基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究趕黃草保肝潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制

田海濤，蔡春穎，趙東升，張龍霏，鄧志鵬

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

趕黃草又名水澤蘭、水楊柳，為趕黃草屬PenthorumGronov.ex L.植物扯根菜Penthorum chinensePursh 的干燥地上部分，主要分布在我國華北、華東、中南及陜西、四川和貴州等地，其中四川古藺是其主要產(chǎn)地[1]。趕黃草先后被《重慶市中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2022 年版第一批）》《四川省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2010 版）》《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2009 年版）》所收載，為苗族傳統(tǒng)用藥，在保肝方面發(fā)揮著重要作用，常用于治療各種肝病。現(xiàn)代藥理研究表明其具有治療肝損傷、抑制肝纖維化和肝硬化、治療慢性活動性肝炎等作用[2-3]，其單方制劑肝蘇顆粒常用于治療膽囊炎、黃疸、非酒精性及酒精性脂肪肝和感染性肝炎，具有良好的臨床療效。趕黃草中含有黃酮、木脂素、有機(jī)酸、苯丙素類等多種活性成分，其中黃酮和木酯素是最趕黃草中含量較高的成分，且研究顯示趕黃草中的黃酮和木酯素成分具有顯著保肝活性[4-5]。

本實驗通過檢索文獻(xiàn)構(gòu)建趕黃草化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫[6-8]，運(yùn)用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術(shù)分析趕黃草信息，部分成分用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對驗證，其余成分通過保留時間及二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比推斷確認(rèn)，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探究趕黃草保肝作用靶點及作用機(jī)制。本研究結(jié)果對趕黃草的質(zhì)量控制及藥效機(jī)制研究有一定的推動作用，為趕黃草藥材的研究開發(fā)提供一定實驗依據(jù)與參考。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，Thermo Fisher，美國）；乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；槲皮苷（批號PCS-210509）、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷（批號PCS-210609）、槲皮素（批號PCS-210921）、芹菜素（批號PCS-210513）、蘆?。ㄅ朠CS-210717）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（批號PCS-211209）、山柰素（批號PCS-220321）、趕黃草苷A（批號PCS-210920）、趕黃草苷B（批號PCS-220716）、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷（批號PCS-211109）、阿福豆苷（批號PCS-210911）、山柰酚（批號PCS-211208）、原兒茶酸（批號PCS-211009）、喬松素-7-O-β-D葡萄糖苷（批號PCS-211120）、兒茶素（批號PCS-211018）、沒食子酸（批號PCS-210710）、喬松素（批號PCS-220316）對照品均購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%；趕黃草（批號YL-772-2202-001）藥材購自安徽賀林中藥飲片科技有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為虎耳草科植物扯根菜P.chinesePursh 的干燥地上部分。

1.2 儀器

超高壓液相串聯(lián)Ultimate 3000-Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜（Thermo Fisher Scientific，美國）；Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm；Phenomenex，美國）；ES-E120B 型電子分析天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；Legend micro 17 微量離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；PL-S20 超聲波清洗器（東莞康士潔超聲波科技有限公司）；YRE-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DLSB-Z C 型低溫循環(huán)真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/index.php），PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org/），GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/），治療靶點數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD，http://bidd.group/index.html/）；UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，http://www.rcsb.org/）；Cytoscape 3.7.2軟件；AutoDockTools1.5.6 軟件；AutoDockvina 插件；PyMOL 2.5.4 軟件；ChemDraw Professional 15.1軟件，Open Babel GUI 軟件。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

分別取趕黃草全草（含莖、葉、花）、莖、葉各50 g，切碎，加水煎煮3 次，每次加藥材量10 倍水煎煮2 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮，冷卻，加乙醇使含醇量達(dá)60%，攪拌，靜置，濾過，沉淀用60%乙醇洗滌3 次，合并洗液與濾液，回收乙醇并濃縮至稠膏。稠膏經(jīng)干燥后，稱取500 mg 提取物溶于20 mL 60%甲醇中。所得樣品溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過后進(jìn)樣分析。

