同時(shí)測(cè)定復(fù)方阿膠漿中間體中17 種化學(xué)成分的定量核磁方法

謝欣媛，楊嘉譽(yù)，潘堅(jiān)揚(yáng)，瞿海斌

浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所，浙江 杭州 310058

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜法能同時(shí)提供定性和定量信息，是一種非靶向分析工具。其定量基本原理是信號(hào)強(qiáng)度與產(chǎn)生特定共振的原子核數(shù)量成正比。通過(guò)向樣本中加入已知濃度內(nèi)標(biāo)化合物，可以基于該比例關(guān)系實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，或結(jié)合摩爾質(zhì)量換算實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量[1]。近年來(lái)，定量質(zhì)子核磁共振（quantitative nuclear magnetic resonance，1H-qNMR）技術(shù)在制藥、代謝組學(xué)、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2-6]。1H-qNMR 具有樣品制備簡(jiǎn)便、分析過(guò)程中不破壞樣品、無(wú)需被測(cè)物對(duì)照品的特點(diǎn)，雖然其靈敏度低于質(zhì)譜技術(shù)，但上述特點(diǎn)使其比常規(guī)色譜技術(shù)更便捷、快速，適用于混合物分析[7]，因此，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究中具有優(yōu)勢(shì)[8-10]。

復(fù)方阿膠漿（Compound E’jiao Jiang，CEJ）源自明代醫(yī)家張介賓《景岳全書》中的兩儀膏，是一種補(bǔ)益劑，臨床用于治療氣血兩虛證[11]。其制備工藝的第一步是合并煎煮紅參、黨參、熟地黃和山楂，得到提取液。阿膠則單獨(dú)加水煮沸，得到膠液。膠液與上述提取液混合后用碳酸鈉調(diào)整pH 值，濾過(guò)后濃縮至指定密度，再進(jìn)行酸堿調(diào)節(jié)和濾過(guò)，最終得到成品制劑[12]。

為探究生產(chǎn)過(guò)程中物質(zhì)傳遞規(guī)律，確定會(huì)導(dǎo)致顯著成分變化的工藝環(huán)節(jié)，需對(duì)中間體進(jìn)行全成分分析。提取環(huán)節(jié)將化學(xué)成分從藥材轉(zhuǎn)移至溶劑，故提取液是物質(zhì)傳遞規(guī)律研究的起點(diǎn)。提取液中化學(xué)成分可分為植物初級(jí)代謝產(chǎn)物、植物次級(jí)代謝產(chǎn)物和無(wú)機(jī)鹽離子3 大類，其中初級(jí)代謝產(chǎn)物的含量最高，包括氨基酸、小分子有機(jī)酸、核苷等化合物。目前報(bào)道的定量方法，均以藥效相關(guān)的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物為主[13-17]，全成分視角尚且欠缺。

本研究基于1H-qNMR 技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)對(duì)其提取液中17 種化學(xué)成分準(zhǔn)確定量的方法。該方法檢測(cè)時(shí)間短、制樣方式簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)更全面的定量分析，為CEJ 的生產(chǎn)過(guò)程物質(zhì)轉(zhuǎn)移規(guī)律研究打下基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bruker Avance III 600 型核磁共振光譜儀，德國(guó)布魯克公司，配24 位自動(dòng)進(jìn)樣器與5 mm BBO 探頭，Topspin 工作站；XS105 型電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；5425 型高速離心機(jī)、Multipette M4 手動(dòng)連續(xù)分液器、Research plus移液器，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 試藥

