白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠血管穩(wěn)態(tài)失衡的影響

陳鈺嵐，魏柯健，劉 靜，郭靜妍，呂圭源，蘇 潔

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2020 年）》顯示，我國(guó)超重肥胖的成年居民超過50%[1]。肥胖導(dǎo)致血管阻力增加，導(dǎo)致血管穩(wěn)態(tài)失衡[2]。血管穩(wěn)態(tài)的失衡與重構(gòu)機(jī)制涉及代謝、氧化應(yīng)激、炎癥等，其中能量代謝是血管重構(gòu)的關(guān)鍵機(jī)制之一[3]。腺苷酸激活蛋白激酶（adenylate-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路與線粒體功能關(guān)系密切，為改善線粒體功能的關(guān)鍵途徑[4]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血脈穩(wěn)態(tài)失衡是多種病機(jī)作用下的慢性、長(zhǎng)程的病理改變，其中血管穩(wěn)態(tài)失衡以氣虛和火熱為本[5]。氣虛見于多臟功能不足，而脾胃為氣血生化之源，是氣機(jī)升降的樞紐，主運(yùn)化與統(tǒng)血[6]，故推測(cè)血管穩(wěn)態(tài)失衡與脾胃氣虛有關(guān)。脾胃氣虛的首要原因?yàn)檫^食肥甘[7]，過食肥甘者常見倦怠乏力、口渴少飲、五心煩熱等臨床表現(xiàn)[8]，與“陰火”患者的臨床表現(xiàn)相似，陰火證是以脾胃氣虛為主和火熱亢盛為次的證候群[9]，故認(rèn)為肥胖與陰火證密切相關(guān)。李東垣治療陰火證以“甘溫除熱”“益氣升陽”為主，補(bǔ)中益氣，健運(yùn)中焦[10]。白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，味甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水的功效[11]。同時(shí)現(xiàn)代臨床發(fā)現(xiàn)，白術(shù)能影響機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)血脂紊亂[12]，因此，白術(shù)或可治療肥胖所致的血管穩(wěn)態(tài)失衡。本研究通過高糖高脂飼料的肥胖小鼠，結(jié)合各藥效指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)白術(shù)水提物對(duì)肥胖相關(guān)中醫(yī)證候表現(xiàn)影響，并探討其對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈血管穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠40 只，6～8 周齡，購(gòu)自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，許可證號(hào) SCXK （ 滬） 2018-0006，合格證號(hào)20180006023028。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～65%，光照時(shí)間12 h/d，循環(huán)通風(fēng)換氣。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ZSLL-2016-118）。

1.2 藥材

麩炒白術(shù)飲片（批號(hào)202007069）購(gòu)自浙江錢王中藥有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)朱波副教授鑒定為菊科植物白術(shù)A.macrocephalaKoidz.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

依折麥布片（批號(hào)W018665）購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司；高糖高脂飼料（由20.0%蔗糖、15%豬油、0.8%膽固醇、0.2%膽酸鈉及適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等組成，批號(hào)20220923、20221126）購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司；對(duì)照品白術(shù)內(nèi)酯III（批號(hào)22010404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.98%）、白術(shù)內(nèi)酯IV（批號(hào)20091003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.56%）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號(hào)220811301）購(gòu)自美康生物科技股份有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號(hào)分別為20230104、20230424）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）試劑盒（批號(hào)分別為202301、23021460）均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體、沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1）抗體（批號(hào)分別為00105090、00130130）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TNF-α 抗體（批號(hào)B8905）購(gòu)自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體（批號(hào)HH0827）購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體（批號(hào)16）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）抗體、AMPK 抗體（批號(hào)分別為M27MA02、L220C04）購(gòu)自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 儀器

SENCO R-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）；FA2204B 型電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；TBA40-FR 型全自動(dòng)生化分析儀（東芝三廣醫(yī)療株式會(huì)社）；EC360 型全自動(dòng)包埋機(jī)（美康儀器設(shè)備制造高淳縣有限公司）；Tissue-Tek VIPTM 5Jr 型全封閉組織脫水機(jī)（日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社）；RM2245 型半自動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；HS-KP-G 型烤片機(jī)（沈陽恒松科技有限公司）；Power wave 340 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；SCIENTZ-48 型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FLIR ONE Pro 型紅外熱像儀（美國(guó)FLIR 公司）。

