增加，并驗證了腎纖維化模型中miR-199b-5p 表達(dá)結(jié)果與測序一致，證明miR-199b-5p 參與了腎纖維化發(fā)生發(fā)展。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)N1F 干預(yù)后，miR-199b-5p 在模型組大鼠腎組織中表達(dá)顯著下調(diào)，提示miR-199b-5p 可能為N1F 的作用靶點，篩選到了新的miRNA，在一定程度上進(jìn)一步完善和豐富了腎纖維化的發(fā)生機制。

本研究生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p 可通過調(diào)控90 個靶基因介導(dǎo)腎小管EMT 參與腎纖維化過程。根據(jù)實驗結(jié)果結(jié)合進(jìn)一步文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p 調(diào)控的靶基因JUN，其蛋白在腎小球和腎小管處均見表達(dá)，且主要在細(xì)胞核處高表達(dá)，但發(fā)生腎損傷是時其表達(dá)量顯著降低[20]，可能與JUN 參與細(xì)胞增殖、死亡、分化和炎癥的調(diào)節(jié)相關(guān)；去乙?；?（sirtuins3，SIRT3）作為線粒體蛋白乙?；痛x穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在腎纖維化的發(fā)生過程中，SIRT3 的去乙?；揎椬饔脜⑴c線粒體能量代謝調(diào)控，從而起到抑制腎纖維化的作用[21]，這表明SIRT3 可能是腎纖維化過程中的一個重要靶基因。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族（包括MAPK8、MAPK14等）在體內(nèi)多種氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程中具有重要調(diào)控作用，腎臟組織可以廣泛表達(dá)MAPK[22]，從而加快腎纖維化進(jìn)程；PI3K 信號通路是一個經(jīng)典的抗凋亡、促存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，已被證實是糖尿病腎病發(fā)病過程中的一條重要信號通路，與系膜基質(zhì)增生、足細(xì)胞損傷等具有密切的聯(lián)系，加速腎纖維化的進(jìn)程[23]。當(dāng)然還有更多的靶基因值得深入研究。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠腎臟組織EMT 上皮表型相關(guān)蛋白E-cadherin 和ZO-1 表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)表型相關(guān)蛋白α-SMA 和vimentin 表達(dá)上調(diào)；N1F治療后，EMT 上皮表型相關(guān)蛋白呈現(xiàn)上調(diào)，間質(zhì)表型相關(guān)蛋白下調(diào)，腎纖維化減輕。因此，認(rèn)為miR-199b-5p 可能通過抑制EMT，減輕腎纖維化，與生物信息學(xué)預(yù)測相符。

綜上，N1F 可減輕左側(cè)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的腎臟纖維化，其作用機制可能與下調(diào)miR-199b-5p、抑制EMT 有關(guān)。本研究有助于闡明miR-199b-5p 在腎纖維中的作用，并為開發(fā)針對腎纖維化的新治療策略提供了方向。但本研究未能采用轉(zhuǎn)染敲低質(zhì)粒的方法下調(diào)miR-199b-5p，尚需后續(xù)深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突