3 批CEJ 的4 味藥材提取液樣本（中間體）由東阿阿膠股份有限公司提供，批號(hào)分別為1907075、1909010、2020616。3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉（TSP，批號(hào)SZBA183XV，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、氘代水（D2O，氘質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%）、纈氨酸（批號(hào)P500172，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%）、異亮氨酸（批號(hào)P500099，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%）、丙氨酸（批號(hào)P500110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%）、蘇氨酸（批號(hào)P500242，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、γ-氨基丁酸（批號(hào)BCCC4017，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、焦谷氨酸（批號(hào)BCCB9703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、丙酮酸（批號(hào)G2119085，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，20 ℃下密度1.267 g/mL）、尿苷（批號(hào)SLCB8621，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。乳酸（批號(hào)200617，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.30%）、乙酸鈉（批號(hào)190810，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.80%）、檸檬酸（批號(hào)211019，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.80%）、琥珀酸（批號(hào)200524，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.61%）、氯化膽堿（批號(hào)201028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.53%）、葡萄糖（批號(hào)200323，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.80%）、果糖（批號(hào)210519，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.80%）、蔗糖（批號(hào)190825，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.83%）、半乳糖（批號(hào)191016，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.37%）、富馬酸（批號(hào)190914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.47%）、甲酸鈣（批號(hào)200805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.35%）均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。去離子水由純化水系統(tǒng)Milli-Q Synthesis（美國(guó)Millipore 公司）制備得到。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

精確稱取50 mg TSP 于100 mL 量瓶中，用D2O定容至刻度，混合均勻，得到含0.5 mg/mL TSP 的D2O 溶液。將提取液11 000 r/min 離心13 min，取上清，與水以體積比1∶5 混合得到樣品液。精密移取540 μL 樣品液與60 μL 含0.5 mg/mL TSP 的D2O溶液混合均勻，并轉(zhuǎn)移入5 mm 標(biāo)準(zhǔn)核磁管中，即得NMR 樣品。

2.2 分析參數(shù)

使用Bruker Avance III 600 型核磁共振光譜儀記錄所有樣品的1H-NMR 圖譜，光譜儀頻率為600.13 MHz，測(cè)定溫度為298 K。采用脈沖序列zg30優(yōu)化中心頻率（O1），采用水信號(hào)預(yù)飽和脈沖序列Noesygppr1d 采集樣品的1H-NMR 圖譜。

具體采集參數(shù)如下：采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)32 768，譜寬（SW）7 211.539 Hz，中心頻率（O1）2 828.63 Hz，90°脈沖寬度（P1）14.40 μs，弛豫延遲時(shí)長(zhǎng)（D1）15.00 s，混合時(shí)間（D8）0.05 s，采集時(shí)間（AQ）2.27 s，接收器增益（RG）為50.8，掃描次數(shù)（NS）為32，空掃次數(shù)（DS）為4。

2.3 數(shù)據(jù)處理

在TopSpin 3.6.5（Bruker Bio Spin）工作站中對(duì)得到的1H-NMR 圖譜進(jìn)行初步處理。首先用窗口函數(shù)并進(jìn)行傅里葉變換，其中窗口函數(shù)選擇指數(shù)函數(shù)模式，線寬（LB）取0.3 Hz。以TSP 信號(hào)峰（δ0.00）為參考，校正化學(xué)位移，并進(jìn)一步進(jìn)行手動(dòng)相位校正和基線校正。

將完成上述處理的圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MestReNova 14.0.0（Mestrelab Research S.L.）軟件中。首先進(jìn)行多點(diǎn)基線校正，算法選擇Smooth Segments，再用“線性擬合”方法對(duì)定量峰和內(nèi)標(biāo)峰（TSP）進(jìn)行積分，后根據(jù)式（1）計(jì)算各待測(cè)成分質(zhì)量濃度[18]。

Cx和CTSP分別是待測(cè)化學(xué)成分和內(nèi)標(biāo)TSP 的質(zhì)量濃度，Ax和ATSP分別是待測(cè)化學(xué)成分和內(nèi)標(biāo)TSP 的特征峰面積，Nx和NTSP分別是待測(cè)化學(xué)成分和內(nèi)標(biāo)TSP 的特征峰質(zhì)子數(shù)，Mx和MTSP分別是待測(cè)化學(xué)成分和內(nèi)標(biāo)TSP 的相對(duì)分子質(zhì)量