2 方法

2.1 白術(shù)水提物中有效成分含量測(cè)定

2.1.1 白術(shù)水提物的制備 取麩炒白術(shù)粗粉500 g，加入20 倍量水，提取3 次，每次2 h，濾過，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至1 g/mL，4 ℃?zhèn)溆?。臨用前使用蒸餾水將其分別配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.4 g/mL 的溶液。

2.1.2 色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～20 min，50%～60% B；20～30 min，60%～70% B；30～35 min，70%～100%B；35～40 min，100% B；40～45 min，100%～50%B。體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯II 對(duì)照品1.48、0.71 mg，置10 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，密塞，搖勻，得白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯II 質(zhì)量濃度分別為148、71 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取1 g/mL 白術(shù)水提物，離心，過0.22 μm 濾膜，即得。

2.1.5 線性關(guān)系的考察 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯II 混合對(duì)照品，加甲醇制成系列梯度質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，以白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯II 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，白術(shù)內(nèi)酯III：Y＝24.613 0X，r＝0.999 8；白術(shù)內(nèi)酯II：Y＝30.902 0X＋3.154 7，r＝0.999 9。結(jié)果表明白術(shù)內(nèi)酯III 在質(zhì)量濃度2.312 5～74.000 0 μg/mL、白術(shù)內(nèi)酯II 在質(zhì)量濃度1.109 4～35.500 0 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.2 分組、造模與給藥

40 只ICR 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、依折麥布片（1 mg/kg，依折麥布片用蒸餾水配制成0.1 mg/mL 的溶液）組和白術(shù)水提物高、低劑量（4、2 g/kg）組。除正常組給予普通飼料外，其余各組每天給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，造模的同時(shí)分別ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），正常組及模型組ig 等體積的蒸餾水，1 次/d，連續(xù)11 周。

2.3 體質(zhì)量測(cè)定

于給藥第0、3、6、9 周，稱定小鼠體質(zhì)量。

2.4 中醫(yī)證候指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 排尿量 于給藥11 周后，采用代謝籠下放置15 mL 離心管收集各組小鼠24 h 的新鮮尿液，計(jì)量尿液量。

2.4.2 尿液吸光度（A） 于給藥11 周后，采用代謝籠收集小鼠新鮮尿液200 μL，用移液槍準(zhǔn)確吸取“2.4.1”項(xiàng)下所得各組小鼠尿液200 μL，加于96 孔板上，并使用酶標(biāo)儀在450 nm 下測(cè)定A值。

2.4.3 排便量 于給藥11 周后，記錄小鼠24 h 內(nèi)排出的糞便粒數(shù)。

2.4.4 面溫 于給藥11 周后，安靜環(huán)境下，用非接觸式紅外測(cè)溫儀對(duì)準(zhǔn)小鼠面部，當(dāng)測(cè)溫儀穩(wěn)定后記錄所測(cè)數(shù)據(jù)，測(cè)定3 次，取平均值。

2.4.5 足溫 于給藥9 周后，安靜環(huán)境下，輕抓小鼠，采用熱成像儀拍攝每組小鼠的熱成像，通過FLIRTools 軟件分析各組小鼠足溫，并統(tǒng)計(jì)其平均值。

2.4.6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 于給藥10 周后，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。握住小鼠尾根部處，輕輕將小鼠放入藍(lán)色立方形曠場(chǎng)箱的正中，開始同步錄像、計(jì)時(shí)。曠場(chǎng)箱正上方安置攝像頭，在安靜無干擾并杜絕參照物的環(huán)境條件下進(jìn)行，觀察5 min 內(nèi)小鼠活動(dòng)情況。取出小鼠后，用毛巾蘸清水及低質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇徹底擦拭箱底，并等待其揮發(fā)擴(kuò)散，避免留有氣味而干擾下只小鼠的觀察結(jié)果。運(yùn)用動(dòng)物行為活動(dòng)標(biāo)記分析系統(tǒng)，對(duì)各組小鼠的行為進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

2.4.7 舌象 于給藥9 周后，將小鼠進(jìn)行麻醉，使用單反相機(jī)拍攝小鼠舌頭表面，并統(tǒng)計(jì)舌表的R 值、RGB 值。

2.5 尾部微循環(huán)檢測(cè)