2.2 對照品溶液的制備

取槲皮苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮素、芹菜素、蘆丁、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山柰素、趕黃草苷A、趕黃草苷B、山柰素-3-O-阿拉伯糖苷、阿福豆苷、山柰酚、原兒茶酸、喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、兒茶素、沒食子酸、喬松素對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成槲皮苷1.12 mg/mL、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷 1.79 mg/mL、槲皮素 3.76 mg/mL、芹菜素1.21 mg/mL、蘆丁1.63 mg/mL、槲皮素-3-O-鼠李糖苷 1.67 mg/mL、山柰素 1.20 mg/mL、趕黃草苷A 1.56 mg/mL、趕黃草苷B 1.21 mg/mL、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷3.38 mg/mL、阿福豆苷1.25 mg/mL、山柰酚1.10 mg/mL、原兒茶酸2.34 mg/mL、喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷 1.13 mg/mL、兒茶素1.28 mg/mL、沒食子酸1.83 mg/mL、喬松素1.83 mg/mL 單標(biāo)溶液，從各單標(biāo)溶液中吸取10 μL 混合配制成混標(biāo)溶液。

2.3 質(zhì)譜檢測方法

2.3.1 色譜條件 Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相：0.05%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，5%～40% B；30～35 min，40%～80% B；35～40 min，80% B；40～40.2 min，80%～5% B；40.2～45 min，5% B）；體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量3.0 μL；柱溫30 ℃；自動進(jìn)樣器溫度4 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子電離模式，噴霧電壓為3.5 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓w積流量分別為10.5、3.0 L/min。分辨率70 000 進(jìn)行全掃描，掃描范圍m/z80～1200，質(zhì)譜掃描時間40 min。

2.4 趕黃草數(shù)據(jù)庫創(chuàng)建和分析

查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)資料以及檢索PubChem 數(shù)據(jù)庫、進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，整理趕黃草藥材所含的化學(xué)成分信息，包括化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)式、分子量等，構(gòu)建趕黃草化學(xué)成分專屬數(shù)據(jù)庫，共收集整理105 種化合物。UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 獲得色譜峰一級、二級質(zhì)譜，利用Thermo Scientific Xcalibur 軟件計算出高分辨精確相對分子質(zhì)量，快速推測各色譜峰對應(yīng)化合物的分子式，并與部分對照品的保留時間及二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，運(yùn)用ChemDraw 軟件繪制化合物結(jié)構(gòu)并模擬碎片情況，與文獻(xiàn)二級碎片進(jìn)行對照，推斷確認(rèn)成分。

2.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)趕黃草保肝機(jī)制預(yù)測

將鑒別的化合物依次輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫，依據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 篩選活性成分，TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未收載成分結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)一步篩選活性成分。運(yùn)用PubChem 數(shù)據(jù)庫查找活性成分SMILES 結(jié)構(gòu)，將活性成分SMILES 結(jié)構(gòu)輸入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測成分靶點，合并去重后得到趕黃草活性成分靶點。通過OMIM 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（Score≥5）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（Score≥0.1）、TTD 數(shù)據(jù)庫檢索“hepatitis”與“hepatic injury”關(guān)鍵詞，獲取肝炎、肝損傷相關(guān)疾病靶點，合并去重后得到疾病靶點。運(yùn)用微生信平臺（https://bioinformatics.com.cn/）取疾病靶點與化合物靶點交集，將交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，評分條件設(shè)定為置信度＞0.7，獲得靶點間相互作用關(guān)系并導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)，同時計算degree 值，按照degree＞20 條件篩選獲得核心靶點。將核心靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，運(yùn)用微生信平臺實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化，并利用Cytoscape 3.2.1 軟件進(jìn)行拓?fù)溆嬎?，進(jìn)一步篩選活性成分，構(gòu)建“活性成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2.6 分子對接

將篩選出的活性成分與核心靶點依次進(jìn)行分子對接。運(yùn)用PubChem 數(shù)據(jù)庫查找下載活性成分3D結(jié)構(gòu)sdf 格式文件，進(jìn)一步采用Open Babel GUI 軟件將sdf 格式文件轉(zhuǎn)化為pdbqt 格式文件。在PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白3D 結(jié)構(gòu)pdb 格式文件。進(jìn)一步使用Autodock Tools 1.5.6 對蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行加氫、除水等處理并保存為pdbqt 格式。運(yùn)用Autodock vina 對活性成分和核心靶點對接打分，采用PyMOL 2.5.4 制作活性成分與核心靶點的結(jié)合模式圖。