2.4 圖譜信號(hào)峰指認(rèn)與定量峰選擇

前期對(duì)紅參、黨參、熟地黃和山楂分別進(jìn)行了水提，并采集1H-NMR 圖譜進(jìn)行定性分析。本研究通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)合前期定性分析結(jié)果，初步確定中間體的化學(xué)成分組成。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Metabolome Database，https://hmdb.ca/）檢索以及標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比對(duì)的方式，進(jìn)行中間體的核磁譜峰歸屬，最后通過(guò)對(duì)照品加標(biāo)法對(duì)指認(rèn)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。從1H-NMR 圖譜（圖1）中共歸屬出22 種化合物，包括7 種氨基酸（峰1 亮氨酸、峰3 異亮氨酸、峰2 纈氨酸、峰5 蘇氨酸、峰6 丙氨酸、峰8焦谷氨酸、峰9 γ-氨基丁酸），7 種小分子有機(jī)酸（峰4 乳酸、峰7 乙酸根、峰11 琥珀酸根、峰12 檸檬酸根、峰10 丙酮酸根、峰21 富馬酸根、峰22 甲酸根），6 種糖類（峰14 葡萄糖、峰16 果糖、峰17 蔗糖、峰18 半乳糖、峰15 甘露三糖、峰19 水蘇糖）和2 種核苷類成分（峰13 膽堿、峰20 尿苷）。譜峰指認(rèn)結(jié)果見(jiàn)圖1，各化合物按峰化學(xué)位移順序進(jìn)行編號(hào)。

圖1 CEJ 中間體的1H-NMR 譜峰指認(rèn)Fig.1 Signal identification of 1H-NMR spectrum of intermediate of CEJ

逐一為成功歸屬的化合物選定定量峰。為保證定量結(jié)果的可靠性，要求定量峰的信噪比不小于10。最理想的定量峰應(yīng)不與其他無(wú)關(guān)化合物峰重疊。由于中藥為復(fù)雜混合物，常含有十余種甚至數(shù)十種組分，導(dǎo)致1H-NMR 圖譜較為擁擠，實(shí)際定量工作中難以找到最理想的定量峰。對(duì)于重疊部分少的峰，若其積分受到的干擾非常小，則亦可選為定量峰。若化合物有多組峰，則優(yōu)先選擇響應(yīng)更高的峰作為定量峰。葡萄糖、果糖、半乳糖在水溶液中存在不同構(gòu)型，不同構(gòu)型間會(huì)相互轉(zhuǎn)化且處于動(dòng)態(tài)平衡之中。為得到可靠的定量結(jié)果，以不同構(gòu)型對(duì)應(yīng)峰的峰面積之和來(lái)進(jìn)行計(jì)算[19-20]。發(fā)現(xiàn)β-半乳糖對(duì)應(yīng)的δ4.58 處的雙峰受水峰壓制影響，出現(xiàn)了嚴(yán)重的峰形扭曲，且存在較多重疊，無(wú)法用于定量。因此，選擇α-半乳糖對(duì)應(yīng)的δ5.27 處的雙峰作為定量峰。本研究在相同條件下分析已知準(zhǔn)確質(zhì)量濃度的D-半乳糖溶液，通過(guò)式（2）換算，得出該定量峰實(shí)際對(duì)應(yīng)的質(zhì)子數(shù)，用于后續(xù)計(jì)算。最終為17 個(gè)化合物選定定量峰，各定量峰的峰型及位置如圖2 所示，具體參數(shù)以及化學(xué)結(jié)構(gòu)中對(duì)應(yīng)的氫原子見(jiàn)表1 和圖3，同一化合物編號(hào)與圖1 相同。

表1 定量峰的具體參數(shù)Table 1 Parameters of quantitative peaks

圖2 17 種化學(xué)成分定量峰Fig.2 Quantitative peaks of 17 chemical components

圖3 定量峰在化學(xué)結(jié)構(gòu)中對(duì)應(yīng)的氫原子Fig.3 Corresponding protons in structures of quantitative peaks

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 將纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸鈉、γ-氨基丁酸、焦谷氨酸、琥珀酸、氯化膽堿、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、尿苷、富馬酸、甲酸鈣對(duì)照品置于裝有五氧化二磷（P2O5）的干燥器中，減壓干燥24 h 以上。精密稱取一定量的對(duì)照品，用去離子水定容，得到相應(yīng)的對(duì)照品母液；移取一定體積的丙酮酸液體，用去離子水定容得到母液。設(shè)置7 檔質(zhì)量濃度梯度，取上述對(duì)照品母液以及去離子水配制不同質(zhì)量濃度梯度的樣品液。將樣品液與“2.1”項(xiàng)配制的含0.5 mg/mL TSP 的D2O溶液以體積比9∶1 混合得到待測(cè)樣品。