于給藥11 周后，用異氟烷呼吸麻醉機(jī)對(duì)小鼠進(jìn)行呼吸麻醉，使用Moor FLPI 掃描成像系統(tǒng)測(cè)定小鼠尾部微循環(huán)血流量。測(cè)量面積為尾部約1 cm2處的相同面積大小，檢測(cè)時(shí)間30 s，掃描速度25 Hz/s。使用Moor FLPI Review 3.0 軟件對(duì)所記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.6 血清TC、LDL-C 水平檢測(cè)

末次給藥后，各組小鼠眼眥取血，4 ℃凝血2 h，3 500 r/min 離心15 min，取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、LDL-C 水平。

2.7 血清NO、TNF-α 和ET-1 水平檢測(cè)

末次給藥后，取各組小鼠血清，按照試劑盒說明書檢測(cè)血清中NO、ET-1 和TNF-α 水平。

2.8 主動(dòng)脈組織病理學(xué)觀察

末次給藥后，眼眥取血致死，取小鼠主動(dòng)脈，放入盛有10%中性福爾馬林緩沖液的瓶中。經(jīng)固定、取材、脫水、包埋、切片，制得4 μm 石蠟切片，采用蘇木素-伊紅（HE）、Masson、Gomori 醛品紅彈力纖維染色，中性樹脂封片，干燥后于顯微鏡下觀察主動(dòng)脈組織病理變化。

2.9 免疫組化法檢測(cè)主動(dòng)脈中TLR4、IL-6、TNFα 的蛋白表達(dá)

取各組小鼠主動(dòng)脈石蠟切片（4 μm），經(jīng)過消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性、抗原修復(fù)、牛血清白蛋白封閉后，滴加TLR4、IL-6、TNF-α 抗體，4 ℃孵育過夜；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；經(jīng)DAB 顯色、蘇木素染色、乙醇脫水及中性樹脂封片干燥后，于顯微鏡下觀察TLR4、IL-6、TNF-α 蛋白的表達(dá)情況，并用Image J 軟件進(jìn)行分析。

2.10 免疫熒光檢測(cè)主動(dòng)脈p-AMPK、SIRT1 和PGC-1α 的蛋白表達(dá)

取各組小鼠主動(dòng)脈石蠟切片（4 μm），經(jīng)抗原修復(fù)、封閉、4 ℃孵育一抗過夜、孵育二抗、DAPI 核染，蔡司熒光正置顯微鏡下觀察主動(dòng)脈中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 的表達(dá)情況。

2.11 Western blotting 檢測(cè)主動(dòng)脈 p-AMPK、SIRT1 和PGC-1α 的蛋白表達(dá)

取各組小鼠主動(dòng)脈組織，液氮充分研磨后，加入適量RIPA 裂解液，冰上靜置10 min，離心取上清，提取組織蛋白。BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 抗體，4 ℃孵育過夜；PBST 洗膜3 次，每次15 min；加入二抗，室溫孵育2 h；PBST洗膜3 次，每次15 min；加入ECL 化學(xué)發(fā)光液后，采用Modena 凝膠成像儀檢測(cè)蛋白條帶，并用Image J 軟件進(jìn)行分析。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 白術(shù)水提物中有效成分的測(cè)定

分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1）。測(cè)得1 g/mL 白術(shù)水提物中白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯II 的質(zhì)量濃度分別為11.97、2.56 μg/mL。

圖1 混合對(duì)照品 (A) 和白術(shù)水提物 (B) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A) and A.macrocephala water extract (B)

3.2 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響

如圖2 所示，給藥3、6、9 周后，與正常組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠的體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01）。

圖2 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響 (±s, n = 8)Fig.2 Effect of A.macrocephala water extract on body weight of obese mice (±s, n = 8)

3.3 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠中醫(yī)證候指標(biāo)的影響

3.3.1 對(duì)排尿量的影響 如圖3-A 所示，與正常組比較，模型組小鼠的排尿量顯著降低（P＜0.01）；給藥11 周后，與模型組比較，各劑量白術(shù)水提物均能顯著提高小鼠的排尿量（P＜0.01）。

圖3 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠中醫(yī)證候指標(biāo)的影響 (±s, n = 8)Fig.3 Effect of A.macrocephala water extract on TCM syndromes of obese mice (±s, n = 8)

3.3.2 對(duì)尿液A值的影響 如圖3-B 所示，與正常組比較，模型組小鼠的尿液A值顯著提高（P＜0.01）；給藥11 周后，與模型組比較，各劑量白術(shù)水提物均能顯著降低小鼠的尿液A值（P＜0.01）。