3 結(jié)果

3.1 趕黃草化學(xué)成分鑒定

通過UPLC-Q-Exactive-MS 方法，在上述色譜和質(zhì)譜條件下對趕黃草全草、莖、葉進(jìn)樣分析，得到樣品正、負(fù)離子掃描模式的總離子流圖，見圖1。采用一級質(zhì)譜全掃描和提取離子峰的方法，確定了趕黃草全草、莖、葉中64 個色譜峰（表1），其中確定49 個化合物，還有pinocembrin-7-O-[3′′-Ogalloyl]-glucoside 及同分異構(gòu)體共5 個、趕黃草素A、趕黃草素B、趕黃草酮C、趕黃草酮D 及同分異構(gòu)體共6 個、2′,6′-dihydroxydihydrochalcone-4′-O-[3′′-O-galloyl]-glucoside 及同分異構(gòu)體共4 個。經(jīng)過與對照品的保留時間、精準(zhǔn)相對分子質(zhì)量比較，準(zhǔn)確鑒定出14 個化合物（趕黃草苷A、趕黃草苷B、阿福豆苷、兒茶素、槲皮素、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮苷、蘆丁、沒食子酸、喬松素、喬松素-7-Oβ-D-葡萄糖苷、芹菜素、山柰酚、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷）；通過與文獻(xiàn)研究提供的保留時間、相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)式、離子碎片，推測了其他35 個化合物結(jié)構(gòu)。49 個化合物包括黃酮、有機(jī)酸、木脂素、苯丙素類化合物。

表1 趕黃草化學(xué)成分UPLC-Q-Exactive-MS 色譜/質(zhì)譜信息Table 1 Chromatographic and MS information of chemical composition of P.chinense by UPLC-Q-Exactive-MS

圖1 趕黃草總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of P.chinense

3.1.1 黃酮類成分質(zhì)譜解析 黃酮類化合物在趕黃草中數(shù)量較多，主要為槲皮素、喬松素和山柰酚的衍生物，質(zhì)譜裂解容易發(fā)生脫糖基、脫水、環(huán)裂解。正負(fù)離子掃描模式下，槲皮素在19.61 min 產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子m/z301.035 0 [M－H]?和m/z303.049 7[M＋H]+，與槲皮素對照品一致?；衔?3、16、18、20、22、24、25 均為槲皮素糖苷類化合物，正離子模式下產(chǎn)生m/z303 碎片離子（槲皮素苷元），負(fù)離子模式下產(chǎn)生m/z301 碎片離子（槲皮素苷元）。其中化合物16 保留時間為12.36 min，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子[M＋H]+m/z611.160 5（C27H31O16）和 [M－H]?m/z609.146 4（C27H29O16），與對照品比對確定為蘆丁?；衔?4 保留時間為14.73 min，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子[M＋H]+m/z449.107 4（C21H21O11）和 [M－H]?m/z447.093 7（C21H19O11），與對照品比對確定為槲皮苷?；衔?0 和22 為同分異構(gòu)體，正負(fù)離子模式下均產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子 [M＋H]+m/z435.092 2（C20H19O11）和 [M－H]?m/z433.077 6（C20H17O11），正負(fù)離子模式下均丟失m/z132 產(chǎn)生槲皮素苷元碎片離子，推測為分別丟失木糖或阿拉伯糖部分，對比相關(guān)文獻(xiàn)和對照品[7]，鑒定化合物20、22 分別為槲皮素-3-O-木糖苷和槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷。

化合物59 在30.64 min 處產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子m/z255.066 3 [M－H]?和m/z257.080 8 [M＋H]+，與喬松素對照品一致?；衔?5、46、55、56、60 均為喬松素糖苷類化合物，在正離子模式下產(chǎn)生m/z257碎片離子（喬松素苷元）、負(fù)離子模式下產(chǎn)生m/z255碎片離子（喬松素苷元）?；衔?5、55、60 保留時間、準(zhǔn)分子離子以及二級碎片離子與對照品一致，分別確定為喬松素-7-O-葡萄糖苷、趕黃草苷B、趕黃草苷A?；衔?6 在26.10 min 處產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子m/z721.140 0 [M＋H]+和m/z719.125 4 [MH]?，化合物56 在29.24 min 處產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子m/z873.150 9 [M＋H]+和m/z871.136 3 [M－H]?，正負(fù)離子模式下，2 個化合物均產(chǎn)生m/z303/301（六羥基二苯基）、m/z257/255（喬松素苷元）、m/z153/151特征離子，分別推測為 pinocembrin-7-O-[4′,6′-HHDP]-glucoside、PGHG。化合物42 在23.41 min產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子m/z271.096 2 [M＋H]+和m/z269.082 0 [M－H]?，產(chǎn)生m/z167/165 特征碎片，表明有甲基取代，推測為山姜素?；衔?7 保留時間15.84 min，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子 [M＋H]+m/z433.148 9(C22H25O9)，二級裂解失去葡萄糖基（162）生成m/z271.096 1 碎片離子，此外還產(chǎn)生m/z167.033 8 特征碎片離子，推測為山姜素-7-O-葡萄糖苷。