按“2.2”項(xiàng)所述參數(shù)采集樣品的1H-NMR 圖譜，并對(duì)目標(biāo)成分的特征峰進(jìn)行積分。以對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y），以待測(cè)樣品中對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸。得到的17 個(gè)成分回歸方程見(jiàn)表2，相關(guān)系數(shù)（r）均不小于0.999 5，證明該方法線性關(guān)系良好。

2.5.2 檢測(cè)限與定量限 以化合物定量峰響應(yīng)為3倍信噪比時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，10 倍信噪比時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限。信噪比的計(jì)算利用MestReNova 14.0.0 軟件完成，其中每個(gè)成分均取3 次結(jié)果的平均數(shù)。各成分的檢測(cè)限與定量限結(jié)果如表2 所示。

2.5.3 精密度 隨機(jī)取一批（批號(hào)1909010）中間體，按“2.1”項(xiàng)所述方法制備1 份供試樣品，連續(xù)采集6 張1H-NMR 圖譜，按“2.3”項(xiàng)所述方法進(jìn)行圖譜處理，并計(jì)算目標(biāo)成分質(zhì)量濃度。精密度結(jié)果用6 組質(zhì)量濃度計(jì)算值的RSD 表示，結(jié)果見(jiàn)表2。各成分的結(jié)果均小于2.7%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性 隨機(jī)取一批（批號(hào)1909010）中間體，按“2.1”項(xiàng)所述方法平行制備6 份供試樣品，分別采集1H-NMR 圖譜，按“2.3”項(xiàng)所述方法進(jìn)行圖譜處理，并計(jì)算目標(biāo)成分質(zhì)量濃度。重復(fù)性結(jié)果用6 組質(zhì)量濃度計(jì)算值的RSD 表示，結(jié)果見(jiàn)表2。各成分的結(jié)果均小于2.5%，證明制樣重復(fù)性良好。

2.5.5 耐用性 隨機(jī)取一批（批號(hào)2020616）中間體，按“2.1”項(xiàng)所述方法制備1 份供試樣品，分別于296.5、297.0、297.5、298.0、298.5、299.0 K 溫度下進(jìn)行分析，按“2.3”項(xiàng)所述方法進(jìn)行圖譜處理，并計(jì)算目標(biāo)成分質(zhì)量濃度。方法耐用性結(jié)果用6 組質(zhì)量濃度計(jì)算值的RSD 表示，結(jié)果見(jiàn)表2。各成分的結(jié)果均小于2.6%，證明分析溫度在296.5～299.0 K 波動(dòng)時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響。

2.5.6 穩(wěn)定性 隨機(jī)取一批（批號(hào)1909010）中間體，按“2.1”項(xiàng)所述方法制備1 份供試樣品，在室溫下保存，分別于第0、2、4、8、12、24 小時(shí)采集1H-NMR 圖譜，按“2.3”項(xiàng)所述方法進(jìn)行圖譜處理，并計(jì)算目標(biāo)成分質(zhì)量濃度。樣品穩(wěn)定性結(jié)果用6 組質(zhì)量濃度計(jì)算值的RSD 表示，結(jié)果見(jiàn)表2。各成分的結(jié)果均小于2.6%，說(shuō)明樣品溶液在室溫下存放24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 準(zhǔn)確度 本研究通過(guò)2 種方式考察準(zhǔn)確度。首先是加樣回收試驗(yàn)，取已完成定量分析的批次（批號(hào)1909010），分別加入相當(dāng)于原樣品質(zhì)量濃度80%、100%、120%的待測(cè)成分對(duì)照品，記為低、中、高質(zhì)量濃度組，每組平行制備3 份樣品進(jìn)行分析。按“2.3”項(xiàng)所述方法進(jìn)行圖譜處理，并計(jì)算目標(biāo)成分質(zhì)量濃度。各成分的最終回收率結(jié)果取3 份的平均值，并計(jì)算RSD，如表2 所示。各成分的平均加樣回收率在90.0%～105.0%，RSD 小于2.2%，證明方法分析準(zhǔn)確度良好。