3.3.3 對(duì)排便量的影響 如圖3-C 所示，與正常組比較，模型組小鼠的排便量顯著降低（P＜0.01）；給藥11 周后，與模型組比較，白術(shù)水提物各劑量均能顯著提高模型小鼠的排便量（P＜0.01）。

3.3.4 對(duì)面溫的影響 如圖3-D 所示，與正常組比較，模型組小鼠的面溫顯著降低（P＜0.01）；給藥11 周后，與模型組比較，各給藥組均能顯著升高小鼠的面溫（P＜0.01）。

3.3.5 對(duì)足溫的影響 如圖3-G、H 所示，與正常組比較，模型組小鼠的足溫顯著升高（P＜0.01）；給藥9 周后，與模型組比較，各給藥組均能顯著降低小鼠的足溫（P＜0.01）。

3.3.6 對(duì)曠場(chǎng)的影響 如圖3-E、F 所示，與正常組比較，模型組小鼠水平運(yùn)動(dòng)總距離顯著減少（P＜0.01），水平運(yùn)動(dòng)速度顯著降低（P＜0.01）；給藥10周后，與模型組比較，各給藥組均能顯著增加小鼠水平運(yùn)動(dòng)總距離和提高水平運(yùn)動(dòng)速度（P＜0.01）。

3.3.7 對(duì)舌象的影響 如圖4 所示，與正常組比較，模型組小鼠的舌色R 值、RGB 值均顯著降低（P＜0.01）；給藥9 周后，與模型組比較，各給藥組均能顯著提高小鼠的舌色R 值（P＜0.01），各劑量白術(shù)水提物能顯著升高小鼠的舌色RGB 值（P＜0.01）。

圖4 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠舌象的影響 (±s , n = 8)Fig.4 Effect of A.macrocephala water extract on tongue manifestation of obese mice (±s , n = 8)

3.4 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠尾部微循環(huán)的影響

如圖5 和表1 所示，與正常組比較，模型組小鼠尾部微循環(huán)血流量顯著降低（P＜0.01）；給藥11周后，與模型組比較，各給藥組均能顯著增加小鼠尾部微循環(huán)血流量（P＜0.05、0.01）。

表1 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠尾部微循環(huán)的影響(±s , n = 8)Table 1 Effect of A.macrocephala water extract on tail microcirculation of obese mice (±s , n = 8)

表1 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠尾部微循環(huán)的影響(±s , n = 8)Table 1 Effect of A.macrocephala water extract on tail microcirculation of obese mice (±s , n = 8)

組別 劑量/(g·kg?1) 尾部微循環(huán)血流量/PU正常 — 97.28±21.96模型 — 62.50±22.83##依折麥布片 0.001 84.82±29.10*白術(shù)水提物 4 94.64±19.15**2 88.04±8.25*

圖5 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠尾部微循環(huán)的影響 (±s , n = 8)Fig.5 Effect of A.macrocephala water extract on tail microcirculation of obese mice (±s , n = 8)

3.5 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠血清LDL-C 和TC 水平的影響

如圖6 所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中LDL-C 和TC 水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，依折麥布片組和白術(shù)水提物（2 g/kg）組LDL-C 水平顯著降低（P＜0.01），各給藥組小鼠血清中TC 水平均顯著降低（P＜0.01）。

圖6 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠血清LDL-C 和TC 水平的影響 (±s , n = 8)Fig.6 Effect of A.macrocephala water extract on LDL-C and TC levels in serum of obese mice (±s , n = 8)

3.6 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠血清TNF-α水平的影響

如圖7 所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組均能顯著降低小鼠血清中TNF-α 水平（P＜0.01）。

圖7 白術(shù)水提物對(duì)模型小鼠血清TNF-α 水平的影響(±s , n = 8)Fig.7 Effect of A.macrocephala water extract on TNF-α level in serum of obese mice (±s , n = 8)

3.7 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠血清NO 和ET-1 水平的影響

如圖8 所示，與正常組比較，模型組小鼠血清NO 水平顯著降低（P＜0.01），ET-1 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組均能顯著升高小鼠血清NO 水平（P＜0.05、0.01），顯著降低小鼠血清ET-1 水平（P＜0.01）。

圖8 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠血清NO 和ET-1 水平的影響 (±s , n = 8)Fig.8 Effect of A.macrocephala water extract on NO and ET-1 levels in serum of obese mice (±s , n = 8)