化合物41 在23.34 min 產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z287.055 0 [M＋H]+和m/z285.040 5 [M－H]?，與對照品比對確定為山柰酚?；衔?9、26、29 均為山柰酚糖苷類化合物，在正離子模式下產(chǎn)生m/z287 碎片離子（山柰酚苷元）、負(fù)離子模式下產(chǎn)生m/z285碎片離子（山柰酚苷元）?；衔?9、26、29 保留時間、準(zhǔn)分子離子以及二級碎片離子與對照品一致，分別確定為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷、阿福豆苷。

其他黃酮類有化合物5、23、34、37、39、44、49，其中化合物5、39 保留時間、準(zhǔn)分子離子以及二級碎片與對照品一致，確定為兒茶素和芹菜素?；衔?3、34、37、44、49 的準(zhǔn)分子離子以及二級碎片與文獻(xiàn)一致[6-7,9-10]，初步推測為柚皮素葡萄糖苷、芹菜苷、柚皮素、2',4',6'-trihydroydihydrochalcon-4'-glucoside、趕黃草苷。

3.1.2 木脂素類成分質(zhì)譜解析 化合物50、54 均產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子 [M＋H]+m/z343.117 3（C19H19O6），二級質(zhì)譜裂解產(chǎn)生m/z325 和m/z203 特征離子，結(jié)合文獻(xiàn)報道推測為趕黃草酮A 和趕黃草酮B[6]。

3.1.3 有機(jī)酸成分質(zhì)譜解析 化合物1、2、6、7、8、10、11、12、14、17 均為有機(jī)酸類化合物，化合物2 保留時間、準(zhǔn)分子離子以及二級碎片與對照品一致，確定為沒食子酸。化合物7 保留時間為6.94 min，產(chǎn)生 [M＋H]+m/z197.081 2（C10H13O4），二級質(zhì)譜裂解產(chǎn)生碎片m/z179（C10H11O3，[M＋HH2O]+），m/z151（C9H9O，[M＋H－H2O?CO2]+），推測為短葉蘇木酚?；衔? 保留時間為6.57 min，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子[M＋H]+m/z293.028 6（C13H9O8)，二級生成m/z247 [M＋H－HCOOH]+、m/z219 [M＋H－HCOOH－CO]+、m/z191 [M＋H－HCOOH－2CO]+碎片，與文獻(xiàn)報道一致[11]，推測為短葉蘇木酚酸?；衔?11 產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子 [M＋H]+m/z307.044 8（C14H11O8），較短葉蘇木酚酸多14，推測為甲基化物，在正離子模式下二級質(zhì)譜產(chǎn)生m/z247、219、191 碎片離子，推測為短葉蘇木酚酸甲酯?；衔?7 產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子 [M－H]?m/z319.045 9（C15H11O8），較短葉蘇木酚 [M－H]?m/z291.014 6酸多28，推測為乙基化物，根據(jù)碎片離子結(jié)合文獻(xiàn)報道推測為短葉蘇木酚酸乙酯[11]?；衔?、8、10、12、14 二級碎片與文獻(xiàn)記載進(jìn)行比對[6,12-14]，初步推測為柯子次酸、香草酸、云實素、丁香醛、鞣花酸。