其次，將分析值與參考值作比，以考察所提出方法的分析準(zhǔn)確度。將纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸鈉、γ-氨基丁酸、焦谷氨酸、琥珀酸、氯化膽堿、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、尿苷、富馬酸、甲酸鈣對(duì)照品置于裝有P2O5的干燥器中，減壓干燥24 h 以上。精密稱取一定量的對(duì)照品，用去離子水定容得到相應(yīng)的對(duì)照品母液；移取一定體積的丙酮酸液體，用去離子水定容得到母液。設(shè)置高、中、低3 檔質(zhì)量濃度，取上述對(duì)照品母液以及去離子水配制不同質(zhì)量濃度的樣品液，以配制質(zhì)量濃度為參考值。

將樣品液與“2.1”項(xiàng)配制的含0.5 mg/mL TSP的D2O 溶液以體積比9∶1 混合得到待測(cè)樣品。按“2.2”項(xiàng)所述參數(shù)采集樣品的1H-NMR 圖譜，并按“2.3”項(xiàng)所述進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出分析值。將分析值與參考值進(jìn)行比較，結(jié)果用平均相對(duì)偏差（RD）表示，RD 值的計(jì)算式如式（3）所示，其中c和cr分別為分析值和參考值。結(jié)果纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸根、γ-氨基丁酸、丙酮酸根、焦谷氨酸、琥珀酸根、膽堿、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、尿苷、富馬酸根、甲酸根的RD 分別為3.38%、3.43%、2.21%、2.77%、3.15%、3.32%、3.75%、3.28%、3.94%、2.89%、3.90%、1.69%、1.52%、3.89%、3.00%、3.49%、3.55%，結(jié)果顯示，各成分的RD 值均在4.0%以內(nèi)，證明方法分析準(zhǔn)確度良好。

2.6 樣本測(cè)定

對(duì)3 批CEJ 中間體樣本進(jìn)行檢測(cè)，各項(xiàng)測(cè)定結(jié)果均高于定量限，且滿足線性范圍。17 個(gè)化合物的定量結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3 批CEJ 中間體中17 種化學(xué)成分的1H-qNMR 方法定量結(jié)果Table 3 Quantitative results of 17 chemical components in three batches of intermediate of CEJ

3 批中間體樣本中，大多組分的質(zhì)量濃度在0.1～1.0 mg/mL，質(zhì)量濃度最低的是異亮氨酸，最高的是果糖。質(zhì)量濃度低于0.1 mg/mL 的有纈氨酸、異亮氨酸和富馬酸根。4 種糖類成分的質(zhì)量濃度均大于1.0 mg/mL，其中葡萄糖、果糖質(zhì)量濃度均大于15.0 mg/mL。

為評(píng)價(jià)該方法可定量成分總量，用干燥衡重法測(cè)定了3 批中間體的總固體含量，并計(jì)算可定量成分在總固體含量中的質(zhì)量占比。結(jié)果見(jiàn)表4，3 批中間體可定量成分的質(zhì)量占比分別為71.09%、84.44%、70.09%。另分別計(jì)算了氨基酸、小分子有機(jī)酸、糖類和核苷4 類成分的質(zhì)量占比。結(jié)果顯示，糖類的質(zhì)量占比均高于65%，為CEJ 中間體中的主要成分，其余可定量成分質(zhì)量占比不足5%。

表4 各類可定量成分質(zhì)量濃度在總固體中的占比Table 4 Proportion of mass concentration of various measurable components in total solids