3.8 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的影響

如圖9 所示，HE 染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠中層平滑肌細(xì)胞增生且排列紊亂，存在內(nèi)皮破裂；各劑量白術(shù)水提物均可緩解主動(dòng)脈中膜增厚、血管平滑肌細(xì)胞排列紊亂狀況。Masson染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠可見血管內(nèi)膠原纖維沉積明顯增多，膠原纖維面積顯著增大；各劑量白術(shù)水提物均可使主動(dòng)脈膠原沉積顯著減小。Gomori 醛品紅彈力纖維染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠彈力纖維斷裂和增生，血管壁重構(gòu)；與模型組比較，各劑量白術(shù)水提物均可緩解主動(dòng)脈中彈力纖維斷裂和增生狀況。

圖9 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.9 Effect of A.macrocephala water extract on aorta histomorphology of obese mice

3.9 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈TLR4、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)的影響

如圖10 所示，主動(dòng)脈中TLR4、IL-6、TNF-α染色陽性產(chǎn)物表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞表面，呈棕黃色。與正常組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈中TLR4、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組主動(dòng)脈TLR4、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。

圖10 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈TLR4、IL-6 和TNF-α 表達(dá)的影響 (±s , n = 3)Fig.10 Effect of A.macrocephala water extract on TLR4, TNF-α and IL-6 expression in aorta of obese mice (±s , n = 3)

3.10 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果（圖11）顯示，主動(dòng)脈中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞表面。與正常組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 綠色熒光表達(dá)減少；與模型組比較，白術(shù)水提物各劑量組主動(dòng)脈p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 綠色熒光表達(dá)增加。

圖11 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈p-AMPK、SIRT1 和PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響Fig.11 Effect of A.macrocephala water extract on p-AMPK, SIRT1 and PGC-1α protein expressions in aorta of obese mice

Western blotting 結(jié)果（圖12）顯示，與正常組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，白術(shù)水提物（2 g/kg）組p-AMPK 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），白術(shù)水提物各劑量組SIRT1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），白術(shù)水提物（4 g/kg）組PGC-1α 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

圖12 白術(shù)水提物對(duì)肥胖小鼠主動(dòng)脈AMPK、p-AMPK、SIRT1 和PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響 (±s , n = 4)Fig.12 Effect of A.macrocephala water extract on AMPK, p-AMPK, SIRT1 and PGC-1α protein expressions in aorta of obese mice (±s , n = 4)

4 討論

中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為，肥則礙胃、甘則滯脾。脾胃功能受損，可致氣郁下焦或濕隨氣險(xiǎn)郁于下焦，化火而上炎，火熱伏于血脈，煎熬陰血，灼津?yàn)樘担沓绅?，瘀阻絡(luò)脈，使脈道失于溫養(yǎng)，經(jīng)脈痙攣而病，加重瘀滯，進(jìn)一步阻礙氣血津液的代謝，同時(shí)體內(nèi)痰瘀過久，加重脾胃虧虛的程度，最終導(dǎo)致血管穩(wěn)態(tài)失衡的發(fā)生[13]。李東垣在《脾胃論·飲食勞倦所傷始為熱中論》中指出：“脾胃氣衰，元?dú)獠蛔?，而心火?dú)盛。心火者，陰火也”，故而脾胃失調(diào)，可致元?dú)馑ト?，營(yíng)血不足，氣火失調(diào)，君相不安，血中伏火，導(dǎo)致陰火的產(chǎn)生[9]，此病機(jī)與肥胖引起的脾胃虧虛致血管穩(wěn)態(tài)失衡的病機(jī)具有同一性。故而推測(cè)肥胖可致脾胃虛弱，而使機(jī)體產(chǎn)生陰火，損傷血管，并表現(xiàn)出相關(guān)證候，影響健康。