3.1.4 苯丙素類成分質(zhì)譜解析 化合物15、30、31為苯丙素類化合物。化合物30、31 為同分異構(gòu)體，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子 [M ＋H]+m/z505.170 3（C25H29O11），二級碎片產(chǎn)生m/z325（C19H17O5，[M＋H－H2O－C6H10O5]+）和m/z203（C12H11O3）特征碎片，結(jié)合文獻(xiàn)報道[6]推測為 2,3'-dihydroxy-3-methoxy-6′-methanone-benzophenone-4-O-glucoside、2,4-dihydroxy-3-methoxy-6′-methanone-benzo-phenone-3'-O-glucoside。化合物15 產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子 [M－H]?m/z607.094 7（C26H23O17），二級碎片產(chǎn)生m/z437（C19H15O12，[M－H－C7H8O5]?）、m/z293（C12H10O8，[M－H－C14H13O9]?）特征峰，結(jié)合文獻(xiàn)報道[9]推測為趕黃草苷C。

3.1.5 其他化合物質(zhì)譜解析 化合物3、4、9、21、28、32、58，其中化合物3 在2.60 min 產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子m/z283.044 8（C12H11O8，[M＋H]+），二級碎片產(chǎn)生m/z237（C11H9O6，[M＋H－HCOOH]+）、m/z219（C11H7O5，[M＋H－H2O－HCOOH]+）、m/z191（C10H7O4，[M＋H－2HCOOH]+）的特征碎片，推測為penthorumnin B?；衔? 在8.35 min 處產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子m/z331.102 4（C14H19O9，[M＋H]+），二級碎片產(chǎn)生m/z169（C8H9O4，[M＋H－C6H10O5]+）、m/z151（C8H7O3，[M＋H－H2O－C6H10O5]+）的特征碎片，推測為2,6-二羥基苯乙酮-4-O-葡萄糖苷?；衔?、21、28、32、58 二級碎片與文獻(xiàn)記載對比[6,15]，初步推測為巖白菜素、2,6-二羥基苯乙酮-5-(2′-亞甲基-2(5H)-呋喃酮)-4-O-葡萄糖苷、2,6-二羥基苯乙酮-4-O-[4′,6′六羥基聯(lián)苯二?；鵠?葡萄糖苷、penthorumnin C、2-hydroxyacetophenone-4-O-[4′,6′-hexahydroxydiphenoyl]?glucoside。

3.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)趕黃草保肝作用機(jī)制預(yù)測

3.2.1 趕黃草活性成分篩選及其靶點預(yù)測 將上述49 個確定化合物輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫，依據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 篩選活性成分，數(shù)據(jù)庫中未收載成分根據(jù)文獻(xiàn)報道進(jìn)一步篩選，得到活性成分28 個。將篩選出的活性成分輸入PubMed 數(shù)據(jù)庫查詢活性成分SMILES 結(jié)構(gòu)，將SMILES 結(jié)構(gòu)輸入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測成分靶點，合并去重后得到趕黃草活性成分靶點335 個。

3.2.2 疾病靶點獲取 通過 OMIM 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（Score≥5）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（Score≥0.1）、TTD 數(shù)據(jù)庫檢索“hepatitis”與“hepatic injury”關(guān)鍵詞，獲取肝炎、肝損傷相關(guān)疾病靶點，將4 個數(shù)據(jù)庫所得靶點合并后刪除重復(fù)項，獲得靶點1 554 個。運(yùn)用微生信平臺取疾病靶點與化合物靶點交集，獲得交集靶點126 個，作為進(jìn)一步分析的潛在作用靶點（圖2）。

圖2 成分靶點與疾病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of component target and disease target

3.2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將126 個交集靶點導(dǎo)入String11.5 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置關(guān)聯(lián)評分0.7，導(dǎo)出原始PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）并下載TSV 文件，將TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件，構(gòu)建靶點PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4）。結(jié)果顯示有118 個節(jié)點（去除8 個孤立節(jié)點），710 條邊，節(jié)點顏色越深，代表度值越大，說明該節(jié)點與其他蛋白相互作用多。以度值中位數(shù)的2 倍為界限篩選出24 個核心靶點，核心靶點具體信息見表2。

表2 24 個核心靶點具體信息Table 2 Specific information of 24 core targets

圖3 交集靶點原始PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Original PPI network of intersection target