3 討論

為證明所提出1H-qNMR 方法的可靠性，進(jìn)行了一系列方法學(xué)考察。線性考察旨在評(píng)價(jià)測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度成比例關(guān)系的程度，以相關(guān)系數(shù)為指標(biāo)。精密度考察旨在評(píng)價(jià)多次測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度，重復(fù)性考察評(píng)價(jià)的是多次制樣對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，耐用性考察評(píng)價(jià)采集溫度發(fā)生變動(dòng)時(shí)測(cè)定結(jié)果受影響的程度，穩(wěn)定性考察評(píng)價(jià)樣品在室溫條件下存放時(shí)長(zhǎng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，上述3項(xiàng)考察均以分析值的RSD 作為指標(biāo)。準(zhǔn)確度考察評(píng)價(jià)的是方法測(cè)定結(jié)果與實(shí)際值或參考值接近的程度，此處采用兩種方式進(jìn)行考察，其一為加樣回收實(shí)驗(yàn)，以回收率作為指標(biāo)；其二是通過(guò)配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到參考值，計(jì)算分析值與參考值的RD 值來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

成功歸屬出的22 種化合物中，17 種（如表1所列）得到了理想的方法學(xué)考察結(jié)果，證明所提出方法可行且可靠。余下5 種化合物中，亮氨酸、蘇氨酸、檸檬酸根均譜峰重疊相對(duì)嚴(yán)重，無(wú)法選定合適的定量峰，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行定量；甘露三糖和水蘇糖雖分別選定了重疊最少的峰作為定量峰，但是在加樣回收實(shí)驗(yàn)中得出的回收率非常糟糕，無(wú)法通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，故無(wú)法準(zhǔn)確定量。這一結(jié)果說(shuō)明所選擇的定量峰不夠合理，峰重疊程度對(duì)積分產(chǎn)生了過(guò)大負(fù)面影響。

樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，批號(hào)2020616 的糖類質(zhì)量濃度明顯低于另2 批，其中果糖質(zhì)量濃度約為另2批的70%，葡萄糖質(zhì)量濃度約為另2 批的58%。化學(xué)成分的組成和含量決定了提取液的物理屬性情況，由批號(hào)2020616 樣本糖類含量最低可以推測(cè)其密度最低，該推論與實(shí)際密度測(cè)定結(jié)果相符。在藥典中，密度為提取液、浸膏的檢查項(xiàng)之一。由此展望，全面成分定量有望成為提取液、浸膏化學(xué)組成與關(guān)鍵物理屬性關(guān)系發(fā)現(xiàn)研究的基礎(chǔ)工作。

與目前廣泛應(yīng)用的基于液相色譜技術(shù)的定量方法相比，1H-qNMR 方法的分析范圍更廣，且一次檢測(cè)可定量的成分?jǐn)?shù)目更多，更適合混合物高效分析；檢測(cè)快捷，檢測(cè)單個(gè)樣本的儀器占用時(shí)間在10 min以內(nèi)，對(duì)高通量分析友好；定量無(wú)需建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，大大減少對(duì)照品和有機(jī)溶劑的消耗，在降低時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本的同時(shí)更加環(huán)保。目前1H-qNMR 方法推廣的主要阻力來(lái)自核磁波譜儀的高昂成本，設(shè)備共享平臺(tái)的構(gòu)建是一種解決方案。方法的局限性在于靈敏度相對(duì)較低，且NMR 技術(shù)不具備分離混合物的能力，化合物頻域峰重疊會(huì)對(duì)定性和定量造成負(fù)面影響。如將低含量的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物以及個(gè)別由于頻域峰重疊導(dǎo)致無(wú)法正常進(jìn)行核磁定量的成分利用色譜或質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行定量，則能彌補(bǔ)上述局限，從而實(shí)現(xiàn)真正的全成分定量分析，有望拓寬1H-qNMR 技術(shù)的適用范圍。

綜上所述，本研究基于1H-qNMR 技術(shù)開(kāi)發(fā)了CEJ 中間體的定量分析方法，能同時(shí)定量17 種成分，包括4 種氨基酸、7 種小分子有機(jī)酸、4 種糖類以及2 種核苷，具有耗時(shí)短、定量信息全面、環(huán)境友好等特點(diǎn)，能作為CEJ 生產(chǎn)過(guò)程物質(zhì)傳遞規(guī)律研究的基礎(chǔ)工作，對(duì)實(shí)現(xiàn)制藥全過(guò)程控制有積極意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突