陰火證以脾胃氣虛為主和火熱亢盛為次，脾胃氣虛常見口淡不渴、倦怠乏力、排便無力，其舌脈為舌淡或伴齒痕、苔薄白，脈弱無力[14]?；馃峥菏⒁园l(fā)熱、口渴飲冷、胸腹灼熱、面紅目赤、大便秘結(jié)、小便短黃為常見癥[15]。本研究以排尿量量化“口淡不渴”，尿液A值量化“小便短黃”，排便量量化“排便無力”，面部溫度和足部溫度量化“發(fā)熱”，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)量化“倦怠乏力”，舌象量化“舌淡”。李東垣主張補(bǔ)脾胃、升陽氣、祛濕熱、暢氣機(jī)以散陰火，白術(shù)為菊科多年生草本植物白術(shù)的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗的功效，臨床多用于脾氣虛弱、運(yùn)化失常所致的脘腹脹滿、倦怠乏力等證，為“健脾補(bǔ)氣第一要藥”[16]，歷代古籍中均有記載?！侗静萁?jīng)疏》記載：“術(shù)，其氣芳烈，其味甘濃，其性純陽，為除風(fēng)痹之上藥，安脾胃之神品”；《本草通玄》記載：“白術(shù)，補(bǔ)脾胃之藥，更無出其右者。土旺則能健運(yùn)，故不能食者，食停滯者，有痞積者，皆用之也”。白術(shù)健脾胃、祛濕熱，或可緩解過食肥甘所導(dǎo)致的氣虛和火熱。本研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)水提物可顯著提高肥胖小鼠曠場(chǎng)水平移動(dòng)總距離和水平移動(dòng)速度，顯著提高排便量和排尿量，降低尿液A值，升高面溫，降低足溫，改善舌象變化，證明白術(shù)水提物能夠有效改善肥胖小鼠倦怠乏力、排便無力、四肢煩熱等證候，并推測(cè)此功效可能由改善陰火的途徑而發(fā)揮。

研究表明，脂代謝紊亂和肥胖是血管穩(wěn)態(tài)失衡的常見病因，脂質(zhì)氧化功能降低，導(dǎo)致脂肪酸代謝物的累積，使體內(nèi)TC、LDL-C 水平升高，出現(xiàn)血脂代謝異常[17]，繼而引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及彈力纖維的異常生長(zhǎng)、增殖等血管穩(wěn)態(tài)失衡[18]。同時(shí)脂代謝紊亂可激活TLR4 信號(hào)通路，TLR4 信號(hào)被激活后，向下游發(fā)出信號(hào)，下游因子通過經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中激活一系列炎癥基因如IL-6、TNFα，并促進(jìn)其含量增加和釋放[19]。TNF-α 表達(dá)增加，促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)ET-1 生成[20]，同時(shí)IL-6表達(dá)增加，減弱內(nèi)皮細(xì)胞中NO 信號(hào)通路，抑制NO生成，導(dǎo)致ET-1/NO 系統(tǒng)失衡[21-22]，NO 利用率減少，舒張血管作用減弱，平滑肌收縮，血管內(nèi)皮功能受損，加重血管穩(wěn)態(tài)失衡。

能量代謝作為血管重構(gòu)的關(guān)鍵機(jī)制之一，在維持血管穩(wěn)態(tài)的過程中起到重要作用。PGC-1α 為調(diào)節(jié)線粒體功能的關(guān)鍵因子[23]，研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 可以激活SIRT1 乙酰化，增加PGC-1α 的活性，緩解線粒體損傷，提高線粒體生物合成水平[24-25]。線粒體合成水平提高可以改善脂質(zhì)代謝，生成啟動(dòng)抗炎信號(hào)，從而緩解血管內(nèi)皮功能損傷，改善血管穩(wěn)態(tài)失衡[26-27]?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路，減少炎癥反應(yīng)[28]；參苓白術(shù)散可激活A(yù)MPK 信號(hào)通路從而降糖控脂[29]。本研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)水提物能明顯上調(diào)血管 p-AMPK、SIRT1、PGC-1α 的蛋白表達(dá)，下調(diào)主動(dòng)脈TLR4、IL-6、TNF-α 的蛋白表達(dá)，降低血清中TC、LDL-C、TNF-α 水平，調(diào)節(jié)血清NO/ET-1 的失衡，并減輕主動(dòng)脈損傷。表明白術(shù)水提物可能是通過激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路來調(diào)節(jié)線粒體功能，調(diào)節(jié)代謝，實(shí)現(xiàn)血管動(dòng)態(tài)平衡。

綜上，白術(shù)水提物能夠有效改善緩解倦怠乏力、排便無力、四肢煩熱等證候，減輕主動(dòng)脈的損傷，并通過激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α 通道，起到調(diào)節(jié)能量代謝的作用，最終改善線粒體功能障礙引起的血管穩(wěn)態(tài)失衡。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突