圖4 交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of intersection target

3.2.4 富集分析結(jié)果 將 24 個核心靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析根據(jù)FDR≤0.05 篩選得到163 個GO 條目，其中生物學(xué)過程（bioprogress，BP）條目122 個，包括蛋白激酶B 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶信號、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等方面；15個細(xì)胞組分（cell components，CC）條目，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、質(zhì)膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等方面；分子功能（molicular function，MF）條目26 個，包括激酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等方面。取各項前20 條導(dǎo)入微生信平臺進(jìn)行可視化展示（圖5）。KEGG 通路根據(jù)FDR≤0.05 篩選得到131 條通路，主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、內(nèi)分泌抵抗、癌癥信號通路、HIF-1 信號通路等，取前20條信號通路進(jìn)行可視化分析（圖6）。

圖6 KEGG 通路富集分析結(jié)果Fig.6 KEGG enrichment analysis results

3.2.5 “活性成分-靶基因-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將28個活性成分、24 個核心靶點、KEGG 信號通路富集分析的前20 條通路導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建“活性成分-靶基因-通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，見圖7。通過“Analyze Network”分析網(wǎng)絡(luò)圖，得到60個節(jié)點，359 條邊，得到關(guān)鍵有效成分15 個（表3）。

表3 趕黃草關(guān)鍵有效成分Table 3 Key effective components of P.chinense

圖7 “活性成分-靶基因-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Network of “active component-target gene-pathway”

3.3 分子對接驗證

將篩選出的15 個關(guān)鍵有效成分與24 個核心靶點依次進(jìn)行分子對接，有效成分見表3。對接結(jié)果顯示，小于?5 kJ/mol 的結(jié)果占總數(shù)99.2%，?5～?7.0 kJ/mol 的結(jié)果占總數(shù)32.2%，小于?7.00 kJ/mol 的結(jié)果占總數(shù)的66.9%，關(guān)鍵有效成分與核心靶點結(jié)合能均小于?4.5 kJ/mol，顯示他們具有良好的結(jié)合活性。GAPDH、PIK3CA、MTOR、SRC、PIK3CD 與各成分均具有良好的結(jié)合活性，其中2′,4′,6′-三羥基二氫查耳酮-4′-β-D-葡萄糖苷可與GAPDH、MTOR、CASP3、SRC 相結(jié)合，與MTOR 結(jié)合能最低為?9.9 kJ/mol，作用位點是殘基谷氨酸49、半胱氨酸276、谷氨酰胺225、亮氨酸224；喬松素-7-O-葡萄糖苷可與GAPDH、MTOR、PIK3CA 相結(jié)合，與MTOR結(jié)合能為?9.0 kJ/mol，作用位點是精氨酸1945、亮氨酸1904、蘇氨酸1908；趕黃草苷可與GAPDH、PIK3CA、SRC、PIK3CD 相結(jié)合，與PIK3CA 結(jié)合能最低為?9.0 kJ/mol，作用位點是半胱氨酸838、谷氨酰胺630、天冬酰胺756；槲皮素3,4'-二葡糖苷可與GAPDH、PIK3CA、PIK3CD、MTOR 相結(jié)合，GAPDH 結(jié)合能最低為?11.3 kJ/mol，作用位點是天酰胺287、天冬酰胺239、蘇氨酸252、丙氨酸238；喬松素可與GAPDH、PIK3CA、PIK3CD 相結(jié)合，與PIK3CD 結(jié)合能為?8.2 kJ/mol，作用位點是蘇氨酸471；鞣花酸可與PIK3CA、GAPDH、MTOR 相結(jié)合，與GAPDH 結(jié)合能最低為?10.4 kJ/mol，作用位點是脯氨酸236、亮氨酸203、丙氨酸238、天冬氨酸239、天冬氨酸287，分子對接模式圖見圖8。

圖8 部分關(guān)鍵有效成分與核心靶點分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking diagram of some key active ingredients and core targets

4 討論

趕黃草是云貴川地區(qū)常用保肝藥材，其用藥歷史悠久，保肝療效顯著，在市場上已有單味藥成方的中成藥肝蘇制劑，現(xiàn)階段趕黃草研究報道相對較少，大部分集中在近十年，其相關(guān)研究尚不充分，中國藥典尚未收載趕黃草藥材。本實驗分析研究了趕黃草主要化學(xué)成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接探討了趕黃草保肝藥效物質(zhì)和潛在作用靶點及作用機(jī)制，為趕黃草進(jìn)一步研究開發(fā)提供一定的依據(jù)。

本實驗利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術(shù)對趕黃草中的化學(xué)成分進(jìn)行分析。通過對照品、保留時間、碎片信息、自建數(shù)據(jù)庫綜合識別了趕黃草水提物的化學(xué)成分，結(jié)果共鑒定出64 個色譜峰，49 個化合物。其中黃酮化合物有26 種，木脂素化合物2 種，有機(jī)酸化合物10 種，苯丙素類化合物4種，其它化合物7 種。對比趕黃草全草、莖、葉化學(xué)成分，三者化學(xué)成分種類相差較小，后續(xù)需要對部分化合物進(jìn)行定量，探究化合物含量差異，以期為趕黃草藥材加工炮制提供一定幫助。

本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分篩選出24 個核心靶點，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析計算的結(jié)果顯示：HSP90AA1、STAT3、SRC 為度值排名前3 的靶點蛋白。利用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建“活性成分-靶基因-通路”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步篩選出的15 個關(guān)鍵有效成分中有11 個黃酮類化合物，2 個木脂素類化合物，2 個有機(jī)酸類化合物，說明這3 類物質(zhì)可能是趕黃草主要保肝活性物質(zhì)。分子對接結(jié)果顯示，除沒食子酸外其余成分均與度值排名前3 的靶點蛋白有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，趕黃草活性成分發(fā)揮保肝作用的主要通路有HIF-1、PI3K-Akt、VEGF、TNF等信號通路。研究報道HIF-1 通路可以調(diào)控TNF-α炎癥因子，趕黃草可通過HIF-1 通路下調(diào)TNF-α 表達(dá)，抑制肝纖維化[16]。核心靶點中的HSP90AA1 是一種熱休克蛋白，熱休克蛋白具有分子伴侶活性，對于癌細(xì)胞的存活、增值、遷移及腫瘤血管的生成等功能至關(guān)重要，抑制HSP90AA1 表達(dá)，可以減少腫瘤細(xì)胞增殖，抑制核心靶點之一的VEGF 表達(dá)誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移，同時抑制腫瘤血管生成，降低肝癌病變風(fēng)險[17]。此外，核心靶點中的PIK3R、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 屬于PI3K 亞基，有文獻(xiàn)報道肝細(xì)胞癌中 Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子 8（Krüppelliketranscription factor 8，KLF8 ） 在人肝癌SMMC7721 細(xì)胞中也可能通過PI3K-Akt 信號通路誘導(dǎo)VEGFA 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤血管新生[18]。STAT3 是機(jī)體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和糖代謝等多種生物過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，在肝癌中會被過度激活，因此抑制STAT3 活性可抑制肝癌細(xì)胞增值[19]。SRC 是酪氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號傳導(dǎo)途徑，已有研究報道當(dāng)PKC-Pyk2/SRC 通路中的SRC 蛋白表達(dá)受到抑制，人源肝星狀細(xì)胞HSC-LX2 的增殖就會被阻止[20]。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道山柰酚、喬松素和槲皮素都對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝損傷有明顯的保護(hù)作用，喬松素保護(hù)機(jī)制可能是抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，山柰酚和槲皮素保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)控凋亡通路JNK 的表達(dá)水平有關(guān)[21-23]。槲皮素、沒食子酸和鞣花酸對CCl4所致小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)抗氧化損傷能力，降低TNF-α 炎癥因子水平有關(guān)[24-25]。且槲皮素還可以通過誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助因子1-α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α）表達(dá)，激活脂肪酸β 氧化、減輕氧化應(yīng)激以及抑制炎性反應(yīng)，發(fā)揮雌激素樣作用，最終改善肝細(xì)胞脂肪變性[26]；鞣花酸能夠通過抑制NF-κB/COX-2 炎癥通路活化，抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，改善AKT基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝病[27]。趕黃草酮A 可以抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 增殖，且對醋氨酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞HL7702 損傷具有保護(hù)作用[28-29]，趕黃草酮B 對H2O2和醋氨酚分別誘導(dǎo)的肝細(xì)胞LO2損傷都具有一定的保護(hù)作用[30]。趕黃草苷保肝作用未查到文獻(xiàn)報道，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究借助 UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 方法鑒定了趕黃草主要化學(xué)成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對接技術(shù)預(yù)測趕黃草保肝潛在作用靶點及通路，為闡明趕黃草保肝藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，及進(jìn)一步臨床應(yīng)用和機(jī)制研究提供實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突